选择标记基因剔除及其在转基因棉花中的应用

转基因植物中选择标记基因可能对生物安全和环境安全带来的不利影响,有必要进行剔除。评述了剔除选择标记基因的几种方法,并设计了利用双T DNA共转化和位点特异性重组的方法初步建立培育无选择标记转基因棉花的体系。     

转基因植物中选择标记基因的控制策略

近年来,转基因植物中的选择标记的安全性问题引起公众关注,如何消除选择标记,培育无选择标记基因的转基因植物已成为基因工程研究的热点。本文系统介绍了通过共转化、转座子、染色体内重组和位点特异性重组消除选择标记及用正向选择标记基因代替负向选择标记基因手段培育无选择标记的转基因植物的发展策略。     

共转化法删除转基因植物筛选标记基因的研究

筛选标记基因因其在植物基因工程中的重要作用而得到了普遍应用,目前使用的筛选标记主要是抗生素抗性基因或抗除草剂基因,然而一旦获得转基因植株,它的存在不但没有必要,而且还引起人们的种种顾虑。因此如何从转基因植物中删除筛选标记基因成为植物基因工程研究的重要内容。目前已有多个系统用来删除选择标记基因,从而获得无筛选标记基因的转基因植株。其中共转化法操作简便因而得到了广泛的应用。本文综述了共转化法研究的最新进展并对其实际应用的可行性进行探讨。     

转基因林木中安全标记基因的研究进展

近年来,林木转基因研究进展迅速。但是,由于基因工程技术中使用选择标记基因可能对生态、环境、非靶标生物等带来危害,标记基因的安全性问题已越来越受到人们的关注。据报道在基因工程研究特别是植物转基因研究中使用安全标记基因遗传转化系统方面已作了大量尝试。本文主要综述林木植物转基因研究中应用安全标记基因遗传转化系统的研究现状,重点介绍了正选择标记的使用,可重组系统去除标记基因,利用位点特异性重组去除叶绿体DNA中标记基因的叶绿体遗传转化表达载体系统,及未来基于高转化率和大量快捷PCR筛选的完全无选择标记基因的遗传转化体系等研究进展与应用前景。     

转基因植物选择标记基因删除技术

本文系统地介绍了4种转基因植物选择标记基因删除技术——(共转化法(co-transformation)、转座子法(transposable element)、位点特异性重组法(site-specific recombination)、染色体内同源重组法(intrachromosomal recombination)的基本原理和操作过程,并分析了各自的特点和实际应用情况,比较了它们的优缺点,展望了删除技术的前景。删除技术的发展,无论是对于转基因作物的安全性和商业化,还是转基因技术的发展和完善都有积极的作用。     

利用共转化方法创制携带Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记转基因水稻

水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。     

转基因农作物及其标记基因的消除

生物技术的发展为植物遗传改良开辟了一条新途径.在基因转移过程中,人们常常使用标记基因来筛选转化细胞或组织.常用的筛选标记基因尤其是抗生素抗性基因的使用往往对环境及作物体的生长发育产生不良影响,且影响基因多重转化.为了消除这些弊端,一种全新的发展策略即获取无选择标记的转基因作物应运而生.     

芸芥抗菌核病相关基因的分子标记

芸芥属于十字花科芝麻菜属植物,在中国分布广泛.长期以来,国内外学者从植物学特征、经济性状和抗逆性等方面对芸芥品种资源进行了研究工作[1~4];李方球研究了芸芥的抗油菜菌核病[5],但从分子水平上的研究还较少.目前,转基因技术和分子标记辅助选择为高效育种展示了广阔的前景.但应用这2项技术的前提是必须首先获得优良基因克隆或优良基因紧密连锁的分子标记.本文利用RAPD技术,通过对芸芥抗病相关基因的遗传分析和分子标记,阐明其抗病相关基因的遗传,并提供可利用的分子标记,以便为芸芥抗菌核病种质鉴定和芸芥抗菌核病的分子标记辅助选择提供准确快速的鉴定方法.     

