牙鲆变态发育过程中epigen基因的空间表达分布

细胞分裂在鲽形目鱼类变态过程中发挥了重要作用。Epigen作为表皮分裂原,通过激活MAPK通道来调控有丝分裂。以前的研究利用定量PCR表明,epigen在变态前期表达量升高,而变态后期表达量下降,表明其与变态发育相关。为了进一步调查epigen与牙鲆变态发育的关系,利用RNA整体原位杂交技术检测了epigen在变态期牙鲆体内的空间表达分布,发现在变态期的各个阶段,epigen基因表达分布均比较广泛,表皮、鳃、肝脏、肠道、鳍条、支鳍骨、肌节等组织都有表达,在牙鲆变态前和变态早期(E期)信号较强,而在变态高峰期(F期和G期)和变态后期(H期)信号逐渐变弱。Epigen空间表达分布模式提示,其作为表皮分裂原,可能广泛参与牙鲆变态发育早期事件,尤其可能与肝脏、肠道、支鳍骨和鳍条的发育有关。     

甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异

为了探讨甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异,以及甲状腺激素T4和硫脲处理对TRαA基因表达的影响,采用了半定量RT-PCR法测定牙鲆不同发育阶段头部甲状腺激素受体TRαA mRNA水平。结果显示,牙鲆不同变态发育阶段甲状腺激素受体TRαA基因表达存在明显差异,从受精卵到变态期TRαA表达量呈缓慢增加趋势,到24日龄出现第一个表达高峰,随后表达量下降,30日龄之后随日龄增加表达量又逐渐增加,至变态高峰期38日龄出现第二个表达高峰,而且高于第一个表达高峰,至成鱼表达量再次下降至较低水平。甲状腺激素T4处理组和硫脲处理组与同日龄正常组相比,TRαA的表达也有明显差异,在甲状腺激素T4处理组中TRαA表达降低,而在硫脲处理组中TRαA表达反而增高。甲状腺激素T4对变态期牙鲆TRαA基因转录可能有下降调节作用。     

甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异

为了探讨甲状腺激素受体TRαA基因在牙鲆不同变态发育阶段中的表达差异,以及甲状腺激素T4和硫脲处理对TRαA基因表达的影响,采用了半定量RT-PCR法测定牙鲆不同发育阶段头部甲状腺激素受体TRαA mRNA水平。结果显示,牙鲆不同变态发育阶段甲状腺激素受体TRαA基因表达存在明显差异,从受精卵到变态期TRαA表达量呈缓慢增加趋势,到24日龄出现第一个表达高峰,随后表达量下降,30日龄之后随日龄增加表达量又逐渐增加,至变态高峰期38日龄出现第二个表达高峰,而且高于第一个表达高峰,至成鱼表达量再次下降至较低水平。甲状腺激素T4处理组和硫脲处理组与同日龄正常组相比,TRαA的表达也有明显差异,在甲状腺激素T4处理组中TRαA表达降低,而在硫脲处理组中TRαA表达反而增高。甲状腺激素T4对变态期牙鲆TRαA基因转录可能有下降调节作用。     

鸡let-7b在不同生长时期及不同组织中的表达及其生物信息学分析与靶基因预测

为探究let-7b在鸡不同生长时期和不同组织中的表达规律及生物信息学特点,以苏禽3号肉鸡为试验材料,检测鸡let-7b在不同时期和不同组织中的表达变化,通过生物信息学工具对常见脊椎动物的let-7b序列特点及基因组定位进行分析,构建系统进化树,并对靶基因进行预测。结果表明,在鸡大脑、心、胸肌和腿肌中,let-7b的相对表达量较高,且90日龄相对表达量显著高于3日龄。let-7b位于1号染色体基因间隔区,不同物种let-7b的成熟序列同源性较高,进化树分析结果表明,鸡let-7b与鸟类聚为一类。靶基因预测分析共获得263个靶基因,对获得的靶基因进行基因本体(GO)功能富集分析,发现靶基因主要富集到蛋白质泛素化、miRNA介导的翻译抑制和mRNA 3′-非翻译区(3′-UTR)结合等方面。KEGG通路分析发现,靶基因主要富集到丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、转化生长因子β(TGF-β)通路和卵母细胞减数分裂等通路。总之,鸡let-7b在组织中广泛表达,物种间较为保守;结合靶基因富集分析结果,推测let-7b可能通过靶向MAPK和TGF-β等信号通路参与调控鸡肌肉生长及细胞增殖分化。     

