贝莱斯芽胞杆菌LQ-3防治小麦纹枯病的效果及根际定殖能力

小麦纹枯病（wheat sharp eyespot）主要是由禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）侵染引起的一种土传真菌病害,严重威胁小麦生产安全。目前,利用生防细菌防治小麦纹枯病已成为研究热点,其中,研究最多的一类生防细菌为芽胞杆菌。为明确贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）LQ-3防治小麦纹枯病的效果及其在小麦根部定殖能力,本研究利用LQ-3发酵液灌根处理小麦苗,调查统计LQ-3对小麦纹枯病的防效。同时利用绿色荧光蛋白标记菌株LQ-3（pGFP78）灌根处理小麦根部,并结合抗生素平板回收检测、激光共聚焦显微镜观察方法,探明LQ-3在小麦根部的定殖动态。结果表明,LQ-3防治小麦纹枯病的效果为57.49%,与化学药剂27%苯醚·咯·噻虫悬浮种衣剂（酷拉斯）的防效（59.95%）相当。LQ-3（pGFP78）的生长趋势与野生型LQ-3相比并没有显著性差异,且仍具有游动性和生物膜形成能力。 LQ-3（pGFP78）发酵液初始浓度为2.3×10⁸ cfu·mL^-1,灌根处理5 d后,其在小麦根部的定殖量已达到9.63×10⁶cfu·g^-1,25 d后,定殖量仍有1.33×10⁶cfu·g^-1,表明LQ-3在小麦根部具有较好的定殖能力。     

枯草芽胞杆菌在油菜根茎叶的定殖动态和生防作用研究

采用常规方法跟踪枯草芽胞杆菌Tu-100在缩影系统油菜根际的定殖情况。Tu-100在油菜不同根段部位的定殖密度从上到下呈现了逐渐递减的规律。随着接种后时间的延长而逐渐下降。在根段8cm以外的根区几乎检测不到接种菌。在油菜播种后3d,定殖密度可达最高水平（8.3×105 个/g）,然后急速下降,30d后保持相对稳定的较低水平（1.3×102 个/g）。 在油菜三片真叶时喷雾接种一次,20d后,在茎和叶上不能检测到所接种的Tu-100,并且抗菌核病的能力也逐渐减弱。     

玉米内生细菌Y19的荧光标记及其在玉米体内的定殖应用效果

Y19是从玉米种子分离的具有促生、防病效果的解淀粉芽孢杆菌。为探究其在玉米体内及根围土壤中的定殖情况,通过自然转化方式将含有绿色荧光蛋白基因gfpmut3a的质粒p HAPII导入Y19,获得具有良好荧光表型的标记菌株Y19-GFPmut3a。室内平板对峙、玉米盆栽促生定殖实验的结果表明,质粒的引入对Y19的拮抗病原及促生效果并无明显的影响,接种后的第40天,仍能在玉米的根围土壤、根、茎及叶组织中检测到标记菌株;激光共聚焦显微镜观察结果显示,接菌后的第9天,即可观察到其在玉米根、茎及叶部组织的定殖,表明Y19在玉米体内具有良好的运输传导性能。     

芽胞杆菌次生代谢产物及其在土传病害防控中的应用研究进展

介绍了芽胞杆菌次生代谢产物及防控土传病害的国内外研究现状,包括芽胞杆菌拮抗和促生物质种类、作用机理等,以及生防菌的防控应用、根际定殖等内容,并根据目前存在的问题进行了未来研究方向和前景展望。     

玉米内生细菌-解淀粉芽孢杆菌Y19-RifM在玉米根部定殖能力的研究

采用逐步提高LB平板中利福平浓度的方法,从具有促生长和防病潜力的玉米内生细菌解淀粉芽孢杆菌Y19中筛选出获得抑菌活性不变的抗利福平(250μg/m L)突变菌株Y19-Rif M,研究Y19-Rif M在玉米根部定殖能力。结果表明,玉米出苗后25、30、35、40、45、50、55 d,从根际、根表、根内均能回收到抗性菌落。根际、根表的回收菌量保持在1×103~1×104CFU/g的水平,根内保持在1×103CFU/g的水平,灭菌土中回收到的菌落数量高于自然土中菌落数量。     