基因信息在标记辅助轮回选择中的作用：一种模拟评价

人们期望基因组学和后基因组学能揭示大多数植物QTL。事先知道QTL位点就能在标记辅助轮回选择中进行应用。本文的研究目的一是弄清事先知道QTL位点是否在标记辅助轮回选择中具有优势；二是弄清事先了解与QTL连锁标记相对的QTL本身是否在标记辅助轮回选择中具有优势。     

可去除选择标记的转Bt基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。     

反义外壳蛋白基因介导的抗SCMV转基因玉米研究

玉米矮花叶病（MDM）是一种世界性病害，在我国主要由甘蔗花叶病毒(SCMV)所致。为探索一条高效、安全的抗SCMV转基因途径，构建了无标记基因的SCMV反义外壳蛋白基因（cp）表达载体pACP。通过冻融法将该载体与抗除草剂标记基因(bar)载体分别导入农杆菌LBA4404,然后共转化玉米自交系综3的幼胚。通过除草剂梯度筛选，从抗性愈伤组织分化获得了35株再生苗。PCR检测证明，其中26株带有抗除草剂标记基因（bar），14株带有SCMV反义cp基因。这14株带有目的基因的玉米植株自交，其种子在田间种植成株行（T₁代）。玉米T₁代幼苗人工接种SCMV，筛选出2个抗病株率高于70%的株行。ELISA检测表明，抗病株SCMV含量极低，抗性达高抗水平。PCR检测表明，抗病性是反义cp基因作用的结果，并且获得了2株cp基因阳性而标记基因阴性的抗病株。     

基于Cre/loxP系统的无筛选标记转耐低磷转录因子GmPTF1大豆种质创制与分析

筛选标记基因在转基因植物应用中存在一定潜在安全风险,在转基因植物改良中如何合理消除该基因非常必要。转录因子PTF1具有改善植物在低磷胁迫下吸收磷效率的作用。本研究用根癌农杆菌介导法将Cre/loxPGmPTF1导入大豆品种豫豆22,利用β-雌二醇诱导Cre/loxP系统删除筛选标记基因,获得了无筛选标记的转GmPTF1基因大豆。用PCR法扩增删除标记基因后的重组序列并测序显示,筛选标记基因在大豆基因组中已经被完全删除,重组序列中目的基因序列正确并保持了正确开放读码框;loxP位点重组出现一种新的拼接类型,重组后2个loxP序列全部缺失,新重组拼接位点长38 bp,与NCBI数据库的其他序列均无同源性,并且重组涉及2个loxP位点的外侧翼序列,造成Cre/loxP盒上游loxP和下游loxP外侧翼序列部分缺失。经过RT-PCR和Western杂交验证显示无筛选标记转基因大豆植株中GmPTF1能够正常转录和翻译,在根系、叶片及茎中的GmPTF1蛋白表达量均高于野生型对照,而在种子中与对照无显著差异。沙培试验表明,在低磷条件下无筛选标记转基因大豆苗期根系指标、生物干重、叶绿素含量和磷含量均显著高于野生型对照,而丙二醛含量低于对照。利用Cre/loxP重组系统可以有效删除转基因大豆中的筛选标记基因。     

转sbk和sck基因提高水稻Dular的抗虫能力

将抗病虫基因与广亲和基因聚合在一起可为两系杂交稻更广泛的应用奠定基础。本研究将去选择标记的包含2个抗虫基因(sbk和sck)的质粒载体(pCDMARUBA-Hyg)采用根癌农杆菌介导法转入兼抗水稻条纹叶枯病的广亲和水稻品种Dular中。通过常规PCR检测,获得18份不具有选择标记的转基因阳性植株,Southern杂交分析结果表明其中15份为单拷贝插入,对这15份单拷贝转基因植株进行RT-PCR分析,结果抗虫基因都能正常表达。人工接虫鉴定结果表明,转入抗虫基因显著提高了水稻品种Dular抗螟虫的能力;同时利用Dular本身的广亲和基因(S5n)标记和与抗条纹叶枯病基因(qSTV-11b和qSTV-11c)的连锁标记进行分子检测,其结果表明这15份单拷贝转基因植株都具有广亲和与抗条纹基因的特征带;与不同籼稻和粳稻配组杂种F1的结实率和条纹叶枯病在田间自然发病状况下的调查结果表明,这些单拷贝植株不但具有广亲和与抗水稻条纹叶枯病的能力,而且其抗螟虫能力显著提高。     

