巴西橡胶树PEPRK基因家族成员的鉴定和表达分析

PEP羧化酶激酶相关激酶(PEP carboxylase kinase-related kinases,PEPRKs)是CDPK-Sn RK超家族的一员,目前对其生理功能尚不清楚。本研究以拟南芥和杨树的PEPRK序列作为探针,对橡胶树和其他5种植物(木薯、水稻、杨树、蓖麻和拟南芥)的基因组和转录组数据进行全面搜索,共鉴定得到25个PEPRK基因家族成员,其中包括5个橡胶树PEPRK基因,命名为Hb PEPRK1-5。序列分析发现橡胶树PEPRK和其他植物类似,在序列中部含有一个相对比较保守的激酶结构域,而两端的同源性相对较低。在基因结构和进化方面,PEPRK主要分为2个大的分支,相同分支的成员在结构域和内含子分布上更为相似,其中橡胶树和木薯PEPRK在进化上具有较近的亲缘关系。在基因的表达方面,Hb PEPRK1主要在稳定期的叶片中表达,Hb PEPRK2和Hb PEPRK5在树叶、树皮和胶乳中均有表达,Hb PEPRK4主要在种子中表达;另外,研究发现橡胶树PEPRK家族成员的表达还与叶片发育、乙烯利刺激、真菌侵染和低温胁迫具有一定的相关性。     

巴西橡胶树中碱性转化酶HbNINa基因的克隆和表达模式分析

检索橡胶树EST和基因组数据库,发现了1个在叶片中高丰度表达的中碱性转化酶基因.采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因的cDNA和基因组序列,命名为Hb NINa.序列分析结果显示,HbNINa基因cDNA序列的编码区(CDS)序列长度为1 719 bp,对应的基因组序列为3 696 bp.序列分析表明,该基因编码571个氨基酸多肽,推测其分子量大小为65.7 ku,等电点为6.36.HbNINa蛋白包含植物中碱性转化酶的全部保守结构域.基因组结构分析显示Hb NINa基因包含4个外显子和3个内含子.QPCR分析结果表明,HbNINa基因在在胶乳中表达水平极低,而在其他组织如树皮、树叶和雌花中的表达丰度相对较高.在叶片发育过程中,Hb NINa在叶片发育的初期高丰度表达,推测HbNINa可能参与叶片蔗糖利用,进而在橡胶树叶片发育过程中起重要作用.     

巴西橡胶树HbSAP1基因克隆及表达分析

胁迫相关蛋白(Stress associated proteins,SAPs)在植物免疫应答和胁迫反应中发挥着重要作用。采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法,从巴西橡胶树中分离胁迫相关蛋白基因Hb SAP1。结果表明:Hb SAP1基因的开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸。Hb SAP1蛋白预测分子量为18.87 ku,等电点为7.98,具有典型的A20和AN1锌指结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,Hb SAP1基因在巴西橡胶树各组织中均有表达,以茎尖中的表达量最高。同健康橡胶树相比,Hb SAP1基因在死皮橡胶树胶乳和树皮中的表达量显著升高。伤害、H2O2、乙烯利及茉莉酸甲酯处理均能使胶乳中Hb SAP1基因的表达上调。低温及PEG诱导的干旱胁迫下,Hb SAP1基因在叶片中的表达显著增强。上述结果表明,Hb SAP1基因可能在橡胶树死皮发生、非生物胁迫应答、乙烯及茉莉酸信号转导中发挥重要调控作用。     

巴西橡胶树HbMlo8基因的功能研究

Mlo基因是植物体内具有负向调控功能的一类基因。为揭示Hb Mlo8基因在橡胶树中的功能,分析了该基因在巴西橡胶树不同组织中的表达情况,在机械损伤、干旱、白粉菌侵染、ABA、ETH、JA和H_2O_2处理下的表达模式。结果表明:Hb Mlo8基因在橡胶树的树皮、胶乳、花和叶中均有表达,主要在树皮和花中表达。机械损伤、干旱、白粉菌侵染均会使Hb Mlo8在橡胶树叶片中的表达量显著上调。橡胶树叶片中Hb Mlo8基因在ETH处理早期下调表达,处理10 h后开始显著上调。在ABA、H_2O_2和JA处理下,Hb Mlo8基因均呈现下调表达现象。说明Hb Mlo8可能参与橡胶树对白粉菌和非生物胁迫的响应过程以及激素信号转导路径,为阐明Hb Mlo8基因在橡胶树生长和逆境响应机制中的功能研究打下良好基础。     