枯草芽胞杆菌Tu-100对几种作物的促生效果

盆栽试验结果表明,枯草芽胞杆菌Tu-100对油菜、小麦、辣椒、西瓜、大豆和玉米苗期有不同的促生效果,在植物干重上分别比对照增加9.47%、1.37%、2.27%、19.23%、9.21%和6.67%.对水稻的盆栽产量增加12.82%.对大豆的结瘤数和鲜瘤重呈现负增长.植物促生根际细菌对不同的作物保持着不同的亲和性.     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX超氧化物歧化酶基因的克隆及原核表达

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX具有抑菌、抗褐变和保鲜功能。以短短芽胞杆菌菌株FJAT-0809-GLX总DNA为模板,采用PCR扩增超氧化物歧化酶(Supseroxide dismutase,SOD)基因,将该片段纯化回收后与p MD18-T连接并转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,进行序列测定,结果显示SOD基因序列长度为609 bp(Gen Bank登录号:KM255665),编码202个氨基酸残基。将SOD基因片段与同样酶切的表达载体p ET-28a连接,构建重组表达载体p ET-28a-SOD,转入大肠杆菌BL-21,采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导表达。SDS-PAGE结果表明,在菌体中存在约25 ku的蛋白表达产物,与该基因ORF预期大小接近。以上结果为进一步研究该酶的生理生化特性奠定了基础。     

华重楼根际土芽胞杆菌多样性研究

为了解华重楼根际芽胞杆菌种群多样性信息,本研究采用稀释平板法分离福建省光泽县华重楼品种根际的芽胞杆菌,并对其进行16S rRNA序列分析。结果表明：从华重楼根际共分离到17个形态差异的芽胞杆菌菌株;16S rRNA序列分析表明,17个菌株鉴定为8个种,归属于4个属,芽胞杆菌属(Bacillus)、赖氨酸芽胞杆菌属(Lysinibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和绿芽胞杆菌属(Viridibacillus),其中芽胞杆菌属的种类和数量最多。经抑菌试验分析,芽孢杆菌属的特基拉芽孢杆菌FJAT-43012对尖孢镰刀菌具有抑制作用。本研究结果表明,华重楼根际芽胞杆菌种群多样性较为丰富。本研究对芽胞杆菌资源的开发和利用提供良好的实验材料和理论基础。     

枯草芽胞杆菌TR21叶腋喷施防治巴西蕉枯萎病

枯草芽孢杆菌TR21是一株植物内生菌,能够通过叶腋接种在香蕉体内定殖。采用叶腋接种法研究TR21对盆栽巴西蕉枯萎病的防治效果,并在大田采用随机区组试验设计,研究叶腋喷施TR21对巴西蕉枯萎病的防治效果和对巴西蕉挂果情况的影响。盆栽试验结果表明,按每次5.0×108 cfu/株的接种量,每隔10 d使用1次,连续使用4次,以地上部分萎蔫程度统计,30 d防效为(89.42±7.81)%,40 d防效为(85.95±2.77)%;结合地上部分萎蔫程度和球茎解剖结果统计,40 d防效为(79.32±4.49)%。从2008年4月至2009年2月进行田间试验,每次按1.8×108 cfu/株的用量,每隔10 d喷施1次,连续处理的植株到收获结束后,香蕉枯萎病发病率为(20.27±7.02)%,显著低于清水处理,防效达到61.92%。处理区2008年9月份的总挂果率达到25.00%,显著高于对照(3.13%),10月份的总挂果率为62.75%,高于对照(56.52%),但差异不显著。说明枯草芽孢杆菌TR21可以通过叶腋喷施接种防治巴西蕉枯萎病。     

解淀粉芽孢杆菌HAB-7对18株植物病原真菌的抑制作用

HAB-7是一株分离自豇豆根际土壤、具有较强抑菌作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。研究HAB-7对18株植物病原真菌及其发酵液粗提蛋白对植物病原的抑制作用,并测定其对番茄种子的促生作用。采用平板对峙法测定其对18株植物病原真菌的抑制活性,以橡胶树炭疽菌为指示菌,对其发酵上清液经60%、80%硫酸铵盐析获得的抗菌粗蛋白进行测试;并将HAB-7菌液稀释成6个浓度梯度,分别用来对番茄种子进行促生测试。结果显示：HAB-7对18株植物病原真菌的平均抑菌率为61.03%;     

