胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析

利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化体系转化杞果炭疽菌SC2菌株,共获得抗潮霉素B突变体4 680个,平均每转化1.0×106个炭疽菌分生孢子可得到300～980个突变体,且潮霉素抗性在多次传代实验中得到稳定遗传.随机挑取38个突变体进行PCR检测,均可扩增出1条约1.2 kb的目标谱带,说明突变体为T-DNA插入引起:进一步的Southern blot杂交分析结果表明,在随机挑选的20个突变体中,有1个(5%)为三拷贝T-DNA插入,4个(20%)为双拷贝插入,剩余的15个(75%)为单拷贝插入.     

橡胶树胶孢炭疽菌组蛋白乙酰转移酶CgGCN5调控致病力功能研究

胶孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡胶减产的主要原因之一。研究该病原菌致病力的分子机制能够为新型防控策略的研发提供理论依据。在橡胶树胶孢炭疽菌中,存在1个编码组蛋白乙酰转移酶的基因CgGCN5。在本研究中,通过同源重组原理及原生质体转化法构建了橡胶树胶孢炭疽菌CgGCN5的敲除突变株和互补菌株,并对其生长、产孢及致病力等表型进行了初步分析。结果表明,与野生型菌株相比,CgGCN5敲除突变株的生长速率、产孢能力均显著下降;并且突变株对橡胶树叶片的致病力也显著下降;进一步分析表明,突变株丧失了对玻璃纸的穿透力。与此同时,互补菌株能够恢复突变株的相应表型。以上结果表明,CgGCN5在调控胶孢炭疽菌的生长及致病力中起重要作用。     

胶孢炭疽菌致病性减弱突变菌株H800 T-DNA插入位点侧翼基因的克隆

对农杆菌介导转化引起的致病性减弱突变菌株H800的菌落形态、孢子形态、菌丝体生长速率、孢子萌发率和致病力等生物学特性进行研究,并利用TAIL-PCR方法克隆T-DNA插入位点基因,结合生物信息学分析该基因功能与H800表型变化及致病性减弱的关系。结果表明,突变菌株H800的致病力低于野生型菌株CH008;生长速率为0.83 cm/d,亦显著低于CH008的1.13 cm/d;产孢量和分生孢子大小与CH008无明显差异;孢子萌发率为2.58％,显著低于野生型的95.98％;序列分析显示,T-DNA已插入StCg800基因的启动子区域,基因结构分析表明,StCg800基因编码区全长774 bp,无内含子,可编码257个氨基酸多肽的StCg800蛋白。该蛋白是不稳定的水溶性蛋白,亚细胞定位于细胞质,且无信号肽,推测为生长因子类的酶,但功能尚未知。     

胶孢炭疽菌在斯里兰卡热带水果的寄主范围

从斯里兰卡的２３种水果作物上分离到胶孢炭疽菌，在这之前。未有该菌在斯里兰卡的榴莲，山竹了，蒲桃和红毛丹以及其它１１种经济价值较小的果树上的记载。胶孢炭菌侵染果树树苗（特别是芒时和红毛丹）的症状增被认为是生理失调所致，这可造成高达４０％的苗木损失。所以，推荐通过隔离核接种体的主要源来保护这些树苗。     

橡胶树胶孢炭疽菌P型ATP酶基因CgATPase 01的敲除及表型分析

为了了解橡胶树胶孢炭疽菌的一个钙转运P型ATP酶基因Cg ATPase01的功能,本研究利用Splitmarker技术构建敲除载体,通过PEG介导原生质体转化对橡胶树胶孢炭疽菌菌株HBCg01的Cg ATPase 01基因进行敲除,根据表型变化及致病性检测对其功能进行分析。结果表明:通过Split-marker方法获得了敲除突变体△Cg ATPase01,表型分析发现该突变体与野生菌株间存在明显差异,病菌气生菌丝的颜色发生了改变,生长速率降低,产孢量下降,对橡胶树叶片的致病性减弱,推测该基因可能在橡胶树胶孢炭疽菌的产孢、生长发育和致病性等方面具有重要作用。本研究结果为进一步研究胶孢炭疽菌P型ATP酶基因功能和病原菌的致病机理奠定了基础。     