巴西橡胶树葡萄糖/核糖醇脱氢酶基因的克隆和表达分析

割胶显著刺激新开割橡胶树胶乳产量,前期的比较蛋白质组学的研究中,已通过双向电泳的方法分离到一个随割胶下调的葡萄糖/核糖醇脱氢酶(GRDH,glucose/ribitol dehydrogenase)。通过搜索本实验室的橡胶树EST数据库和PCR扩增得到该蛋白点对应的全长c DNA序列并命名为Hb GRDH1。序列分析显示,c DNA的编码序列(CDS)为882 bp,推测编码294个aa,分子量大小为32.2 ku,等电点为5.18,基因组序列包含4个外显子和3个内含子。通过Realtime PCR和Solexa高通量转录组测序分析发现,Hb GRDH1主要在胶乳和雌花中表达,在叶片发育稳定期呈现明显的下调表达趋势;在新开割树胶乳中,前4刀该基因表达变化不明显,而第5刀开始呈现上调表达趋势;在胶乳中,乙烯利处理对该基因表达前12 h无明显影响,在24 h时呈明显的下调表达。本研究结果有助于进一步阐明橡胶树中Hb GRDH1基因的功能,特别是其参与橡胶树胶乳再生调控的分子机理。     

橡胶树羟基腈水解酶基因的克隆、表达和基因家族分析

植物体内羟基腈水解酶(HNL)催化羟基腈类化合物水解,释放氢氰酸,抵御害虫和病原菌的侵害。橡胶树是产氰植物,生物信息学研究表明,橡胶树有6个HNL基因,在分子进化分析中与大戟科其他植物的HNL基因聚为一类,与十字花科等植物的HNL亲缘关系较远,说明大戟科HNL基因的重复发生在与十字花科等植物分化之后,大戟科植物通过HNL基因的重复强化对病虫害的防御作用。通过RT-PCR从橡胶树热研7-33-97品系中克隆了其中最重要的1个HNL蛋白编码基因Hb HNL-1。该基因c DNA序列全长1 003 bp,阅读框771 bp,编码257个氨基酸,其编码蛋白分子量为29.2 ku,理论等电点为5.7。定量PCR分析表明,Hb HNL-1在初生胶乳中的表达量是次生胶乳中的100多倍,在幼嫩叶片中的表达量为成熟叶片的8倍。说明橡胶树的幼嫩组织器官是Hb HNL-1的重点防御部位。     

巴西橡胶树中2个NADP-苹果酸酶基因的克隆和表达特性分析

从橡胶树中克隆2个NADP-ME(苹果酸酶)基因的全长cDNA,分别命名为HbNADP-ME1和HbNADP-ME2。HbNADP-ME1和HbNADP-ME2 cDNA全长分别为2 428、2 139 bp,分别编码643、593个氨基酸组成的蛋白,二者的氨基酸序列一致性高达87.25%,且分别与蓖麻和杨树的一个NADP-ME序列具有较高的序列一致性。2个HbNADP-ME蛋白都含有典型的植物NADP-ME蛋白的保守结构域,均富含亮氨酸(Leu),同属于非分泌型稳定蛋白。2个HbNADP-ME基因在橡胶树不同组织中的表达存在明显差异,在根中的表达量最高,种子和花中的表达量次之;另外,HbNADP-ME1基因在胶乳中受机械伤害有下调表达趋势,HbNADP-ME2基因在胶乳中受割胶处理也表现出下调表达趋势,而低温胁迫则显著诱导2个基因在叶片和根中的表达。结果说明,HbNADP-ME基因可能参与橡胶树的抗逆应答及代谢调控(包括胶乳代谢调控)。此结果为深入揭示橡胶树中NADP-ME基因的功能奠定了基础。     

