蜂毒前溶血肽原基因的改造及其原核表达

为进一步探讨利用基因工程技术生产蜂毒肽的方法,根据大肠杆菌密码子偏好性、基因GC含量、合成蛋白加工需求等对蜂毒前溶血肽原基因序列进行改造,并利用人工化学合成方法完成改造后全基因的合成。构建蜂毒前溶血肽原与GST融合表达重组质粒pGEX-4T-1/PPMel,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后分别在20、37℃条件下经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并利用SDS-PAGE和Western Blot对产物进行检测。结果表明,表达体系成功表达了目的融合蛋白,在20℃条件下可获得可溶性表达产物,为进一步分离纯化目的蛋白及获得蜂毒肽提供了基础。     

蜂毒前溶血肽原重组质粒pET 28a( + ) PPMel的构建及分析

为了探讨利用基因工程技术生产蜂毒肽的方法,对重组质粒pGEX-4T-1/PPMel中的蜂毒前溶血肽原基因进行了更换载体处理,并重新构建了蜂毒前溶血肽原重组质粒pET-28a(+)-PPMel,为进一步转化大肠杆菌感受态细胞并进行蜂毒前溶血肽原基因的表达提供了材料。相关序列的生物信息学分析表明,新的重组质粒可表达含有106个氨基酸残基的融合蛋白,其中包括His标签。该融合蛋白没有信号肽序列,但存在跨膜区域,其在大肠杆菌中的表达需进一步探讨。     

二种胡蜂前溶血肽原基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

构建亚非马蜂和额斑黄胡蜂前溶血肽原基因的重组供体质粒pBacHT-PhPPM和pBacHT-VmPPM,转化到穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac中,得重组穿梭载体Bacmid-PhPPM和Bacmid-VmPPM,再用Lipofectin介导其DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn-5B1-4,最后观察细胞表达时相动态.经ELISA法证实,胞内表达产物具有良好的抗原性,证明二种重组病毒Bacmid-PhPPM和Bacmid-VmPPM已在昆虫细胞中得到了表达.     

大豆油体蛋白基因家族的生物信息学分析

油体蛋白(oleosin)是植物中的一类贮藏蛋白,主要作用是维持油体的稳定和贮藏脂质.通过生物信息学方法,对大豆油体蛋白(Glycine max oleosin,Gmole)基因家族中12个成员(编号Gmole1 ～ Gmole 12)的理化性质、结构特点等进行预测分析并建立进化树.结果 表明:12个成员分布在大豆的8...     

中华蜜蜂前溶血肽原基因在Tn-5B1-4细胞中的表达

构建中华蜜蜂前溶血肽原基因的重组供体质粒pBacHT—GFPTAccPPM，将其转化进入穿梭栽体Bacmid的受体茵DH10Bac中，得重组穿梭栽体Bacmid-GFPTAccPPM，再用Lipofectin介导其DNA转染粉纹夜蛾细胞系Tn-581-4，最后观察细胞表达时相动态。经ELISA法和荧光显微镜观察证实，胞内表达产物既能发射易于检测的绿色荧光，又具有良好的抗原性，证明重组病毒Bacmid-GFPTAccPPM已在昆虫细胞中得到了表达。     

椰子SUT基因家族的生物信息学及其表达分析

蔗糖转运蛋白是非常典型的跨膜转运蛋白,它在蔗糖的吸收和转运过程中发挥重要作用。目前对椰子蔗糖转运蛋白的功能和机制还不够了解,为深入探究椰子蔗糖转运蛋白家族(CnSUTs),通过生物信息学方法对CnSUTs的5个成员(编号CnSUT1～CnSUT5)进行综合性分析,主要涉及到蛋白理化性质、同源性等方面。结果表明:CnSUTs主要定位于质膜上,它属于典型的疏水性膜蛋白;这种蛋白存在GPH结构功能域,具有高度保守性;α-螺旋和无规卷曲是最为重要的二级结构元件,其三级结构非常类似。本研究为探究CnSUTs蛋白家族在高粱的蔗糖吸收及转运中的功能提供重要参考。     

水稻溶血磷脂酸酰基转移酶基因(LPAT)家族生物信息学分析及在籽粒油脂合成中的作用

【目的】挖掘水稻溶血磷脂酸酰基转移酶(Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT)基因家族成员信息,分析其生物信息学特征及在水稻籽粒油脂合成中的作用。【方法】通过生物信息学分析,对OsLPAT基因家族进行基因结构、系统进化树、组织表达谱以及激素和逆境表达谱等分析。利用比较代谢组和转录组学的方法,分析OsLPAT家族各成员在水稻籽粒油脂合成中的作用。【结果】水稻基因组中LPAT家族包含5个成员,分别命名为OsLPAT1～OsLPAT5。除OsLPAT1外,其他成员均含有4～6个外显子,且各成员均包含Acyltransferase Cterminus (PF01553)结构域;进化分析显示,LPAT基因在单子叶植物中较为保守;OsLPAT2的表达受多种逆境条件及激素诱导,OsLPAT3和OsLPAT5的表达受到脱落酸(Abscisic acid,ABA)的强烈诱导,而OsLPAT4则特异性地受到渗透胁迫的诱导;比较代谢组和转录组学分析显示,OsLPAT家族各成员分别在籽粒发育的不同阶段发挥功能,从而促进油脂(Triacylglycerol,TAG)...     