含双边界序列植物双价表达载体的构建

转基因植物的安全性是基因工程改良作物的一个重要问题.构建含双边界序列（双T-DNA区）载体,将选择标记基因和目标外源基因分开在不同的T-DNA区,通过转基因植株有性杂交及后代分离,可在转基因后代中获得无选择标记的转基因安全植株.将2个外源基因置于同一载体上,可以提高其共转化的效率.本研究构建了1个中间载体pAHC17-PTA和1个含双边界序列的植物双价表达载体pDB13PS.pAHC17-PTA含有由Ubiquitin启动子引导的具有抗虫效果的半夏凝集素基因（PTA）.pDB13PS含2个独立的T-DNA区,在其中一个T-DNA区,含两个目的基因的完整的表达盒,一个是由Ubiquitin启动子引导的半夏凝集素基因（PTA）,另一个是由水稻胚乳特异表达启动子（Glutelin-B1 promoter）驱动的马铃薯高赖氨酸蛋白基因的cDNA（SB401）.pDB13PS的成功构建,为提高PTA和SB401的共转化效率和获得无选择标记的转基因后代植株奠定了基础.     

抗甘蔗花叶病毒的无标记反向重复转基因玉米

构建了无标记基因的源自玉米矮花叶病的主要病原——甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus, SCMV)复制酶基因的反向重复序列表达载体,通过农杆菌介导法以该表达载体和除草剂标记基因表达载体共转化玉米自交系综3的幼胚,用除草剂梯度筛选,获得了可育的再生株。对T₁和T₂代群体作PCR和DNA点杂交,结合温室和田间人工接种病毒进行抗病性鉴定,获得了比较稳定的对SCMV高抗的无标记转基因玉米株系。     

杨树无选择标记转基因体系的建立

本研究选择美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨(Populus×euramericana cV.'Nanlin895')为材料,利用Cre/loxP位点特异性重组系统(pX6-GFP载体)进行遗传转化研究.经不同浓度β-雌二醇诱导处理,分别利用农杆菌侵染叶盘分化不定芽至完整植株过程和利用已获得的抗性植株诱导愈伤至植株再生...     

Particle-Bombardment-Mediated Co-Transformation of Maize with a Lysine Rich Protein Gene (sb401) from potato

Summary Little work has been reported on genetic transformation with maize inbred lines, especially elite inbred lines used in breeding. In this work, 7 self-pollinated inbred lines and 4 hybrid lines have been screened. The results revealed that calli derived from immature embryos from two inbred lines X333 and X301 were compact, hyperhydric and unsuitable for transformation, but the calli induced from other inbred lines and all the hybrid lines were friable and yellow and could be used for genetic transformation. The sb401 gene isolated from potato (Solanum berthaultii) encodes a protein with a high lysine content. Maize calli from 5 self-pollinated inbred lines and 4 hybrid lines were transformed using particle-bombardment with different plasmids to simultaneously introduce the sb401 lysine rich gene and the selectable gene hpt respectively. Two hundred and sixty-eight regenerated plants were obtained from these genotypes. Co-insertion was confirmed in 29 regenerated plants by PCR and Southern blot analysis. Transgene segregation of the R1 plants was observed and one marker-free transgenic maize line was recovered. Analysis of the crude protein content in mature seeds of R1 transgenic plants also showed an increase from 36.8% to 48.2%. This study thus provides a workable system for generating transgenic maize free from selectable marker genes and generates valuable resources for obtaining marker free transgenic maize with a high-lysine protein content.     

抗虫转基因植物鉴定方法的研究进展

农作物受害虫侵害严重,给农业生产带来巨大损失,喷施化学杀虫剂使害虫产生抗药性,且污染环境。近年来,转基因技术研究不断深入,抗虫转化研究工作进展迅速。鉴定转基因植物的方法技术有很多种,在此主要阐述了利用标记基因进行鉴定,分子标记,免役技术三大类方法,并对其原理分别进行了简单介绍。