猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研制

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)JYC株全病毒作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,融合后经间接ELISA进行杂交瘤筛选,共获得4株能分泌针对PRRSV单克隆抗体(简称单抗)的杂交瘤细胞株,分别命名为2G7、6G7、7F2和7E8,其亚类均为IgG1;单抗腹水的间接ELISA效价分别为10×215、10×211、10×215、10×214;间接ELISA试验结果表明,4株单抗与实验室保存的江苏地区临床分离的12株PRRSV以及VR-2332均发生特异性反应,而与猪常见其他病毒如猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(HCV)、猪圆环病毒2(PCV2)均无反应性;间接荧光试验表明,4株单抗与Marc-145细胞感染的PRRSV均呈特异性的荧光反应。因此这些单抗均可用于ELISA方法以及间接荧光试验,从而为建立快速、敏感的PRRSV的抗原检测方法奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以纯化的PRRSV全病毒抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,并测定其免疫球蛋白亚类、效价和特异性。结果成功获得2株能稳定分泌抗PRRSVM蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为3C3、3D2,经鉴定亚类均为IgG2a、kappa链。2株单克隆抗体腹水ELISA效价达105～107,IPMA效价达1:2560～1:10240,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒等无交叉反应。结论获得特异性针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体,为研究该病的快速诊断技术奠定基础。     

猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)作为抗原免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,通过聚乙二醇方法进行融合,利用有限稀释法在HAT培养基上筛选杂交瘤细胞,共获得12株既能稳定生长并可以分泌特异性抗TGEV的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为8D2、4H4、5D6、7H10、4C3、9G1、3A2、8G1、5G6、2D7、4D6、6B10。间接ELISA、Western blot、间接免疫荧光结果表明,获得的12株单抗能特异性识别TGEV,通过间接ELISA做病原检测,显示12株单抗与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PrV)不发生交叉反应。经抗体亚类鉴定,该12株单克隆抗体均为IgG2b。12株抗TGEV的单抗制备成功,为猪传染性胃肠炎病原特性研究和病原快速检测提供了物质基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株单克隆抗体的制备及生物学特性研究

通过差速离心和蔗糖密度梯度了心法对猪繁殖与呼吸综合征病毒沪1（PRRSV－S1）株进行抗原纯化。免疫BAIB／c小鼠，取脾细胞与SP2／O融合，用间接ELISA和有限稀释法,获得2株稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为AG、BD3。ELISA交叉试验和阻断试验表明，2株单抗具有高度特异性。AG1可与PRRSV－S1，欧洲株LV，美洲株VR－2332反应，而BD3与美洲株VR－2332反尖较弱，2株单抗对猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）均不反应。阳性杂交瘤细胞的上清液效价是：1：256－1：5123，腹水效价分别在1：10^3－1：10^5之间。AG1和BD3各有100条染色体，琼脂双扩散试验结果表明AG1属于IgG2b，BD2属于IgM。Western blot试验表明AG1和BD3是针对N蛋白抗原表位的特异性单抗。     

伪狂犬病毒单克隆抗体的制备和鉴定

以伪狂犬病毒（PRV）作为免疫原,免疫BALB／c小鼠,融合之后经间接ELISA、IFA和IHC试验进行杂交瘤筛选,共获得2株能分泌针对PRV单克隆抗体（简称单抗）的杂交瘤细胞株。2株猪伪狂犬病毒单抗与猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒均无交叉反应,IFA结果显示单抗能与接种于猪睾丸细胞（ST）的PRV发生特异性反应,IHC结果显示单抗能用感染了PRV的猪神经组织发生反应,证实抗PRV单克隆抗体具有良好的特异性和敏感性,此结论为猪伪狂犬病毒抗原表位分析及相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

猪细小病毒核衣壳VP2蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定

以纯化的PPV重组VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术,间接ELISA筛选和3次以上细胞克隆,获得了5株稳定分泌抗PPV VP2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为2D5、1F11、2B4、3C8、1 H3。其染色体平均数均为87～102条,分泌抗体亚类4株为Ig M类,1株为IgG类,Western blot检测表明,5株单抗均识别猪细小病毒VP2蛋白;间接免疫荧光鉴定表明,5株单抗均与PPV全病毒发生反应;间接ELISA鉴定与其他相关病毒的交叉反应性表明,制备的5株单抗不与TEGV、PRV和PEDV反应,表明所制备的抗体与猪细小病毒具有较强的特异性反应。     

抗猪附红细胞体单克隆抗体的制备

以纯化的猪附红细胞体免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,并用间接ELISA方法进行筛选,经过间接ELISA方法、免疫印迹和间接免疫荧光试验进行鉴定,共获得5株分泌抗猪附红细胞体单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1H1、1H2、3A5、5B1和7E11,其单抗亚类鉴定分别属于IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b和IgG2b。这5株McAb均能与猪附红细胞体全菌蛋白发生特异性反应,而不与猪肺炎支原体、猪链球菌、大肠杆菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒发生反应,并且1H1、3A5和5B1能识别同一抗原位点,1H2和7E11识别另一抗原位点。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的研制及其应用