血浆中和肽素、N-末端脑钠肽前体水平对慢性心力衰竭患者生存质量的评估价值

目的 探讨血浆中和肽素、N-末端脑钠肽前体(NT-proBNP)水平在慢性心力衰竭患者预后及生存质量的预测价值.方法 检测460例慢性心力衰竭患者入院时血浆中和肽素及NT-proBNP水平,并分为A组220例(和肽素≥14.36pmol/L或NT-proBNP≥1923.90 ng/L)和B组240例(和肽素＜14.36 pmol/L且NT-proBNP＜ 1923.90 ng/L),比较两组患者出院后1a预后、生存质量、心功能指标差异.结果 入院时A组的心功能分级明显较B组差(P＜0.01).出院1a后B组的左室射血分数、左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、6 min步行距离均显著优于A组(P＜0.01),心理、生理、社会评分均显著高于A组(P.＜0.01),心衰复发率和心脏相关死亡率明显低于A组(P＜0.01或0.05).结论 慢性心力衰竭患者血浆中和肽素、NT-proBNP水平过高可能预示后期生存质量、心功能恢复较差.     

希金斯炭疽菌中NPFxD基序蛋白找寻及其生物信息学分析

希金斯炭疽菌是一种半活体营养型植物炭疽病原真菌,能够侵染多种十字花科植物引起的炭疽病,特别是引起蔬菜炭疽病的重要病原.胞吞在真菌侵染植物过程中发挥着重要作用,该作用一般同具有NPFxD基序的蛋白受体介导有关,然而,目前有关该炭疽菌中胞吞作用相关蛋白尚未明确.基于前人已报道的构巢曲霉中NPFxD蛋白序列,通过关键词搜索以...     

狂犬病病毒G蛋白昆虫细胞表达及其生物信息学分析

利用RT-PCR方法从SRV9株细胞毒基因组RNA扩增G蛋白基因,然后将其克隆到p MD18-T载体上,将得到的重组克隆质粒SRV9G-p MD18T进行PCR和测序鉴定。结果表明:克隆的基因全长为1 609 bp,阅读框正确;将此SRV9株G基因亚克隆到供体质粒p Fast Bac Dual后获得了重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual;进而将重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,经2次抗性、蓝白斑筛选及PCR分析后,获得重组穿梭质粒SRV9G-Bacmid;将其转染Sf9细胞48 h后,通过细胞形态学和重组杆状病毒负染电镜观察显示,杆状病毒转染成功;通过Western blot检测显示,Sf9细胞成功表达了SRV9 G蛋白。随后,利用Ex PASy服务器上的在线分析工具和生物信息学分析软件DNAStar对G蛋白的基本性质进行了分析。试验采用昆虫细胞Bac-toBac杆状病毒表达系统,成功表达出G蛋白,并对其进行了生物信息学分析,为蛋白纯化及狂犬病诊断试剂盒的进一步研制奠定了基础。     

PRRSV JX0708株结构蛋白基因的克隆及其生物信息学分析

根据GenBank中登录的美洲型PRRSV JXA1株基因组序列设计合成了4对引物,应用RT-PCR技术对PRRSV JX0708株结构蛋白基因进行扩增、克隆和测序,将测序结果应用Blast和DNAStar软件进行分析,并与国内外分离株进行核苷酸序列以及推导的氨基酸序列同源性比较.结果表明:PRRSV JX0708株结构蛋白基因长约3 186bp,分为ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7共6个基因区;与国内分离的高致病性PRRSV美洲型毒株HuN、GD、JXA1、LN和普通毒株CH-1a以及经典毒株VR-2332和疫苗毒株pMLV的核苷酸及其推导的氨基酸同源性分别为88.0%～100.0%和83.5%～100.0%;而与欧洲型经典毒株LV和Euro-1的同源性差异显著,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为64.0%～69.7%和53.3%～79.9%.遗传进化分析表明,PRRSV JX0708株在基因型上属于美洲型,同时美洲型PRRSV的变异存在某种地域和时间跨度上的相关性,但每个结构蛋白基因的变异并不严格遵从这种规律,而有所差异.     

