半巢式RT-Realtime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系

马铃薯Y病毒脉坏死株系(Potato virus Y,PVYn)是马铃薯中一个非常重要的病毒病害.本文根据PVYn基因组中RNA依赖的RNA聚合酶基因序列保守区域,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式RT-Realtime PCR检测PVYn的新方法.该方法采用E.Z.N.ATM陕速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术.第二步半巢式RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Real time PCR等方法高.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达4fg/μL植物总RNA.     

RT-PCR快速检测3种烟草病毒技术

为了快速提取植物叶片的总RNA,并对烟草病毒进行检测,对提取及检测方法进行了研究.结果表明:以黄瓜叶片、白肋烟叶片为试材,用TRIzol试剂盒在1 h内提取到纯度高、完整性好的总RNA.设计烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒的特异性引物,RT-PCR检测,从感病叶片中分别扩增出313,326,392 bp的目的片断,而健康叶片中无此扩增带.构建这3种病毒重组质粒,对核苷酸序列与GeneBank中报道的进行比较,同源性分别为99.36%,97.55%,98.21%.用这种方法快速、可靠,为烟草病毒的检测提供科学依据.     

马铃薯X病毒25 kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究

以马铃薯X病毒（potato virus X,PVX）的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法分别扩增出长度为681 bp的非翻译马铃薯X病毒25 kD运动蛋白基因（PVX-p25）和长度为714 bp的非翻译马铃薯X病毒外壳蛋白基因（PVX-CP）。并分别构建植物表达载体pROKⅡ-p25和pROKⅡ-CP。利用农杆菌介导方法转化烟草NC89。经卡那霉     

应用焦磷酸测序鉴定马铃薯感染的马铃薯Y病毒株系

为了检验是否可以通过焦磷酸测序法进行短序列测序,来鉴别马铃薯Y病毒(PVY)株系,从NCBI库中选取了代表9个PVY株系的全基因组序列30个,通过比对P1和CP蛋白的氨基酸序列,分别找出一个差异区段,针对这2个区域设计了反转录引物、PCR引物和测序引物。分别从黑龙江省克山县和讷河市各采集了一份马铃薯病叶样品,通过提取总RNA,反转录,再进行PCR扩增获得扩增产物,并对扩增产物进行了焦磷酸测序。测序结果显示,尽管两份马铃薯病叶症状不同,但均感染了PVY(N-Wi株系)(PVYN-Wi)。上述研究表明,利用本试验设计的引物,通过焦磷酸测序法进行短序列测序,可以鉴定马铃薯感染的PVY株系。     

马铃薯S病毒RT-qPCR通用检测体系的建立与应用

为实现准确和快速鉴定PVS及其株系,明确PVS在马铃薯叶片、叶柄、茎、根和休眠块茎中含量以筛选适合的检测部位,设计PVS通用简并引物,建立实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术体系,分析熔解曲线鉴定PVS^O和PVS^A株系。以马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯M病毒(PVM)、马铃薯A病毒(PVA)和马铃薯卷叶病毒(PLRV)阳性样品为对照检测其特异性。应用PVS^O和PVS^A重组质粒分别建立标准曲线,检测接种PVS^O和PVS^A马铃薯品种尤金和冀张薯12号的5个部位PVS含量。另外,应用该体系检测来源于11个省(市、自治区)的90个PVS阳性样品验证其实用性。PVS^O和PVS^A扩增后熔解曲线分别在85.77～86.00℃和87.78～87.91℃出现特异峰,PVS阴性样品及PVX、PVY、PVM、PVA和PLRV阳性样品的熔解曲线均无上述特异峰。PVS^O和PVS^A...     