Tbx5基因在牙鲆变态初期的表达

鲽形目鱼类仔鱼经过变态后形成眼睛和偶鳍等器官左右不对称的稚鱼。Tbx家族成员参与脊椎动物心脏、肢体和眼等器官的发育,而Tbx基因与鲽形目鱼类变态的关系目前尚无报道。运用扫描电镜和软硬骨染色等方法对出膜后2 d（变态早期）和26 d（变态前期）的牙鲆仔鱼的形态进行观察,牙鲆出膜后2 d胸鳍原基出现,出膜后26 d胸鳍发育成熟,而在出膜后26 d胸鳍和腹鳍仍左右对称。我们克隆了牙鲆Tbx5基因的CDS序列,该序列编码的多肽具有部分T-box保守结构域,与斑马鱼Tbx5同源性高达93%。系统进化分析显示：这段CDS序列与硬骨鱼的Tbx5基因聚为一支,但与四足动物Tbx5相分离。整体原位杂交显示出膜后26 d的牙鲆仔鱼中,Tbx5基因不仅在胸鳍、眼背侧、脊柱和尿囊表达,且在胸鳍和眼背侧的表达呈现左右不对称,左侧面（有眼侧）的表达量均高于右侧面（无眼侧）的表达量。综上结果显示,牙鲆Tbx5基因可能参与了变态过程中眼睛与胸鳍左右不对称的形成。     

牙鲆ras-2基因cDNA全长的克隆和变态时期的表达分析

Ras主要参与表皮生长因子家族调控细胞分裂的信号通路。采用末端快速扩增法获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)ras-2基因全长2 384 bp cDNA序列,该序列编码187个氨基酸,含有switchⅠ、switchⅡ、P loop、CAAX box等Ras家族的结构特征,与川鲽(Paralichthys olivaceus)ras-2氨基酸序列相似性最高(96.3%)。定量RT PCR检测显示ras-2基因在牙鲆成体的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、鳃、肠、肌肉、鳍条和皮肤组织均有不同程度的表达,其中鳍条表达量最高,肌肉的表达量最低;在牙鲆变态前和变态初相对表达量较高,随着变态进行,表达水平显著降低。牙鲆变态阶段的RNA整体原位杂交结果显示ras-2基因主要在鳍条、眼眶周围、颌、鳃、鼻孔、侧线等部位的表皮组织中表达,变态前在鳍褶和体侧线表达信号最强,变态阶段E期的信号稍微减弱,主要分布在支鳍骨和鳃,变态高峰期（F期和G期）信号主要集中在支鳍骨、鳃和颌,H期表达信号主要集中在鳃和支鳍骨。ras-2基因表达式型表明其可以通过调控细胞分裂的方式,参与牙鲆变态过程中眼睛移动、冠状幼鳍发育、侧线发育等多种器官的发育调控。     

牙鲆早期发育和变态期间Pitx2基因的表达

Pitx2基因被认为是脊椎动物中调节内脏器官左右不对称的关键转录因子。为进一步探讨牙鲆变态期间的左右不对称是否也受Pitx2的左特异活性调节,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),拟在变态的牙鲆的头部组织中克隆编码Pitx2基因的部分cDNA序列,并通过以18s rRNA为内标的半定量RT-PCR研究其在牙鲆早期发育和变态期间的表达情况。克隆和测序的结果表明Pitx2在牙鲆早期发育和变态期间也存在基因表达;而半定量的结果表明它的左特异性功能很可能在变态的早期阶段发挥作用。但是,牙鲆变态期间的右眼移动是否受Pitx2的左特异活性调控,以及变态期间的左右不对称和内脏器官的左右不对称是否拥有相同的分子机制,仍需进一步研究。     

牙鲆胚后发育阶段HDAC1基因的空间表达

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)可通过调节染色质结构和抑制特异性转录因子活性来调控细胞生长和分化。鉴于HDACs在蝌蚪变态发育过程中的作用,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)HDAC1基因全长cDNA序列,并调查了其在牙鲆变态前和变态阶段的空间表达。牙鲆HDAC1全长cDNA序列为2 540 bp,包含长度为126 bp的5'UTR,1 470 bp的ORF和944 bp的3'UTR。HDAC1基因在牙鲆变态前以及变态阶段均有表达,这和蝌蚪中仅在变态前表达的现象不同。HDAC1在冠状幼鳍上的表达是随着幼鳍原基的生长发育逐渐增强的,直至冠状幼鳍分化成形后,基因表达减弱;随着牙鲆仔鱼肠道的变粗变短,HDAC1在肠壁的表达强度逐渐增强,孵化后第16天(16DAH)开始减弱并最终消失;鳍褶中HDAC1在9DAH开始表达,18DAH时主要在鳍褶基部表达,进入变态阶段,HDAC1可见在支鳍骨上表达,在变态高峰期表达最为强烈。在整个变态发育期HDAC1在鳃上均表达,变态开始后表达逐渐增强,而到变态后期表达减弱。牙鲆变态前及变态阶段的HDAC1基因表达模式表明,HDAC1参与了牙鲆冠状幼鳍、鳍条、肠道等多种器官的发育调控以及变态阶段眼睛移动的过程。     

