苹果IRAP技术体系的建立及优化

通过苹果逆转座子长末端重复序列(LTR)保守区域设计引物,对影响苹果IRAP反应的重要因素进行了研究,建立并优化了苹果IRAP分子标记技术体系。优化的苹果IRAP分子标记体系为:25μL反应体系中,模板DNA50ng、Mg2+2.5mmol·L-1、dNTPs0.2mmol·L-1、10×buffer2.5mmol·L-1、TaqDNA聚合酶1.0U、引物0.4μmol·L-1。该体系在所试苹果品种中均获得了较理想的扩增效果,并能鉴定部分芽变品种。     

茄子ISSR-PCR反应体系优化及验证

以茄子为试验材料,采用改良CTAB法提取茄子嫩叶总DNA,结合单因素设计和正交设计L9(34)的优点,探讨Mg2+、dNTP、引物及TaqDNA聚合酶等因素对茄子ISSR-PCR反应体系的影响,利用16份广西茄子主要栽培品种对最优处理组合进行验证。结果表明,在25μL反应体系中,含2.5μL10×buffer、2.0～3.0mmol·L-1Mg2+、0.32～0.36mmol·L-1dNTP、0.4μmol·L-1引物、50ng模板DNA、0.6UTaqDNA聚合酶等成分,可以获得比较稳定、清晰和丰富的条带。     

桦褐孔菌ISSR-PCR反应体系优化与建立

采用改良CTAB法提取了桦褐孔菌总DNA,确定ISSR最适25 μL反应体系为模板DNA浓度15 ng·μL-1,dNTPs 浓度150 μmol· L-1,引物浓度25 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶浓度2.0 U,Mg2+浓度1.4 mmol· L-1,10×buffer 2.5 μL,其余用ddH2O补足;确定ISSR扩增程序为:94℃预变性5 min,35个循环:94℃变性1 min、45℃～51℃退火1 min(退火温度因不同引物而定)、72℃延伸1 min,最后72℃延伸5 min,4℃保存.筛选出16条ISSR引物,并成功应用引物UBC842完成了21株桦褐孔菌的ISSR-PCR反应.     

大白菜KASP反应体系的优化与建立

以大白菜基因组DNA为模板,对影响竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive allele specific PCR,KASP）的反应体积、引物浓度和DNA模板用量等3个参数进行优化,建立了适用于大白菜的KASP反应体系。96孔模块最佳反应体系中,总反应体积为8 μL,其中模板DNA（60 ~ 80 ng · μL-1）1 μL,KASP Master mix（2×）4 μL,引物混合物（50 μmol · L-1）0.14 μL,ddH2O 3 μL。384孔模块最佳反应体系中,总反应体积为4 μL,其中模板DNA（60 ~ 80 ng · μL-1）1 μL,KASP Master mix（2×）2 μL,引物混合物（50 μmol · L-1）0.07 μL,ddH2O 1 μL。利用不同引物和不同的大白菜材料对优化的反应体系进行验证,均获得了较好的KASP-SNP分型,验证了该优化体系的稳定性。该反应体系可以用于大白菜遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱构建等遗传学研究。     

平菇ISSR-PCR反应体系影响因素研究

为提高ISSR分析结果的可靠性和可重复性,以平菇黑丰268为材料对反应体系进行优化,建立平菇ISSR-PCR反应体系.实验结果表明,平菇ISSR-PCR最优体系为体积20 μL,其中Mg<'2+>浓度为1.2 mmol·L-1,模板浓度为50 ng,引物浓度为0.6μmol·L-1,dNTPs浓度为200μmol·L-1,Taq酶浓度为1.2 U·20-1·μL-1,1×PCR Buffer.     