枯草芽孢杆菌绿色荧光蛋白高效表达载体的构建

利用绿色荧光蛋白基因gfpmut3标记枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的启动子P43;构建1个枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pP43GFP。结果表明：P43与gfpmut3构成了融合基因,可调控gfpmut3在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中的表达;荧光检测发现,P43在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中具有极强的启动基因表达能力;质粒稳定性测定表明,连续稀释培养55 h后,质粒的稳定性为85％。     

枯草芽孢菌株TL2在茶树体内的内生定殖

枯草芽孢菌株TL2接种茶树后,可以从茶树不同组织分离到细菌,其细菌种群数量随着时间逐渐减少,其细菌多样性系数也随着时间有所降低。其菌体主要分布在根部厚壁组织的细胞间隙,茎部厚角组织的细胞间隙、维管束等组织的细胞间隙、叶片的气孔器附近、上下表皮细胞间隙、厚角组织细胞间隙以及内皮层组织细胞间隙等。     

Transient Expression of Green Fluorescent Protein in Rice Calluses : Optimization of Parameters for Helios Gene Gun Device

Abstract

An optimized condition for particle bombardment is necessary for efficient genetic transformation. Parameters for Helios gene gun, the new system for nucleic acid delivery which is mainly consists of hand-held device sold by Bio-Rad Laboratories (California USA), were examined based on transient expression of synthetic green fluorescent protein (sgfp) in rice calluses of indica cv. Fatmawati and japonica cv. Nipponbare. In the experimental conditions that we examined, parameters found to be the most favorable conditions for transient expression of sgfp in rice callus cells were as follows: 200?250 psi helium pressure, 0.6 μm gold particle size, 0.25 mg gold particles per shot, and 1.5 μg plasmid-DNA per shot. Desiccation of callus cells for eight min was also found appropriate. The level of transient sgfp expression was not significantly influenced by the pre-culture for 4 to 12 d before bombardment or by callus age between 10 and 33 wk old in Fatmawati. These parameters for this particular device should improve the transient expression, thus enabling stable expression of introduced genes via Helios gene gun using callus as a target tissue.     

拮抗香蕉枯萎病菌的解淀粉芽孢杆菌LX1菌株的鉴定及其抗菌蛋白基因的克隆

收集海南不同盐碱地的土样进行拮抗香蕉枯萎病菌的微生物分离,对具有较强抑菌作用的菌株进行形态特征、生理生化和分子鉴定,并克隆其抗菌蛋白基因.结果分离到1株具有较强抑制香蕉枯萎病菌能力的细菌LXl,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).抑菌实验发现LX1菌株的发酵上清液中粗蛋白有一定的抑菌作用,经过Sephacryl S-200HR柱层析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化了其中抑菌作用最强的抗菌蛋白.质谱鉴定结果表明,抗菌蛋白与B.amyloliquefaciens FZB42内切葡聚糖酶同源性最高.根据质谱结果克隆了该抗菌蛋白的编码基因,该基因的核苷酸和氨基酸序列与B.amyloliquefaciens FZB42的内切葡聚糖酶的核苷酸和氨基酸序列同源性分别达99％和100％.拮抗香蕉枯萎病菌的芽孢杆菌LX1可作为潜在的防治香蕉枯萎病的的生防制剂,其抗菌蛋白基因也可通过遗传工程应用于香蕉枯萎病的防治.     

转基因大麦的gfp基因表达及染色体定位

为了深入探讨转基因的整合位置对基因表达的影响，对转绿色荧光蛋白基因（gfp）大麦的荧光表达和gfp基因的染色体位置进行了研究。结果表明，绿色荧光蛋白（gfp）在大麦的根尖和花粉中均有表达，四倍体的荧光表达强度大于二倍体，表现出基因的剂量效应。gfp基因插入到第6染色体（6H）短臂和另一染色体的短臂近末端。     

内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株活性物质诱导辣椒果抗疫病的生化机理

利用内生解淀粉芽孢杆菌TB2菌株的活性物质喷施辣椒果后0、24、48、72 h接种辣椒疫霉病菌进行防治辣椒疫病试验,结果表明,TB2菌株的活性物质对辣椒果疫病的发生有一定控制作用,活性物质处理间隔24 h后再接种病菌,其防病效果得到显著提高。生化机制研究表明,TB2的活性物质处理可使辣椒果的可溶性蛋白含量、丙二(MDA)含量、超氧阴离子自由基(O.-2)产生速率及过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性发生显著变化。病菌处理的辣椒果,可溶性蛋白含量、MDA含量和O.-2产生速率及POD、SOD、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸氨解酶(PAL)活性均会显著升高,且其最大值高于活性物质处理果的相应最大值。活性物质和病菌共同处理的辣椒果,POD和PAL的活性可上升到高于病菌单独处理的峰值,但MDA含量和O.-2产生速率及SOD和CAT活性均较低,与对照的接近,表现出相对稳定状态。由此推断,TB2的活性物质诱导辣椒果抗疫病与POD、PAL等酶的活性相关。     