橡胶树5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的克隆及其响应非生物胁迫的表达分析

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)是植物合成芳香族氨基酸的一个重要酶,与许多抗逆相关的次生代谢物的合成有关.本研究利用RACE技术从橡胶树热研7-33-97中获得了全长为2025 bp的HbEPSPS基因cDNA序列,开放阅读框为1572 bp,编码523个氨基酸;使用ProtParam tool预测该基因编码的蛋白质分子量为56.01u,等电点(pI)为7.91.该基因由8个外显子和7个内含子构成,全长4600 bp.实时荧光定量PCR结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树叶片、皮、花、胶乳和胚中均表达,其中以叶片中的表达量为最高.激素、干旱、盐和低温等非生物胁迫都能诱导HbEPSPS基因表达量上调,其中茉莉酸甲酯、乙烯和PEG的上调作用最为显著.橡胶树HbEPSPS基因的克隆及其在非生物胁迫下的表达调控研究将为橡胶树抗逆相关的研究提供理论依据.     

巴西橡胶树膜联蛋白基因家族成员的鉴定和表达分析

膜联蛋白是一个多基因家族,在植物逆境胁迫应答和生长发育等方面起重要作用。本研究以已发表的膜联蛋白氨基酸序列为探针,对橡胶树和其他5种植物的转录组和基因组进行搜索,鉴定得到14个橡胶树膜联蛋白基因家族成员,命名为Ann Hb1-Ann Hb14。基因结构分析发现,14个家族成员的内含子数目为3~6个,结构域的数目为2~4个。在进化上,橡胶树、木薯和蓖麻共3种大戟科植物的膜联蛋白具有较近的亲缘关系。表达方面,Ann Hb1在各组织中普遍表达,而Ann Hb6和Ann Hb7主要在胶乳中表达,Ann Hb10、Ann Hb8和Ann Hb13分别在树叶、树皮和雄花中特异表达,其他成员在各组织中低丰度表达或不表达;部分家族成员的表达还与叶片发育、乙烯利刺激、真菌侵染和低温胁迫等具有一定相关性。     

巴西橡胶树HbCYP450基因克隆与表达分析

细胞色素P450氧化酶催化植物初生代谢和次生代谢等多种类型的氧化还原反应。本研究在橡胶树叶片中克隆得到一个CYP450基因,编码516个氨基酸,在3~511位氨基酸序列间存在一个P450超级保守结构域,且存在特征性的血红素结合位点保守序列,与蓖麻、胡杨、毛杨果和大豆CYP450的序列一致性分别为74%、68%、68%和65%。Hb CYP450基因在橡胶树的叶片、花和胶乳中均表达,但在树皮中不表达。该基因的表达量受干旱、机械伤害和白粉病的诱导,在植物激素吲哚乙酸(IAA)、茉莉酸(JA)、乙烯利(ET)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)和过氧化氢(H_2O_2)作用下,Hb CYP450基因表达量呈现先显著上升后显著下降的规律。说明Hb CYP450是植物P450家族成员,其表达量受白粉菌和逆境诱导。     

巴西橡胶树6个小G蛋白基因cDNA的克隆与序列分析

利用笔者实验室建立的橡胶树胶乳EST序列数据库,结合RT-PCR和RACE技术,克隆巴西橡胶树6个小G蛋白基因的cDNA,并以拟南芥小G蛋白家族基因为模板进行进化树分析.结果表明:所克隆的基因分属于小G蛋白的Arf与Rab家族,将其分别命名为HbArfl、HbArf2、HbRab1、HbRab2、HbRab3和HbRab4.氨基酸序列分析发现,HbRab1、HbRab2、HbRab3和HbRab4均具有小G蛋白家族的保守结构域,即4个鸟苷酸(GTP/GDP)结合域、1个效应区和C端半胱氨酸结构域,而HbArf1和HbArf2除在C端无半胱氨酸结构域及效应区序列保守性差外,HbArf1还缺少2个鸟苷酸结合区,HbArf2缺少1个鸟苷酸结合区.     