以真核表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白所形成的病毒样颗粒作为免疫原,按照常规方法免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA法和间接免疫荧光试验（IFA）筛选,总共获得了4株分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7A6、3F2、3B7、1A6。4株单抗腹水效价均达到1:10⁵。IFA和免疫过氧化物酶单层实验结果显示,4株单抗均能与PCV2发生特异反应,与PCV1无交叉反应。PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备,为猪圆环2型病毒抗原表位分析及其相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及特性鉴定

为了建立快速、简便的番鸭小鹅瘟病诊断方法,用纯化的小鹅瘟病毒（Goose parpovirus,GPV-PT）免疫BABL/c鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA和间接免疫荧光检检（indirect immunofluorescence assay,IFA）筛选,获得3株能稳定分泌抗GPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株（分别命名为D11、7-7和E16）。三株单抗的免疫球蛋白亚类分别为IgM、IgG3和IgM,3株单抗均具有ELISA、IFA和中和特性;其中两株（D11和E16）具有致敏胶乳特性;特异性测定显示3株单抗仅与GPV反应,而与番鸭细小病毒（Duck parpovirus,MPV）、番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）、禽呼肠孤病毒（Avian reovirus,ARV）、鸭副粘病毒（Paramyxovirus,PMV）、鸭肝炎病毒（Duck hepatis virus,DHV）、正常细胞和胚液等均无交叉反应;在-20℃保存期为18个月。结果表明3株单抗均具有良好的特异性,为研制免疫学快速诊断奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒H240R蛋白单克隆抗体的筛选与鉴定

为制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)H240R蛋白单克隆抗体,首先构建原核表达质粒pET-29b-H240R,再进行蛋白表达与纯化,随后免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备、间接ELISA方法筛选获得单克隆抗体。结果显示,共获得4株杂交瘤细胞株,腹水效价均高于1∶40 000;亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体(12D6、21G3、8G7)重链亚类为IgG2b, 13D2重链亚类为IgG1,轻链亚类均为k。Western blot和Dot blot鉴定结果表明,21G3、13D2株单克隆抗体识别的抗原表位为线性表位,而12D6和8G7识别的是构象表位。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,4株单克隆抗体均能特异性识别HEK293T细胞中表达的H240R蛋白。制备了ASFV H240R蛋白单克隆抗体,为H240R蛋白的表位和功能研究奠定了基础。     

一株针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体的制备及鉴定

为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体,采用表达纯化的PRRSV NADC30-like毒株的GP5蛋白按常规方法免疫小鼠,采用间接免疫荧光方法筛选出1株阳性杂交瘤细胞（命名为3E10）,经3次亚克隆后制备腹水并进行纯化鉴定。结果显示：该杂交瘤细胞连续传代20代后细胞上清液的IFA效价仍不低于1:40。纯化后的单克隆抗体腹水浓度为0.204 mg/mL,亚类鉴定为IgM,且未发现有中和活性。特异性检测显示3E10单克隆抗体能与2株PRRSV NADC30-like毒株发生荧光反应,而与4株高致病性PRRSV疫苗毒株、2株经典株PRRSV疫苗毒株以及CSFV、PCV2、BVDV及Marc-145细胞均无荧光反应,显示出较好的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白单克隆抗体的制备及生物学特性分析

分别用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和纯化的重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(McAb)。用纯化的PRRSV免疫小鼠,经细胞融合获得2株可分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为4B8、4D8。用重组N蛋白免疫的小鼠,经细胞融合获得3株可分泌特异性McAb的抗PRRSV N蛋白的杂交瘤细胞2F3、4D5、5D11。间接ELISA检测4D8、4B8、4D5和5D11杂交瘤上清效价为1∶32~1∶512,而2F3的腹水效价为1∶12 800。单抗2F3、4B8和4D8与纯化病毒的Western blotting反应都为阳性,而4D5和5D11为阴性。IFA检测结果5株单抗都有明显的荧光,与PRRSV呈阳性反应。2F3的Ig亚型为IgM。5株单抗杂交瘤细胞连续传代至20代,分泌相应McAb的效价基本一致。本研究为PRRSV生物学诊断和方法研究提供有用工具。     

H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体IPMA检测方法的建立

本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10^2.63 TCID₅₀/100 μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰ H₂O₂的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50 μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪瘟病毒（CSFV）阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1：3 200的HI=2^-9标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。     