牙鲆epigen基因的克隆以及在变态过程中的表达

为了调查表皮细胞分裂原epigen基因是否与牙鲆变态发育有关,分析了从变态期牙鲆仔鱼cDNA文库中测序得到的epigen基因。发现epigen基因编码162个氨基酸,具有信号肽序列,一个跨膜结构域和EGF-like结构域。EGF-like结构域包含有可形成3个二硫键的6个半胱氨酸残基,是表皮生长因子家族的结构特征。此外,利用荧光实时定量RT-PCR,调查了epigen基因在牙鲆眼睛移动过程中的变化。相比眼睛移动之前(17DAH,day after hatching),epigen基因在眼睛移动初期(19DAH)表达明显增强,为17DAH时的2.363倍;而在眼睛移动过程的高峰期(23DAH),表达量明显回落,相对19DAH的表达量降低了80%;变态结束后(27DAH)epigen基因的表达没有重新增强或进一步的回落,提示epigen基因可能与眼睛移动初期的变态发育事件有关,而与变态高峰期和变态后期的发育事件关系不明显。     

牙鲆lin-29基因的全长cDNA克隆、鉴定及其在早期发育中的表达分析

通过PCR技术,从牙鲆(Paralichtys olvaceus)总RNA中获得牙鲆lin-29基因c DNA序列,该序列全长1 769 bp,包括1 329 bp开放阅读框,编码442个氨基酸,预测其是一种多锌指结构蛋白;氨基酸序列对比分析显示,牙鲆LIN-29与大黄鱼(Larimichthys crocea)的同源性最高,达95.25%;系统进化树分析表明,牙鲆与其他鱼类聚集一支,并且与罗非鱼的进化关系最近。荧光定量PCR显示,在牙鲆胚胎和仔鱼发育阶段,以原肠胚期lin-29表达量最高;组织表达分析表明,脑中表达最高,肌肉中最低。外源甲状腺激素(TH)在牙鲆仔鱼发育初期(TH处理后2 d、5 d)下调lin-29表达,TH处理后21 d(36 dph)和26 d(41 dph)上调lin-29基因表达,同时,硫脲(TU)处理均显著上调lin-29表达。结果显示牙鲆lin-29基因可能在牙鲆早期发育过程中扮演着重要的角色,为进一步研究lin-29在牙鲆生长发育中的功能奠定基础。     

牙鲆纤维蛋白原相关蛋白(FREP1)基因的克隆和表达分析

利用RACE-PCR技术获得了牙鲆FREP1(fibrinogen-related protein)基因1 131 bp cDNA全长序列,其中开放阅读框786 bp,所编码的蛋白C端含有纤维蛋白样结构域标签(WWYSRCGSAGLNG).RNA整体原位杂交检测发现只在孵化后2d和5 d(2 dph、5 dph)仔鱼的肠道中有FREP1基因表达,而在9 dph和13 dph仔鱼胸鳍、肠道、鳃和皮肤中均有表达.荧光定量PCR检测显示该基因主要在成鱼的肠、鳃、皮肤和鳍条上表达,而脾脏、心脏、肾脏、肝脏和肌肉表达量很低或没有表达.鳍条和皮肤较其他组织均有极显著差异(P＜0.01),鳃和肠相比其他组织具有显著差异(P＜0.05).由于该基因主要在鳍条、皮肤、肠和鳃中表达,提示FREP1基因可能和牙鲆先天性免疫相关.研究亮点:FREP在鱼类免疫方面的报道很少,本研究所克隆的牙鲆FREP1,不管是牙鲆仔鱼还是成鱼,其仅在与外界直接接触的皮肤、鳃、肠道等组织中表达,提示其与牙鲆的先天免疫相关.     

牙鲆早期发育和变态期间Pitx2基因的表达(英文)

Pitx2基因被认为是脊椎动物中调节内脏器官左右不对称的关键转录因子。为进一步探讨牙鲆变态期间的左右不对称是否也受Pitx2的左特异活性调节,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),拟在变态的牙鲆的头部组织中克隆编码Pitx2基因的部分cDNA序列,并通过以18s rRNA为内标的半定量RT-PCR研究其在牙鲆早期发育和变态期间的表达情况。克隆和测序的结果表明Pitx2在牙鲆早期发育和变态期间也存在基因表达;而半定量的结果表明它的左特异性功能很可能在变态的早期阶段发挥作用。但是,牙鲆变态期间的右眼移动是否受Pitx2的左特异活性调控,以及变态期间的左右不对称和内脏器官的左右不对称是否拥有相同的分子机制,仍需进一步研究。     