巴西橡胶树一个新的法尼基焦磷酸合酶基因的克隆及表达分析

利用同源克隆的方法在橡胶树中获得一个新的法尼基焦磷酸合酶基因,命名为Hb FPS2。序列分析显示,Hb FPS2基因组序列长4 171 bp,由12个外显子和11个内含子组成,c DNA全长1 288 bp,包含1 029 bp的开放阅读框、105 bp的5′-UTR和154 bp的3′-UTR,编码342个氨基酸,推测分子量为39.6 ku,等电点为5.27。氨基酸序列比对显示,Hb FPS2具有FPS家族保守的5个结构域。进化分析结果表明,Hb FPS2和Hb FPS1亲缘关系最近,与大戟科的蓖麻、大戟、麻风树法尼基焦磷酸合酶聚为一个亚类。定量PCR结果表明,Hb FPS2在橡胶树根、树皮、叶、花和胶乳等组织中均有表达,在花和胶乳中表达量较高,在根中表达量最低;茉莉酸和乙烯处理均能提高Hb FPS2基因的表达量,处理9 h时基因表达量分别提高了36倍和8倍。结果为分析法尼基焦磷酸合酶基因表达特性及其在天然橡胶生物合成途径中的作用机制奠定基础。     

巴西橡胶树CCaMK基因家族成员的鉴定和表达分析

钙/钙调素依赖型蛋白激酶(CCaMK，calcium- and calmodulin-dependent protein kinase)是一种钙离子结合蛋白，在钙信号传导过程中起重要作用。本研究以已发表的CCaMK序列作为检索序列，对橡胶树和其他5种植物(木薯、水稻、杨树、蓖麻和拟南芥)的基因组和转录组数据进行全面搜索，鉴定得到6个CCaMK基因，其中包括一个橡胶树CCaMK基因，命名为HbCCaMK1。序列分析发现：5种植物的CCaMK氨基酸序列同源性较高，为73%～94%。基因结构分析发现，HbCCaMK1和所分析的其他植物CCaMK一样均，含有6个内含子、1个蛋白激酶结构域和3个EF-hand结构域；从结构和进化上看，HbCCaMK1和蓖麻、木薯2种植物的CCaMK具有较近的亲缘关系；在表达方面，HbCCaMK1在橡胶树根中表达丰度最高，其次为树叶和花；另外，HbCCaMK1的表达还与叶片发育、真菌侵染和低温胁迫有关。     

橡胶树PGAM基因的克隆及表达特性分析

从橡胶树中克隆并获得磷酸甘油酸变位酶基因（HbPGAM），该基因的cDNA序列全长1 559 bp，包含长度为1 260 bp的完整开放阅读框，编码一个由419个氨基酸残基组成的蛋白，氨基酸同源性分析发现，该蛋白含有保守的磷酸变构酶组氨酸磷酸酶结构域，属于磷酸甘油酸变位酶。生物信息学分析显示，HbPGAM蛋白无导肽酶切位点，不具有跨膜结构域且为亲水蛋白，该蛋白可能在细胞质中发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明，HbPGAM基因在分析的7种组织中均表达，但在胶乳（产胶细胞乳管的细胞质）中的表达水平最高，且该基因在胶乳中的表达受割胶影响，推测其参与橡胶树胶乳再生过程。此外，HbPGAM基因表达受部分植物激素如乙烯利ET、植物生长素2,4-D及水杨酸SA调控，但调控不明显。结果说明，胶乳再生过程中HbPGAM对胶乳糖酵解起到一定的调控作用，为全面了解橡胶树PGAM家族奠定理论基础。     