热带亚热带水果胶孢炭疽菌对多菌灵的抗药性测定

采用生长速率法对来自海南18种热带亚热带水果的893株胶孢炭疽菌(C. gloeosporioides)进行多菌灵抗药性测定。结果表明：在供试菌株中,11.87%的菌株对多菌灵产生了不同程度的抗性,且高抗菌株达9.63%,具有抗多菌灵的C. gloeosporioides菌株主要来自芒果、荔枝和龙眼等14种水果。多菌灵对供试菌株的毒力存在差异,EC50值的最高值与最低值相差4.17×105倍,EC90值的最高值与最低值相差7.49×106倍。建议在热带亚热带水果病害防治中,慎用多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂,选择作用机制不同的杀菌剂交替使用,延缓抗药性的产生,提高杀菌剂的防效。     

CsSSK1基因调控暹罗炭疽菌胁迫应答和致病性的功能分析

暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）是热带、亚热带地区许多农林作物炭疽病的主要病原菌。SSK1是双组分系统中的应答调节蛋白,已有研究显示病原真菌中的SSK1与病原菌的形态建成、胁迫反应、耐药性和致病力有关,但在不同菌中其功能存在差异。为了解暹罗炭疽菌中同源基因CsSSK1的功能,本研究利用同源重组法构建了CsSSK1基因缺失突变体ΔCsSSK1和回补菌株ΔCsSSK1(CsSSK1),对其进行表型观察。结果显示：与野生型菌株相比,形态发育上,缺失突变体ΔCsSSK1的菌丝生长速率略有降低,分生孢子较短且产孢量低,孢子萌发率也降低;胁迫应答上,ΔCsSSK1显著提高了炭疽菌对NaCl、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、刚果红胁迫的敏感性,提高了对氟康唑和戊唑醇的敏感性,但降低了对咯菌腈的敏感性;致病功能方面,CsSSK1基因缺失明显降低了致病力。研究结果表明CsSSK1基因参与调控暹罗炭疽菌的形态建成,应答盐胁迫、渗透胁迫、刚果红胁迫反应,参与药剂敏感性调控,影响暹罗炭疽菌的致病能力。本研究结果为深入了解暹罗炭疽菌CsSSK1基因功能,解析病原真菌应答胁迫反应的分子机理奠定基...     

胶孢炭疽菌侵染芒果的过程及寄主的组织病理学研究

炭疽菌是一类地理分布广泛、寄主范围广泛的真菌,在作物成熟前和成熟后都能侵染植株和果实,特别对成熟的热带作物危害极大,造成果实腐烂,导致严重的经济损失并影响产品的出口质量.为探讨胶孢炭疽菌侵染芒果的过程及其与寄主的互作关系,揭示该病菌对果实和叶片的侵染方式和扩展途径,以元江本地品种'三年芒'病果上分离、筛选的强致病菌株C...     

橡胶树胶孢炭疽病菌致病相关基因CgATG8的功能分析

ATG8是病原真菌中细胞自噬过程中的重要基因,并参与致病过程。基于橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01全基因组数据库,采用PCR和RT-PCR扩增得到橡胶树胶孢炭疽病菌的CgATG8基因并进行序列分析。采用Split-Marker Recombination法获得该基因的敲除转化子。表型分析结果表明,缺失该基因后,橡胶树胶孢炭疽病菌的致病力丧失,产孢能力、孢子萌发率、附着胞形成率和膨压均降低,而且孢子萌发和附着胞的形成延迟。     