内蒙古红干椒RAPD反应体系的正交优化

以内蒙古开鲁县12个红干椒品种为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,通过采用正交优化设计方法,对红干椒RAPD反应条件进行了优化.试验结果表明,最佳红干椒RAPD的反应体系(25 μL)为:PCR染料2.0μL,MgCl2 2.0 mmol·L-1,dNTPs 0.6 mmol·L-1,引物0.5μmlo·L-1,DNA模125 ng,Taq酶1.25 U,超纯水14.9μL;适宜扩增条件为:94℃预变性4 min,40个PCR循环94℃变性1 min,37℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,72℃复延伸5 min,4℃保存.     

内蒙古红干椒RAPD反应体系的正交优化

以内蒙古开鲁县12个红干椒品种为材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,通过采用正交优化设计方法,对红干椒RAPD反应条件进行了优化。试验结果表明,最佳红干椒RAPD的反应体系(25μL)为:PCR染料2.0μL,MgCl22.0 mmol·L-1,dNTPs0.6 mmol·L-1,引物0.5μmol·L-1,DNA模板125ng,Taq酶1.25U,超纯水14.9μL;适宜扩增条件为:94℃预变性4min,40个PCR循环94℃变性1min,37℃退火1min,72℃延伸1.5min,72℃复延伸5min,4℃保存。     

SRAP在西藏木瓜属种质资源研究中的应用

利用正交设计,首次对西藏木瓜属植物SRAP-PCR反应体系中的引物浓度、Taq酶、dNTPs、模板DNA、Mg2+在4个水平上进行优化,建立了木瓜属植物SRAP-PCR反应的最佳体系:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,引物浓度0.4μmol·L-1,Taq酶1.0U,dNTPs浓度0.3mmol·L-1,模板DNA70ng,Mg2+浓度2.0mmol·L-1。用引物组合M1E7和M3E18检验上述优化体系,结果显示该体系具有较高稳定性。在此基础上,用筛选的28对SRAP引物组合对21份西藏野生木瓜资源总DNA进行SRAP-PCR扩增,共检测出420个位点,其中多态性位点数363个,多态性位点百分率为86.67%。为此,SRAP分子标记可用于木瓜属植物遗传多样性的研究。     

多倍体枇杷SCoT分析体系的建立与优化

以软条白沙枇杷三倍体株系为试材,采用L25(56)正交设计方法,对影响枇杷ScoT-PCR反应的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及模板DNA用量等因素进行优化筛选,并对最适退火温度进行了探讨.建立了适于不同倍性枇杷分析的ScoT-PCR扩增体系,即20μL的优化体系中含有:Mg2+15mmo1·L-1,...     

基因枪介导红叶石楠遗传转化因素分析

以红叶石楠（Photinia fraseri）的胚性愈伤组织为受体材料,利用基因枪法导入外源抗寒基因 rd29A,以期建立基因枪转化红叶石楠的技术体系。结果表明,基因枪转化红叶石楠的最佳组合条件为：胚性愈伤组织在诱导培养基 MS + 6-BA 2.0 mg ·L-1+ NAA 5.0 mg ·L-1+ 2,4-D 0.5 mg ·L-1+ 琼脂 5.0g ·L-1+ 蔗糖 20 g ·L-1里,用 0.3 mol ·L-1甘露醇处理 15 ~ 16 h;基因枪轰击时添加 12.5 mol ·L-1氯化钙50 μL+0.1 mol ·L-1亚精胺 50 μL,每枪含金粉 300 μg + 质粒 DNA3.0 μg,轰击距离 9 cm,轰击压力 1 100psi,轰击次数 1 次。经多次筛选获得了 6 株转基因植株,转化植株经 PCR 检测和 Southern 分析,证实了rd29A 已经整合到红叶石楠基因组中。     

蜡梅ISSR反应体系的优化

通过不同浓度Mg2 、dNTP、模板DNA、引物的组合试验、及不同浓度引物、Taq DNA聚合酶的单因素试验,筛选蜡梅最佳ISSR反应体系为:每20μL中含1×PCR buffer、2.5 mmol·L-1 MgCl2、0.2 mmol·L-1 dNTP、0.3μmol·L-1引物、30ng模板DNA、1U TaqDNA聚合酶;同时通过梯度PCR试验确定了不同引物的适宜退火温度.     