巴西橡胶树PPCK基因家族成员的鉴定和表达分析

以已发表的PPCK序列为探针,对橡胶树和其他5种植物(木薯、水稻、杨树、蓖麻和拟南芥)的转录组和基因组进行全面搜索,鉴定得到17个PPCK基因,其中包括3个橡胶树PPCK基因,命名为Hb PPCK1-3。序列分析发现,Hb PPCK1-3和其他植物一样在结构上非常保守,只有一个内含子和一个蛋白激酶结构域,并且相对位置也比较一致。在进化上,橡胶树、木薯和蓖麻3种大戟科植物的PPCK蛋白具有较近的亲缘关系。Hb PPCK3在树皮中表达丰度最高,其次是种子和雄花;Hb PPCK2在胶乳和根中表达丰度相对较高,而Hb PPCK1在各组织中的表达都比较低。另外,大部分家族成员的表达都受到真菌侵染、低温和干旱胁迫处理的诱导,而乙烯利处理却能抑制Hb PPCK2的表达。     

二个巴西橡胶无性系花药体细胞植株胶乳的生理特性

对生长在系比区内的2个巴西橡胶无性系的花药体细胞植株进行了产量和生理特性的初步观察。试验结果表明,海垦2花药体细胞植株的第一割年的产量高于供体无性系45.2％,与胶乳再生和排胶有关的10项生理参数的分析都显示其具有与高产相适应的生理基础。海垦1花药体细胞植株的产量高于供体无性系20.6％,然而此产量主要是通过胶乳严重长流获得的。此植株胶乳蔗糖和干胶含量极低,胶树对乳管供应蔗糖严重不足,因而胶乳再生极端不良。供体无性系原有的干胶含量偏低和胶乳长流等不良性状在其花药体细胞植株中更为明显。     

橡胶芽接树砧木与接穗在生化上的相互影响

以橡胶树自根无性系海垦2和热研88-13自接和互接组成的芽接树为材料,在不同割胶条件下,采用PAGE和SDS-PAGE技术,分析了砧木和接穗的胶乳酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶以及可溶性蛋白等生化因子。结果表明:砧木和接穗之间在酯酶同工酶谱C区存在显著的相互影响,这种影响不因割胶时间和乙烯利刺激而变化:自接和互接树之间的过氧化物酶同工酶谱和可溶性蛋白图谱均表现一致,未观测到砧木与接穗之间在这2种图谱上的相互影响。      

巴西橡胶树胶乳中4种植物生长物质的测定

采用酶联免疫检测技术和气相色谱法测定了巴西橡胶树胶乳中生长素(IAA)、细胞分裂素(iPAs)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)等4种植物生长物质的含量。结果表明:利用酶联免疫检测技术可检测到巴西橡胶树胶乳中含有较多的IAA,iPAs,ABA。采用气相色谱法(TraceGC气相色谱仪和GC-9V气相色谱仪)可检测到用乙烯利刺激割胶的成年割胶树胶乳中的ET,但在未开割幼树胶乳中未能检测到内源ET。在巴西橡胶同一茎段一定长度范围内,不同的采胶位置IAA,、ABA含量的差异不显著,表明它们量的分布没有位置效应。      

巴西橡胶树叶绿体型果糖-1,6-二磷酸酶基因的全长cDNA克隆与表达分析

利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆到一个叶绿体型FBPase基因,命名为HbcpFBPase。该基因的c DNA全长为1 512 bp,包含1 209 bp的开放阅读框,编码一个由402个氨基酸残基组成的蛋白,蛋白分子量大小约为43.88 ku,理论等电点为6.64。多重序列比对表明该基因为叶绿体型果糖-1,6-二磷酸酶。Target P软件预测HbcpFBPase在叶绿体中的概率是0.961。实时荧光定量PCR分析表明,HbcpFBPase基因在雌花中表达量最高,雄花及种子次之;此外,机械伤害和割胶以及多种植物激素如乙烯利ET及植物生长素2,4-D可使HbcpFBPase基因下调表达。研究结果对进一步研究橡胶树光合作用碳固定、以及深入研究光合作用与胶乳合成之间的关系提供理论参考。