蜕皮激素对家蚕几个器官蛋白质合成活性的影响

用3H-甘氨酸参入法研究了家蚕五龄幼虫丝腺、脂肪体和中肠等器官白质合成活性的动态变化及蜕皮激素(简称MH)的影响。研究结果表明,五龄前期一次添食和每天连续添食MH能显著提高后部丝腺丝心蛋白和脂肪体蛋白质的合成活性,而抑制中肠蛋白质和五龄中后期中部丝腺丝胶蛋白的合成活性。此结果,为阐明MH对蚕体蛋白质合成的调控作用提供了直接的证据。     

保幼激素和蜕皮激素对家蚕离体后部丝腺吸收核酸和蛋白质标记前体的影响

用后部丝腺离体培养和示踪原子法,研究了保幼激素类似物和植源性蜕皮激素对家蚕后部丝腺吸收核酸和蛋白质标记前体的影响。离体后部丝腺对~3H-胸腺嘧啶核苷、~3H-尿嘧啶和~3H-甘氨酸的吸收活性均受培养液中激素的影响。在本试验培养时间内,总吸收量均以两种激素同时加入高于单种激素加入;在加入其中一种激素时,吸收活性还因供试幼虫发育时期的不同(五龄前期或后期)而表现出相反的趋势;吸收的~3H-甘氨酸参入后部丝腺蛋白质合成的比率,以加入保幼激素类似物时较低,加入蜕皮激素和两种激素同时加入时较高。因此认为,不同发育时期接受过不同内源激素作用了的后部丝腺,在短期的体外条件下对激素的反应是不同的;但五龄任何时期的后部丝腺,均是在两种激素共同作用下,比单种激素作用更有利于核酸和蛋白质的合成。     

家蚕在5令期减食饲育对后部丝腺核酸量的影响

将5令起蚕经3.5天后进行绝食处理(绝食区),5令起蚕摄食时间仅限于每天6小时的饲育(减食区),定量调查蚕儿及绢丝腺的成长,后部丝腺中核酸含量的变化和蚕茧产量。蚕儿的成长体重和后部丝腺,减食区的成长速度大致是对照区的一半,绝食区从开始绝食后便停止生长,重量减少。前、中部丝腺的干物重和按照比例丝液的积蓄比蚕儿生长显著的低。但绝食区的蚕儿绝食后,能暂时地继续增加重量。后部丝腺DNA的增加,每日减量饲育没受到明显地影响;但绝食区却造成了DNA量的减少。关于RNA的积蓄,减食区的最大量约是对照区的70%。绝食区绝食后RNA立刻急速地降低。绝食区减食区的茧质明显地低劣,平均后部丝腺RNA茧丝生成放率大约不到对照区的一半。     

家蚕茧丝突变种Nd的丝腺发育形态观察

裸蛹(Nd:25-0.0)其突变性状表现为绢丝腺退化及不能正常吐丝结茧,基因位于与丝素重链同在的第25号染色体的0.0座位。在本研究中,选用Nd-s及大造作为对照,解剖不同发育时期丝腺,经DAPI染色后计数其丝腺细胞数和观察丝腺细胞的发育情况。蚁蚕时期丝腺细胞数的统计结果表明,3个品种的中部丝腺和后部丝腺在细胞数目上并无显著性差异;而在5龄初期,Nd后部丝腺的发育明显比对照发育慢,特别是在长度上;对丝腺细胞核的染色观察发现,5龄期,Nd突变种的中部丝腺的细胞核分裂与对照相比无差异,均呈树突状分裂;而后部丝腺细胞只发生纵向扩展,无正常家蚕丝腺细胞的树突状分裂。对fib-H基因末端序列测序结果表明,该突变在fib-H末端的半胱氨酸位点也没有发生突变。由此认为,该突变种丝腺的退化并不是真正的细胞数减少或者发育过程中萎缩,而是后部丝腺细胞核的分裂过程发生异常从而造成后部丝腺的短小,推测该突变基因与细胞核的分裂有关。     