利用正交设计优化番茄SRAP-PCR反应体系

以番茄耐低温材料抗寒0号和不耐低温番青的F2为材料,利用正交试验设计对SRAP-PCR反应体系中的5因素(模板DNA、引物浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶)在4个水平上进行正交优化试验.结果表明:各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为:引物＞Taq DNA聚合酶＞dNTPs＞模板DNA＞Mg2+.建立番茄耐低温SRAP-PCR的20 μL最佳反应体系为:模板DNA为15 ng、引物浓度0.75 μmol·L-1、Mg2+浓度2.0 mmol·L-1、dNTPs浓度0.125 mmol·L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U.     

适合虫草素积累的蛹虫草液体培养条件的优化

为了探索蛹虫草液体发酵中适合虫草素积累的培养基和发酵培养条件,以半定量薄层色谱法为检测手段,以虫草素含量为指标,通过单因素试验及正交试验优选的方法,最终优选出的培养基配方为蛋白胨15 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、磷酸二氢钾1 g·L-1、七水合硫酸镁0.5 g·L-1、维生素B110 mg·L-1、荼乙酸2 mg·L-1.优选出的培养条件为发酵液pH7,培养温度25℃,光照时间12h.     

肉桂精油结合1-MCP对香菇采后褐变和感官品质的影响

以‘808’香菇为试材,研究了1-MCP处理、肉桂精油结合1-MCP处理对香菇采后褐变和感官品质的影响。结果表明:随着贮藏时间的延长,对照组(未处理)香菇感官品质下降,表面L*值降低、褐变严重,开伞度增加;从不同浓度1-MCP处理的保鲜效果来看,与对照(未处理)、0.5 mg·L-1和10.0 mg·L-1 1-MCP相比,2.0 mg·L-1 1-MCP处理保鲜效果最好,菇体开伞少,质地硬度大、色泽好;从肉桂精油结合1-MCP处理来看,以5μL·L-1肉桂精油结合2.0 mg·L-1的1-MCP处理效果最好,延迟了香菇褐变和开伞的发生,维持了香菇表面较高的L*值高,感官得分最高。     

苹果愈伤组织SSR-PCR反应体系优化

以"嘎啦"苹果组培苗叶片诱导的愈伤组织作为DNA模板提取材料,采用正交设计,摸索了SSR反应体系中Mg~(2+)、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA、dNTP的最适浓度,可为苹果愈伤组织的遗传变异研究奠定基础。结果表明:各因素不同水平变化对反应体系的影响为Taq DNA聚合酶dNTP用量Mg~(2+)用量引物用量=模板DNA浓度。确立了苹果愈伤组织SSR-PCR最佳反应体系总体积25μL,其中4μL 25mmol·L~(-1) Mg~(2+),0.25μL 5U·μL~(-1) Taq DNA聚合酶,3μL 0.01mmol·L~(-1) SSR引物,1μL 30ng·μL~(-1)模板DNA,4μL 2.5mmol·L~(-1)dNTP,2.5μL 10×PCR Buffer,10.25μL超纯水。     

辣椒SSR反应体系的优化

本试验研究了辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,同时进行了退火温度梯度和循环次数试验。优化后的反应体系为:总体积20μL,1.5μL模板DNA(25ng/μL)、1U Taq酶、0.375μmol.L-1引物、1.875mmol.L-1Mg2 、0.2mmol.L-1dNTPs、1XPCR buffer。扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性45s,58℃(以SSR005为例)退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后一个循环延伸增加为8min,4℃保存至电泳。     