农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选

构建含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体pCAMBgfp,以其为转化载体用农杆菌EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化,以潮霉素抗性和GFP荧光来筛选阳性转化子。然后,通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。结果获得500个阳性转化子,转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和GFP荧光的阳性转化子,且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。随机挑选其中13个突变体进行PCR检测,均可扩增出潮霉素基因目的条带,致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。     

柱花草炭疽病流行因子初探

通过连续两年对6个不同柱花草品种炭疽病的田间发病流行情况进行定位观察,并将炭疽病病情与大气温度、湿度和雨量之间进行相关分析。结果表明：柱花草炭疽病病情严重度与空气相对湿度成显著的正相关(r＝0.440 37,Pr＝0.045 7),与温度成负相关(r＝-0.492 63,Pr＝0.023 3),而与雨量相关性不明显。一年中病害的发生和流行有两个高峰,主峰出现在8～9月份,次峰出现在1月份左右。发病高峰一般出现在降水量高峰之后,二者间存在约一个月的时间差。     

橡胶树炭疽病菌rDNA-ITS区序列分析

应用核糖体rDNA-ITS区的序列分析研究18个不同地区来源的橡胶树炭疽病病原菌。结果表明:测试菌株的ITS扩增区(ITS3-ITS4)约为300bp,无太大的长度变异。ITS核酸序列聚类分析的结果表明:18个测试菌株被聚为2个类群,群与群之间差异不明显,2组之间同源率大约为99.3%,通过在NCBI网站的blast比对分析,结果显示2组均为胶孢炭疽菌(Colletrichum gloeosporioides)。     

橡胶炭疽病菌致病相关突变体的筛选及表型分析

通过对实验室已获得的1 685个橡胶炭疽病菌T-DNA插入突变体的生物学及致病性测定,从中筛选出15个致病力明显减弱的突变体,并进行PCR检测。结果表明,该基因组中均含潮霉素磷酸转移酶基因片段。在PDA培养基上,其中2个突变体菌落颜色异常,6个生长速率下降,8个产孢量显著降低,2个突变体分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞,在洋葱表皮上,侵染钉形成率显著降低。     

20种植物提取物对芒果炭疽菌的抑制作用

研究了16科20种（其中12种为中草药）植物的丙酮提取物对芒果炭疽病菌株的抑制作用,初步分析了利用植物源农药解决芒果炭疽病抗药性问题的可能性.结果表明,同一药物在不同浓度下作用效果可能存在较大的差异.芒果炭疽病抗药性菌株对供试植物丙酮提取物没有明显的抗药性,100mg/mL（每mL含100mg干物质的提取物）浓度下石菖蒲、艾草、阳春砂、益智、飞机草等植物在芒果炭疽菌抗药性菌株室内试验中其作用效果明显优于1000 mg/L多菌灵,其中石菖蒲丙酮提取物对芒果炭疽病菌敏感菌株（ZJS）、抗药性菌株（ZJR）有效中浓度EC50分别为5.91,4.06 mg/mL,艾草丙酮提取物对芒果炭疽病菌敏感菌株（ZJS）、抗药性菌株（ZJR）有效中浓度EC50分别为9.24,14.53 mg/mL.     

香茅醇不同旋光异构体对抑制茶炭疽病病菌活性的比较及其协同作用

采用菌丝生长速率法、Horsfall方法和共毒系数法测定了香茅醇不同构型对茶炭疽病病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的毒力以及两构型不同比例混配的协同效应。结果表明,右旋香茅醇和左旋香茅醇对茶树炭疽病菌的EC50分别为(113.27±0.95)mg·L^-1和(119.87±0.20)mg·L^-1。按照质量比1.6︰1将右旋香茅醇和左旋香茅醇混配,协同增效作用最高,共毒系数为130.19;质量比为1︰1.4和1︰3.8时,共毒系数分别为120.57和121.42,也具有协同增效作用。结果表明,香茅醇及两旋光异构体对抑制茶炭疽病菌具有良好的活性,将两者按一定比例混用后具有增效作用。