牙鲆EST资源的SSR信息分析

应用生物信息学方法,对牙鲆EST-SSRs的分布频率及碱基重复特点进行了归纳与分析。结果表明,5 927条牙鲆非冗余EST序列通过在线搜索共检索出471个SSRs,分布于390条EST中,出现频率为7.95%,平均分布距离为7.9 kb。包括了112种重复基元,其中二核苷酸重复基元占主导地位,占总SSR的59.02%。AC是二核苷酸中的优势基元,占二核苷酸重复类型的16.91%。三核苷酸重复基元、四核苷酸重复基元和六核苷酸重复基元分布比较分散,三核苷酸重复基元中GAG数量最多,但仅占三核苷酸重复类型的7.26%。研究结果为牙鲆EST-SSR标记的开发及应用奠定了理论基础。     

牙鲆继饥饿后的摄食和生长的研究

对牙鲆Paralichthys olivaceus（体重5.93 g±1.20 g）继饥饿后的摄食和生长进行了研究。牙鲆饥饿5d（S5）、10 d（S10）和15 d（S15）后恢复喂食20 d,对照组持续喂食20 d,测定恢复喂食期间牙鲆的摄食率（FR）、食物转化效率（FCE）、吸收率（AE）和排粪率（DR）,同时测定饥饿和恢复喂食期间牙鲆的全长、体重、特定生长率（SGR）、比肝重（HSI）、肝胰脏和肌肉中的RNA/DNA。结果表明：恢复喂食过程中,牙鲆的FR先升高后下降,而FCE则均先下降后升高;S5和S10组牙鲆的总吸收率（TAE）高于对照组,而S15组则低于对照组;S5组牙鲆的全长和体重接近对照组,而S10和S15组则不如对照组;饥饿处理组牙鲆的SGR在恢复喂食后先升高后降至对照组水平;饥饿时间越长,牙鲆的HSI越小,在恢复喂食过程中HSI逐渐接近对照组;饥饿时间越长,肝胰脏和肌肉中的RNA/DNA越小,在恢复喂食过程中RNA/DNA迅速升高,接近或超过对照组;在20 d的恢复喂食过程中,S5组出现完全补偿生长,S10和S15组出现部分补偿生长。研究表明,牙鲆在恢复喂食过程中,通过先提高FR后再提高FCE的方式产生补偿生长。     

雌核发育牙鲆家系的生长比较和形态分析

跟踪测定9个雌核发育牙鲆Paralichthys olivaceus家系后裔150、240、360 d时的生长资料,对体重、体长、绝对增重率、绝对增长率和体型指数（头长/体长、尾柄长/尾柄高）进行方差分析,对体重和体型指数进行相关分析,并建立了体重-体长的回归方程。结果表明：家系C11847的体重、体长及头长/体长与尾柄长/尾柄高指标在各阶段均有明显的生长优势,可作为重点家系加强选育。不同生长阶段绝对增重率和绝对增长率最优家系不一致,且家系间的生长差异主要发生在240 d前。各日龄体型指数均与体重呈极显著负表型相关（P〈0.01）。不同日龄体型指数间差异显著（P〈0.05）。雌核发育牙鲆的体重与体长之间呈曲线相关关系,且该关系在不同日龄间无显著差异（P〉0.05）。     

牙鲆正常个体与白化个体脂肪酸组成的比较

采用毛细管色谱法对牙鲆Paralichthysolivaceus正常个体和白化个体肌肉、皮肤和肝脏的脂肪酸组成及含量进行了检测。结果表明:两者相对应组织的脂肪酸种类没有区别,但脂肪酸的含量存在若干差异。1)两者肌肉的脂肪酸组成基本相似,特征为多不饱和脂肪酸(PUFA)>饱和脂肪酸(SFA)>单不饱和脂肪酸(MUFA),PUFA以n-3系列为主,但两者肌肉中有13种脂肪酸的含量差异显著(P<0 05),正常个体PUFA含量显著高于白化个体(P<0 05),而MUFA含量显著低于白化个体(P<0 01);2)两者皮肤中有7种脂肪酸的含量差异显著(P<0 05),正常个体SFA含量显著高于白化个体(P<0 01),而PUFA和MUFA的含量,两者差异均不显著(P>0 05);3)两者肝脏中只有3种脂肪酸的含量差异显著(P<0 05);4)正常个体的n-3/n-6比值高于白化个体,尤其在肌肉和肝脏中。     

牙鲆稚鱼对几种化学消毒剂的敏感性研究

研究了6种化学消毒剂对牙鲆Paralichthys olivaceus稚鱼的最低致死浓度范围、死亡速度、半致死浓度（LC50）和安全浓度。牙鲆稚鱼对6种化学消毒剂的敏感性依次为：孔雀石绿＞次氯酸钠＞二氧化氯＞净水剂1号＞硫酸铜合剂＞高锰酸钾。依据本试验结果，作者对牙鲆疾病防治中消毒剂的使用进行了探讨。