华东葡萄广西-2花药胚状体诱导与再生植株的研究

为了提供葡萄转抗病基因功能验证及遗传转化研究的再生技术体系,以中国野生华东葡萄(V.pseudoretic-ulata)感白粉病株系广西-2的花药为试材,进行了体细胞胚诱导与再生体系的建立,并探讨了次生胚的诱导与畸形萌发胚状体正常成苗的方法。结果表明,广西-2花药在B5+6-BA4.0mg·L-1+2,4-D0.7mg·L-1+CH1.0g·L-1+PVP1.0g·L-1+蔗糖30.0g·L-1培养基上继代3个月,可诱导胚性愈伤组织产生;B5+6-BA4.0mg·L-1+CH1.0g·L-1+PVP1.0g·L-1+蔗糖15.0g·L-1培养基有利于胚状体形成;胚状体在1/2B5+CH1.0g·L-1+PVP1.0g·L-1+蔗糖15.0g·L-1的液体培养基比相同成分固体培养基中早萌发14d左右;已萌发胚状体在WPM+IBA0.15mg·L-1+AC0.5g·L-1+蔗糖15.0g·L-1培养基上可以生根成苗;MS+6-BA1.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30.0g·L-1培养基有利于畸形萌发胚状体正常成苗。发育早期胚状体在B5+6-BA1.0mg·L-1+2,4-D0.5mg·L-1+CH1.0g·L-1+PVP1.0g·L-1+蔗糖30.0g·L-1培养基上可形成次生胚。     

松针在暗褐网柄牛肝菌母种配方优化中的应用

为优化暗褐网柄牛肝菌母种配方,合理利用松针资源,以暗褐网柄牛肝菌为试验材料,松针浸出物为主要添加物之一,采用单因素试验和正交试验结合的方法,筛选出暗褐网柄牛肝菌的最佳母种培养基.结果表明,最佳培养基配方为松针浸出液25 g·L-1、葡萄糖10 g·L-1、马铃薯100 g·L-1、蛋白胨2 g·L-1、琼脂粉16 g·...     

食用百合试管苗缓慢生长保存的研究

为了建立食用百合种质资源缓慢生长保存体系,将扩繁培养后得到的试管苗接种到12种不同培养基中,10℃和25℃下分别保存6个月,观察不同处理试管苗生长情况。结果表明:低浓度甘露醇对百合试管苗生长的抑制效果差,而高浓度甘露醇严重影响其生长势,缓慢生长保存的最适浓度为20g·L-1;蔗糖对百合试管苗的生长有抑制作用,适宜浓度为60g·L-1;20g·L-1甘露醇+60g·L-1蔗糖处理的百合试管苗存活率均达100%,且有鳞茎形成,保存效果最好。10℃保存的试管苗生长缓慢,有利于鳞茎形成,保存至6个月时不需要继代培养;25℃保存试管苗的鳞茎形成率低,培养基损失量高,必须继代才能继续保存。     

猕猴桃SRAP-PCR体系的建立及品种资源亲缘关系研究

以猕猴桃属（Actinidia Lindl.）不同种幼嫩叶片为材料,建立了基因组DNA提取的改良SDS法,在此基础上采用正交试验设计和单因素分析相结合的方法,建立了适合猕猴桃SRAP分析的优化体系,即在20 μL总的反应体系中包括：DNA（40 ng ? μL-1）1 μL、Taq DNA酶（5 U ? μL-1）0.2 μL、dNTPs（2.5 mmol ? L-1) 1.4 μL、引物（10 μmol ? L-1）各1.5 μL、Mg2+（25 mmol ? L-1）2.0 μL、10× 缓冲液2.5 μL、ddH2O 9.9 μL。利用该体系对32份猕猴桃品种资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,结果表明14条引物共扩增出275个多态性位点,多态性百分率为100%,SRAP可以作为猕猴桃资源亲缘关系研究的有效标记;在遗传相似系数0.73水平处,供试材料可区分为4组,分别是中华猕猴桃、美味猕猴桃、黑蕊猕猴桃和毛花猕猴桃组。聚类结果表明中华猕猴桃与美味猕猴桃有着非常近的亲缘关系,毛花猕猴桃与中华猕猴桃之间的亲缘关系较远,黑蕊猕猴桃与美味猕猴桃之间亲缘关系可能较近。