三种百合种球病毒RT-PCR检测

本研究以4个百合品种为试材进行种球病毒分子生物学检测。研究结果表明,通过设计兼容性好、性状稳定的三对特异性引物,提高了PCR扩增的效率,改良了RNA的提取方法;改进Trizol法使其适合于内层鳞片及脱毒苗叶片总RNA的提取,而中外层鳞片则采用改进的CTAB法,得到高纯度、高质量以及完整度好的RNA;各反应成分的扩增条件得到了优化,建立了灵敏、快速、低成本的种球病毒RT-PCR检测反应体系及程序。     

一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对马铃薯病毒诊断研究的比较

本研究采用试剂盒和Total试剂两种方法从马铃薯叶片和茎秆中提取总RNA,同时设计了一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的反应体系,依据马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯A病毒以及马铃薯卷叶病毒的基因组RNA保守序列设计特异性引物对,并运用两种RT-PCR反应体系对染病的马铃薯进行病毒检测,结果与报道的这五种马铃薯病毒核苷酸序列进行BLAST比对, 表明扩增的五种马铃薯病毒靶带的序列与靶序列完全一致。两种诊断方法对马铃薯病毒核酸进行浓度检测,结果证明,两步法RT-PCR具有较高灵敏性。但这两种方法均可快速、简便、有效地诊断马铃薯病毒。     

半巢式RT-Reahime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Y，PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本文根据PVY^n基因组中RNA依赖的RNA聚合酶基因序列保守区域，设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针，建立了半巢式RT—RealtimePCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E．Z．N．A^TM．陕速提取植物总RNA，并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大，也是对第一步PCR产物的确认，因此，检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Realtime PCR等方法高。实验结果表明，该方法检测灵敏度可达4fg／μL植物总RNA。     

马铃薯双抗病毒转基因技术初步研究

针对马铃薯生产中存在的病毒型退化和转基因本身存在的生物安全性问题,把新近发展迅速的RNA干扰技术和无标记转基因技术引入植物抗病毒基因工程,培育生物安全型抗多病毒转基因马铃薯,探索一条多抗甚至多免疫的生物安全型转基因新途径。通过农杆菌介导,将抗马铃薯X病毒和Y病毒的RNA干扰型基因结构转入马铃薯大西洋、克新1号等新疆主裁栽培品种,通过PCR检测获得对X病毒和Y病毒具有双重高抗或免疫的无标记基因的高生物安全型转基因马铃薯植株。最终,通过多次筛选试验,确定了农杆菌OD600为0.3~0.5时为宜,但以0.5最佳,预培养2 d,侵染时间为10 min,共培养2~3 d的最佳转化条件。通过特异性引物PCR扩增,部分再生植株得到与阳性对照一致的目的条带,初步确定RNAi基因已整合到马铃薯基因组中。本研究获得的抗病毒无标记转基因马铃薯,其目的基因为RNA干扰型结构,转基因植株的抗性是RNA沉默的结果。由于所转基因的m RNA已经降解成小片段,转基因植株不存在标记基因,规避了目的基因和标记基因潜在的生物安全性问题。     

马铃薯晚疫病菌RxLR效应因子RD24基因克隆及其PVX表达载体构建与鉴定

马铃薯晚疫病病原菌致病疫霉菌(Phytophthora infestans)在侵入寄主细胞的同时分泌效应因子(Effector),该类蛋白在晚疫病致病过程中发挥着关键作用,是抑制植物免疫的重要因素。PITG_RD24是马铃薯晚疫病菌位于细胞核核的一个重要效应因子。为了快速鉴定效应因子RD24在马铃薯中瞬时表达的状况及抗性情况,构建效应子RD24的PVX表达载体是十分必要的。本研究利用PCR、酶切、分子克隆等生物学技术,将RD24片段连接插入至PVX（pGR106）载体中,然后用热击法将连接产物转化至大肠杆菌DH10B感受态细胞中。通过PCR筛选、质粒提取、测序比对,结果表明成功获得含有目的表达载体pGR106·RD24的质粒,可为下一步筛选马铃薯广谱抗病基因研究提供必备载体。