PRSV CP-VPg嵌合型ihpRNA干扰载体转化番木瓜的抗性分析

利用p CAMBIA3300载体为背景,构建PRSV CP-VPg嵌合型植物表达干扰载体p Cambia-hp RNA-CV,通过花粉管通道法将PRSV CP-VPg嵌合型植物表达载体遗传转化番木瓜,并将获得的转化番木瓜种子依次进行除草剂(PPT)筛选、PCR检测。结果表明:获得转基因番木瓜植株5株,且RT-PCR实验证明了目标片段在转基因株系中得到表达。采用人工摩擦接种法对转基因番木瓜株系进行攻毒实验,结果显示转基因番木瓜植株对PRSV病毒表现出抗病特性,说明hp RNA-CV成功的干扰了病毒基因的复制。该研究结果为番木瓜抗PRSV育种提供了一种有效的研究手段。     

用Golden Gate法构建广谱抗番木瓜环斑病毒海南株系的CRISPR/FnCas9植物表达载体

分子生物学育种是目前防治番木瓜环斑病毒(PRSV)最有效的方法。早期转基因番木瓜抗病毒的策略是根据"致病菌衍生的抗病性"(PDR)原理,将病毒来源的基因全长序列,转入番木瓜并获得抗性。PDR策略最主要特点依赖于靶目标病毒基因序列相似性,不能有效解决海南的番木瓜环斑病毒遗传多样性复杂的株系。本研究着眼于创制广谱的抗PRSV新策略,用最新的CRISPR/FnCas9基因编辑技术和Golden Gate载体构建系统,依据不同PRSV株系的保守序列分析结果,将5个sgRNA(2个CP sgRNA,2个Nib sgRNA和1个HC-Pro sgRNA)串联在一个载体上,实现一个载体可识别剪切5个位点,从而达到广谱抗PRSV的效果,应对海南地区PRSV株系复杂的问题。目前载体已经进行了测序验证,并在番木瓜上进行了叶片局部瞬时表达,初步表现出对PRSV的抑制效果,这为获得广谱抗番木瓜环斑病毒的番木瓜品种奠定良好基础。      

番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建

为研究广谱抗环斑病毒（PRSV）海南株系转基因番木瓜育种方案,采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系,以外壳蛋白（CP）、辅助成分－蛋白酶（HC-Pro）和复制酶（Nib）基因作为靶标基因,通过序列比对和运用Clustalx软件分析,得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以pUCCRNAi为骨架质粒,利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构,将发夹结构导入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体,构建出抗PRSV植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合,可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。     

利用GATEWAYTM技术快速构建番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体

通过RT-PCR扩增番木瓜环斑PRsV病毒HC-pro基因,序列比对结果表明,克隆到的该基因片段与已知的海南或华南地区已克隆的HC-pro基因只有约92%的同源性,说明PRSV病毒具有较大的变异性.为了培育番木瓜转基因抗病植株,利用pWATERGATEI体和GATEWYTM技术,成功构建了番木瓜环斑病毒HC-pro基因的RNAi表达载体.具体步骤如下:①设计带特异性重组序列attB的HC-pro基因PCR的引物;②利用该引物进行RT-PCR扩增日C-pro基因;③通过BP反应,将扩增得到的HC-pro基因序列插入入门载体pDONR201中;④通过LR反应将HC-prd基因序列从pDONR201重组到目标载体pWATERGATE中,得到PRSV HC-pro基因的RNAi表达载体.     

海南番木瓜PRSV和PLDMV病毒发生情况及分子鉴定

对海南昌江、乐东、澄迈、文昌和三亚5个主要番木瓜产区的病毒病发生情况进行调查。对76份番木瓜疑似病毒样品进行检测,检测结果表明海南番木瓜病毒病主要有2种：由番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus,PRSV）引起的番木瓜环斑病毒病和由番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV）引起的番木瓜畸形花叶病毒病。其中,番木瓜环斑病毒病最为常见,检出率达77.63％,是影响海南地区番木瓜产业健康发展的主要病毒病;畸形花叶病毒病发生率很低,仅检出2例番木瓜畸形花叶病毒病样品。以PRSV病毒基因组P1和Hc-Pro作为靶标基因进行分子克隆、测序,结果表明海南地区PRSV病毒可明显分为2个株系：HN-PRSV-1株系和HN-PRSV-2株系。此外,基于CP基因的系统进化树分析结果表明在海南新发现的PLDMV病毒可能源于台湾和日本。本研究可为开展番木瓜花叶病的防控和创制抗花叶病毒番木瓜新种质提供数据参考。     

MicroRNA用于创制抗PRSV番木瓜新种质的展望

微小RNA(microRNA, miRNA)是真核生物体内调控基因表达的一类非常重要的小分子RNA,在植物逆境适应过程中发挥着重要的作用。总结番木瓜环斑病毒(papaya ring spot virus, PRSV)致病机理研究的最新进展,探讨miRNA在植物抗病毒中的研究进展和应用前景,提出研究番木瓜miRNA参与抗PRSV机制的途径,为开展番木瓜miRNA研究和创制抗PRSV番木瓜新种质提供理论参考。     

根癌农杆菌介导的环斑病毒外壳蛋白基因转化番木瓜的研究

利用杂种一代番术瓜(cariea papaya L.)实生苗的下胚轴及无菌苗的茎段、叶片等外植体与根癌农杆菌共培养的方法(即改良的叶盘法),将PBIU1质粒上的新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)和环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV—CP)导入番木瓜细胞的核基因组中。经共培养的外植体在含有卡那霉素(kan,100μg/ml)的选择培养基上产生抗性的愈伤组织,并通过体胚发生途径再生植株。NPTⅡ分析证明,NPTⅡ基因已在再生植株中稳定地表达。Southern blot分子杂交证明,PRSV—CP基因已整合到番木瓜的核基因组中。本研究已获得转PRSV—CP基因植株,并且在苗床移栽成活。     

禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜体内PRSV-CP基因表达的抑制作用

为了解禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜植株体内PRSV基因表达的影响，以组织培养的日升番木瓜为研究对象，以β-actin基因为内参基因，应用RT-PCR技术对番木瓜体内的PRSV-CP基因进行半定量分析，建立一个特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系，研究了禾生素、病毒必克和病毒A处理对番木瓜体内PRSV基因表达量的影响。初步说明，0.2 %的禾生素及4.0 g/L和1.0 g/L的病毒必克显著抑制了番木瓜体内PRSV-CP基因的表达，而病毒A及其它浓度的禾生素和病毒必克对番木瓜体内的PRSV-CP基因的     

水稻黑条矮缩病毒P7-1基因对水稻的遗传转化及转基因植株的抗病性分析

【目的】通过在水稻中过量表达水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV) P7-1基因,分析RBSDV P7-1是否是导致水稻不育的重要致病因子,并明确过量表达P7-1转基因植株对病毒的抗性。【方法】采用RT-PCR方法从感病植物中扩增获得RBSDV P7-1基因,构建pCAMBIA-1300-P7-1载体,通过农杆菌转化法获得转基因水稻,观察水稻是否能够正常结实,并采用人工接种病毒方法分析转基因植株的抗性。【结果】过量表达RBSDV P7-1的转基因水稻生长、结实正常。在接种7 d和14 d时转基因植株中病毒积累量显著低于野生型对照,但在28 d时部分转基因株系中病毒积累量高于对照,接种30 d时转基因植株的发病率与对照无明显差异。【结论】在水稻中过量表达RBSDV P7-1不影响水稻的结实;转基因水稻在RBSDV侵染早期可抑制病毒的积累,但在后期对病毒的抗性与对照没有明显差异。     

禾生素和水杨酸对番木瓜PRSV病情及其防御酶活性的影响

为了研究禾生素(CTS-N)和水杨酸(SA)对番木瓜(Carica papaya L.)较长期抗番木瓜环斑病毒(PRSV)的效果,测定了CTS-N和SA处理后番木瓜300 d内PRSV病情指数变化和CTS-N处理后关键防御酶活性的变化。结果表明,施用CTS-N后番木瓜PRSV病情指数持续偏低,清水和SA处理的则较高,田间第240、270和300天,CTS-N处理的PRSV病情指数显著低于清水和SA处理。CTS-N处理后,番木瓜叶片中多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的     

接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.     

一步法RT-PCR扩增PRSV海南分离物全长基因组cDNA

以植物总RNA提取试剂盒提取的高纯度的总RNA为模板,使用Oligo dT-Adaptor和Random9引物合成了番木瓜环斑病病毒海南分离物(PRSV HN-2)的cDNA第一链,基于已报道的PRSV全长基因组序列,设计合成了一对引物,一步法RT-PCR扩增出PRSV海南分离物全长基因组cDNA。为了验证获得的全长基因组cDNA的正确性,并以扩增出的全长cDNA为模板,将PRSV全长基因组分成A、B 2个大片段进行扩增,应用T载体进行克隆和测序以验证所获得的全长基因组cDNA序列的正确性。测序结果显示,该cDNA序列与国内外报道的PRSV各分离物全长核苷酸序列的相似性很高,表明本文建立的一步法RT-PCR扩增PRSV全长基因组cDNA的方法正确、可行。     

PRSV运动相关病毒蛋白的Sos恢复系统诱饵载体构建及自激活效应检测

为研究与番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白(CP、HC-Pro、CI)互作的寄主因子,构建以Sos恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的3个病毒蛋白诱饵载体,并检测其自激活作用来验证是否适用于后续的文库筛选.通过RT-PCR从番木瓜环斑病毒海南分离物中扩增出这3个病毒蛋白的片段,按正确方向将目标片段分别插入诱饵载体pSos中,并将重组质粒导入酵母温度敏感酵母菌株cdc25H,检测其表达产物对酵母Sos恢复系统Ras信号通路的激活作用而产生的细胞温敏特性影响.结果表明,这3个含番木瓜环斑病毒运动相关的病毒蛋白的诱饵载体构建正确,对酵母菌株cdc25H的Sos恢复系统无激活作用,激活试验为阴性.     

番木瓜环斑病毒CP基因同源区段的克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术对番木瓜环斑病毒CP基因的同源区段进行了克隆和鉴定分析。序列分析结果表明,获得PRSV-CP基因3′端的278bp DNA片段同源率最高。构建了目的基因包含278bp正义链、内含子(PDK内含子)及278bp反义链的RNA介导的植物表达载体p2301-CPU,并通过电激法导入农杆菌中。经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入获得了农杆菌工程菌株。利用该植物表达载体对番木瓜的遗传转化工作目前正在进行中。     

几种制剂对番木瓜环斑病的防治效果

分析研究水杨酸(SA)、病毒必克、草酸钾、磷酸钠和磷酸二氢钠等5种制剂对番木瓜环斑病发病前和发病后的防治效果,结果表明:发病前,0.05 g/L的水杨酸、O.1 g/L的病毒必克、1.0 g/L的草酸钾、0.5 g/L的磷酸钠、3.0 g/L的磷酸二氢钠的防治效果分别为71.67%,92.63%,83.72%,80.09%,76.2l%;发病后,水杨酸降低病级数1.67,病毒必克等也一定程度控制了病情发展,而清水处理的病级数上升了1.47.差异均极显著.