马泰勒虫RON2基因的原核表达及生物信息学分析

【目的】对马泰勒虫棒状体颈部蛋白2（RON2）进行原核表达和生物信息学分析,为后续蛋白互作试验提供材料基础。【方法】以马泰勒虫新疆分离株为研究对象,克隆其RON2基因,并与GenBank中已知的马泰勒虫美国WA株基因组数据和顶复门原虫RON2基因序列本地数据库进行BLAST比对,确定其进化关系。构建重组表达载体pET-32a-RON2,融合表达重组蛋白,对RON2基因编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】马泰勒虫新疆株RON2基因（NCBI登录号MT939257）长3 920 bp,高度保守,与顶复门原虫RON2基因核苷酸和氨基酸序列的相似性分别为31.2%～82.7%和23.8%～79.5%。成功构建原核表达重组质粒,获得的RON2融合重组蛋白分子质量为26 ku,为包涵体蛋白。生物信息学分析表明,RON2蛋白是一种碱性、不稳定亲水性跨膜蛋白,二级结构以α螺旋为主,亲水性较差,抗原性较弱,与其他顶复门原虫RON2蛋白具有相似的三级空间特殊结构和氨基酸序列,且可能与其他入侵蛋白存在相互作用关系。【结论】获得马泰勒虫新疆株RON2基因,诱导表达获得部分RON2融合重组蛋白,该蛋白存在与其他入侵相关蛋白相互作用的位点,可能参与了虫体入侵宿主细胞的过程。     

鸭瘟病毒TK基因及其编码蛋白的生物信息学分析

运用生物信息学方法,对鸭瘟病毒TK基因的基本元件和TK蛋白的理化性质、结构、功能进行分析。明确了TK基因启动子、转录起始位点、编码区P、olyA的位置;发现TK蛋白的二级结构以α螺旋为主,属于混合型蛋白,在结构和功能上与疱疹病毒胸苷激酶高度相似。生物信息学分析结果说明,鸭瘟病毒TK蛋白具有疱疹病毒胸苷激酶的活性,鸭瘟病毒TK基因可能为鸭瘟病毒的非必需毒力基因。     

前纳豆激酶原基因温控型表达载体的构建及其表达条件的研究

纳豆激酶(nattokinase,简称NK)是一种枯草芽孢杆菌蛋白激酶,该酶具有强烈溶栓活性.本研究从枯草芽胞杆菌中分离纯化得到基因组DNA作为模板,通过PCR扩增前纳豆激酶原基因,将其克隆到质粒pUC19中,构建重组克隆质粒pNK并转化大肠杆菌DH5α,测序结果表明,所克隆片段全长1152bp,与GenBank中已报道序列同源性达100％.将目的基因片段与表达载体pBV220连接,构建重组表达质粒pBNK,转化大肠杆菌HB101.采用不同诱导时间、不同诱导温度(40℃、42℃和44℃)诱导表达,结果发现转化菌pBNK6-HB101在LB培养基中经30℃培养,42℃诱导表达7小时目的产物表达量达到最大,约占菌体总蛋白的25.35％,转化菌pBNK6-HB101在不同的培养基(LB和TB)中培养,无明显差异.     

金黄色葡萄球菌纤连结合蛋白信号肽的生物信息学分析及其真核分泌表达

参考GenBank中收录的金黄色葡萄球菌FnBPA(fibronectin-binding protein A)基因和牛IFN-γ序列进行了信号肽序列的分析。分析结果显示,牛IFN-γ信号肽序列相关指标优于金黄色葡萄球菌FnBPA基因自身的信号肽序列。在此基础上利用重叠延伸PCR法以牛IFN-γ信号肽序列取代金黄色葡萄球菌FnBPA基因的信号肽序列,并构建分泌型真核表达载体PV-SFn。该重组表达载体转染BHK-21细胞后经ELISA及Western-blot检测证实可有效分泌表达目的蛋白。     

苹果茎沟病毒外壳蛋白基因的克隆、表达及其生物信息学分析

从中国苹果寄主上分离苹果茎沟病毒(Apple Stem Grooving Virus,ASGV),克隆并表达外壳蛋白(Coat Protein, CP)基因,并进行生物信息学分析。利用RT-PCR从苹果寄主上克隆了苹果茎沟病毒外壳蛋白基因,序列测定后构建了原核表达载体pET30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia coli)进行原核表达。分析比较苹果茎沟病毒外壳蛋白基因核酸序列,分析并预测苹果茎沟病毒外壳蛋白的结构和性质。克隆,表达了苹果茎沟病毒外壳蛋白基因。序列分析显示本研究ASGV CP开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)全长714个核苷酸,与其他分离物CP基因核酸同源率为88.80%～91.90%,与来自日本苹果的P-209进化关系最近。ASGV CP是由237个氨基酸残基组成的27.13 kD蛋白,等电点PI为7.67的疏水性,非跨膜蛋白。二级结构由7个α-螺旋,5个β-片层和无规则卷曲构成。三级结构由于缺少同源蛋白而无法预测。本研究成功诱导表达了ASGV-CP蛋白,分析了ASGV-CP的核酸序列和进化关系,蛋白性质和蛋白结构,为进一步的功能研究和检测应用奠定了基础。     