A Thermotolerant Marine Bacillus amyloliquefaciens S185 Producing Iturin A5 for Antifungal Activity against Fusarium oxysporum f. sp. cubense

Fusarium wilt of banana (also known as Panama disease), is a severe fungal disease caused by soil-borne Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc). In recent years, biocontrol strategies using antifungal microorganisms from various niches and their related bioactive compounds have been used to prevent and control Panama disease. Here, a thermotolerant marine strain S185 was identified as Bacillus amyloliquefaciens, displaying strong antifungal activity against Foc. The strain S185 possesses multiple plant growth-promoting (PGP) and biocontrol utility properties, such as producing indole acetic acid (IAA) and ammonia, assimilating various carbon sources, tolerating pH of 4 to 9, temperature of 20 to 50 °C, and salt stress of 1 to 5%. Inoculation of S185 colonized the banana plants effectively and was mainly located in leaf and root tissues. To further investigate the antifungal components, compounds were extracted, fractionated, and purified. One compound, inhibiting Foc with minimum inhibitory concentrations (MICs) of 25 μg/disk, was identified as iturin A5 by high-resolution electrospray ionization mass spectrometry (HR-ESI-MS) and nuclear magnetic resonance (NMR). The isolated iturin, A5, resulted in severe morphological changes during spore germination and hyphae growth of Foc. These results specify that B. amyloliquefaciens S185 plays a key role in preventing the Foc pathogen by producing the antifungal compound iturin A5, and possesses potential as a cost-effective and sustainable biocontrol strain for Panama disease in the future. This is the first report of isolation of the antifungal compound iturin A5 from thermotolerant marine B. amyloliquefaciens S185.     

Infection and Colonization of Pathogenic Fungus Fusarium proliferatum in Rice Spikelet Rot Disease

Rice spikelet rot disease (RSRD), caused by Fusarium proliferatum, is an emerging disease. So far, the effects of diseased rice floral organs as well as the primary infection sites and stages of this pathogen are not determined. We investigated changes in the floral organs, along with the infection processes of the pathogen in plants inoculated with F. proliferatum and labelled with a green fluorescent protein during different growth stages of rice. The results showed that RSRD is not a systemic infectious disease, which has negative effects on the fertility of the infected rice. F. proliferatum caused brown colored anthers, crinkled pistils and ovaries, pollen grain deformities and anther indehiscence. The number of pollen grains on the stigmas decreased significantly in the infected spikelets, and the anther dehiscence and seed-setting rate successively declined by 69% and 73%, respectively, as a result of the infection. The initial infection stage occurred at the pollen cell maturity stage, and the primary invasion sites were determined to be the anthers of rice. It was noted that the pathogen mainly damaged the pollen cells, and with the exception of the filaments, proceeded to colonize the pistils and endosperm.     

茶树荧光性绿斑病叶黄绿色自发荧光的显微分析

茶树荧光性绿斑病是一种茶树成叶生理性病害,病叶上的绿色病斑可见自发的黄绿色荧光。为了以黄、绿色自发荧光为探针了解病害的发生规律,同时为黄色、绿色荧光物质的分离鉴定提供光谱学依据,应用荧光显微技术、显微荧光光谱成像技术、激光扫描共聚焦显微技术、流式细胞术研究了茶树荧光性绿斑病叶中黄、绿色自发荧光的显微观察条件、发射光谱和发光部位。结果表明:在不同激发光照射下,茶树荧光性绿斑病叶能发射多种自发荧光,其中黄色、绿色荧光显微观察的最佳条件为:蓝光激发,彩色和绿色单色光模式记录图像;在绿光、黄光范围有三个荧光峰,其波长分别为515nm、535nm和585nm;最初发出绿色、黄色荧光的病变部位是维管束鞘细胞,随后出现在部分海绵细胞、栅栏细胞和表皮细胞中;黄色、绿色荧光在细胞中的发光位置定位于液泡。