抗H3N2亚型猪流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

采用纯化的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)尿囊液作为免疫原免疫6～8周龄Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,用间接ELISA方法筛选分泌抗SIV-H3N2的阳性细胞株,经克隆获得7株亲和力较高的杂交瘤细胞株,分别命名为1C9、2C5、2F10、3D3、4E8、5C7、5D12,用其制备的腹水ELISA效价可达1×106。通过抗体亚型测定,间接免疫荧光试验及免疫印迹试验分析鉴定,该7株单抗均为抗H3N2亚型SIV的特异性单克隆抗体,而且与其他亚型猪流感病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒等均无交叉反应,为H3N2亚型SIV的鉴别诊断奠定了基础。     

Development and Evaluation of an Indirect ELISA for Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus IgA in Pig Serum and Milk Captured by Monoclonal Antibody

For the rapid and accurate evaluation of the IgA antibody level of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in pig serum and milk,a specific PEDV IgG monoclonal antibody (MAb) 8A3 was screened from four strains of PEDV MAb,which could capture all virus particles (inactivated virus cell culture medium) of PEDV efficiently.In this method,the coating concentration of 6.0 μg/mL showed the optimal performance of MAb 8A3,the cut-off value (D_{450 nm}) was settled as 0.34,it had no cross-reactivity with the positive serums of common porcine viruses.Compared with immune-peroxidase monolayer assay (IPMA),the concordance rates of established ELISA for positive and negative serum detection were 98.7% (152/154) and 98.0% (145/148),respectively.For positive and negative samples of colostrum and milk,the concordance rates of the established ELISA compared with IPMA were 100% (60/60) and 95.8% (23/24),respectively.IgA levels in colostrum and milk samples during lactation detected by established ELISA were highly correlated with trends in neutralizing titers (kappa=0.835).Collectively,the indirect ELISA in this study had high sensitivity and specificity,it was a rapid and objective method suitable for large-scale detection of PEDV IgA in clinical samples.     

伪狂犬病病毒闽A株单克隆抗体的制备与鉴定

本试验应用细胞杂交瘤技术,取健康BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行细胞融合,经双抗体夹心ELISA筛选,4次有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌抗伪狂犬病病毒(PRV)的单克隆抗体杂交瘤细胞株:2C6E6、3D5F1。2株杂交瘤细胞培养上清的效价分别为1:512、1:1 024。鉴定结果显示这2株单克隆抗体分别为IgG1亚类和IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为84条。用纯化的PRV免疫经产健康的BALB/c小鼠,采用ELISA方法检测获得的腹水的效价分别为1:1 638 400和1:819 200。经检测这2株单克隆抗体与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒均不发生交叉反应,特异性良好。杂交瘤细胞连续培养30代,仍能稳定分泌抗PRV的单克隆抗体,说明这2株单克隆抗体的稳定性良好。本试验研究结果为PRV的快速诊断方法的建立奠定了理论基础。     

Preparation and Identification of Monoclonal Antibody against Min-A Strain of Pseudorabies Virus (PRV)

With purified pseudorabies virus (PRV) to immune BALB/c mice, spleen cells from imunized mice were fused with SP2/0 myeloma cells by application of lymphocyte hybridoma technique, followed by double antibody sandwich ELISA screening, four times cloning by limiting dilution method to obtain two stable secreting anti-PRV monoclonal antibody hybridoma cell lines, 2C6E6 and 3D5F1.After identification, these two monoclonal antibodies belonged to IgG1 and IgG2a subtypes, respectively, the average number of chromosomes of hybridoma cells was 84, ELISA titers of these two hybridoma cell culture supernatants and mouse ascites monoclonal antibodies were 1:512 and 1:1 638 400, 1:1 024 and 1:819 200.These two monoclonal antibodies showed no cross-reaction with classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syhdrome virus and porcine parvovirus, which indicated that they had high specificity.The hydridoma cells could passage for 30 generations which could still secrete monoclonal antibody against PRV, which indicated that these two monoclonal antibodies had good stability.The results in the assay laid the foundation for establishing rapid diagnostic methods of PRV.     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA方法的建立

本试验通过差速离心法和非线性蔗糖密度梯度离心法纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）。经三氯－三氟乙烷处理后,作为ＥＬＩＳＡ试验的标准抗原,并建立了检测ＰＲＲＳＶ抗体ＥＬＩＳＡ方法。该方法与ＩＦＡ、ＩＰＭＡ和国外同类商品化试剂盒进行了对比试验,表明该方法具有敏感性高、特异性好的特点,是一种快速准确检测ＰＲＲＳＶ抗体的方法。间接ＥＬＩＳＡ方法在敏感性上要优于ＩＦＡ和ＩＰＭＡ》     

1株抗欧洲型和美洲型PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用RT-PCR方法扩增出欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SS-6毒株的核衣壳(N)蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建了重组表达质粒pGEX-N,并将其转化到大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的诱导下获得高效表达,重组蛋白的分子量约为40 ku。用纯化的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体。经细胞融合获得一株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,命名为1 B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgG1型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:640,腹水的效价为1:256 000,为猪繁殖与呼吸综合征的诊断奠定了基础。