不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点筛选及其生物信息学分析

[目的]揭示刺豚鼠信号蛋白基因(ASIP)SNP位点突变与不同鸡种羽色差异形成机制的关联性,筛选出与鸡种羽色相关的辅助育种分子标记.[方法]参考NCBI已公布的红色原鸡ASIP基因序列(登录号NC_006107.5),运用Primer Premier 5.0设计特异性引物,以罗曼蛋鸡、泰和乌骨鸡、兴义矮脚鸡白羽系、赤水乌骨鸡、贵州黄鸡和瑶山鸡为研究对象,通过DNA混合池及PCR直接测序法筛选不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点;估算各SNP位点等位基因频率后,使用RNAfold、NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,探究不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点突变对基因mRNA二级结构、ASIP蛋白翻译后修饰位点及其二、三级结构的影响.[结果]从6个鸡种ASIP基因中检测到7个SNPs位点,分别为Exon-2-G17C、Exon-2-T168C、Exon-2-C3032T、Exon-2-T3203G、Exon-2-G3287A、Exon-2-G3313T和Exon-2-C3350T.其中,Exon-2-T3203G只出现在罗曼蛋鸡上,Exon-2-G3287A只出现在瑶山鸡上.Exon-2-T168C只出现在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系且位于编码区,该位点突变导致编码氨基酸改变[苏氨酸(Thr)→甲硫氨酸(Met)],且能导致ASIP基因mRNA二级结构改变,最小自由能增加,稳定性降低.Exon-2-T168C位点突变还导致ASIP蛋白激酶磷酸化位点数量和位置发生改变,但糖基化位点未发生改变;Exon-2-T168C位点突变后ASIP蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角和延伸链的占比增加,而无规则卷曲占比降低,且蛋白三级结构预测结果与二级结构预测结果一致.[结论]在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系ASIP基因上检测到Exon-2-T168C位点,且该位点突变能引起ASIP基因mRNA二级结构、蛋白激酶磷酸化位点数量和位置及ASIP蛋白二、三级结构均发生改变,但并不是影响贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系羽色差异的内在机制.     

牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表达蛋白生物信息学分析

通过RT-PCR技术克隆牦牛SLC25A6基因的cDNA序列,并利用DNAMAN、MAGA 6、SWISS-MODEL、ExPASy等生物信息学软件系统对其进行分析。结果表明,扩增出的牦牛SLC25A6基因的编码区长897 bp,编码298个氨基酸;与普通牛、绵羊和人的相应基因核苷酸序列进行比对,序列一致性分别为99.33%、98.22%、91.86%;其编码蛋白分子量为32.821 ku,含多个修饰位点。     

蛙皮素样肽家族及其受体氨基酸序列信息学比较分析

【目的】研究反刍动物蛙皮素样肽家族多肽及其受体的保守性。为不同动物,特别是反刍动物这2种蛙皮素样多肽及其受体蛋白抗原设计和活性多肽筛选等研究提供参考。【方法】采用生物信息分析学的方法,通过UniProt数据库比较牛的蛙皮素样肽家族胃泌素释放肽(Gastrin-releasing peptide, GRP)和神经介素B(Neuromedin B, NMB)2种多肽及其特异性受体GRP-R和NMB-R与其他动物氨基酸序列的差异性。【结果】13种动物成熟GRP多肽C-端的8个氨基酸序列完全相同,牛GRP氨基酸序列与绵羊、猪和豚鼠最高,分别为88.7%、77.8%和77.8%,与其他动物相似性低于74.1%。10种动物成熟NMB多肽C-端10个氨基酸序列完全相同。牛GRP-R与狗、马和猪等相似性最高,分别为96.1%、94.3%和94.0%,牛NMB-R与猪、人和马相似性最高,分别为92.3%、91.5%和91.0%;牛GRP-R与NMB-R相似性仅为62.2%。【结论】GRP和NMB的C-端氨基酸序列在不同动物之间均具有高度的保守性,而N-端为变化区域,且GRP-R和NMB-R氨基酸序列在动物之间保守性较高。