家蚕有色茧主要色素物质在幼虫体内的代谢变化

为探讨有色茧色素物质在蚕体内的代谢机制,检测了有色茧主要色素物质的含量及其在家蚕5龄幼虫不同时期中肠、血液、丝腺组织中的消长变化,分析色素物质从中肠进入血液再转运到丝腺的时序差异。有色茧中,黄茧的色素以类胡萝卜素化合物为主,绿茧的色素以黄酮类化合物为主。黄酮类化合物、类胡萝卜素化合物在家蚕5龄幼虫中肠、血液、中部丝腺、后部丝腺中的含量均呈现龄初低、龄末高的趋势,其中,黄酮类化合物在熟蚕组织中的含量是中肠>血液>中部丝腺>后部丝腺;类胡萝卜素化合物在熟蚕组织中的含量是中部丝腺>后部丝腺>中肠>血液。2种色素物质含量变幅最大的是后部丝腺组织,结黄茧蚕和结绿茧蚕的黄酮类化合物分别增加406.55%、202.50%,类胡萝卜素化合物分别增加211.80%、250.84%。黄酮类化合物在5龄幼虫丝腺组织的绝对含量是结绿茧蚕大于结黄茧蚕,类胡萝卜素化合物在5龄幼虫丝腺组织的绝对含量是结黄茧蚕显著大于结绿茧蚕,与在不同颜色蚕茧中检测到的2种色素物质含量一致。研究结果提示:黄酮类化合物在5龄幼虫中肠组织中积累较多,类胡萝卜素化合物在丝腺组织中积累较多;丝腺组织中2种色素物质的含量与茧色密切相关;来自桑叶中的2种色素物质经中肠消化吸收后,再通过血液进入丝腺组织并产生累积效应。     

不同产丝量家蚕品系后部丝腺的蛋白质组学分析

家蚕幼虫后部丝腺是合成和分泌丝素蛋白的重要器官。为从蛋白质水平探究不同家蚕品系产丝量差异的原因,应用蛋白质组学研究方法,选取3个产丝量有较大差异的家蚕品系Ndx、大造和21-872为材料,通过双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对各品系5龄第5天幼虫后部丝腺表达的差异蛋白进行鉴定,查找与丝蛋白合成相关的蛋白质。结果表明,茧丝突变品系Ndx后部丝腺的蛋白质表达水平与普通丝量品系大造和高丝量品系21-872有差异,差异表达蛋白种类主要为应激反应相关蛋白、能量相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白和一些酶类,其中核糖体磷酸化蛋白P0和P2、蛋白质二硫化物异构酶、丝素轻链蛋白Fib-L以及丝素蛋白P25等在Ndx后部丝腺的含量明显低于其它2个品系。推测在茧丝突变品系Ndx的后部丝腺中,上述蛋白质表达量的变化可能是导致其不能正常吐丝结茧的原因。     

添食不同含氮物质对家蚕产丝量及丝素蛋白基因表达的影响

给家蚕5龄幼虫分别添食大豆蛋白、NH4Cl和尿素后,调查家蚕产丝量的变化,并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测蚕体丝腺组织中丝素重链基因(fib H)的表达变化,探究适合用于提高家蚕产丝量的含氮物质。5龄起蚕连续6 d按照0.45 mg/(头·d)的剂量添食尿素后,茧层率比对照组增加15.7%,且幼虫的体质量及丝腺体积都比对照组有所增加;5龄幼虫添食大豆蛋白和NH4Cl后茧层率无明显增加。qRT-PCR检测5龄起蚕按照上述剂量添食尿素120 h后,后部丝腺中fib H的表达量比对照组增加了1.5倍。上述结果再次证实了家蚕5龄幼虫添食尿素后可以增加产丝量,并且表明尿素可以促进蚕体后部丝腺中fib H基因的表达。     

外源蜕皮激素和保幼激素类似物对家蚕丝腺蜕皮激素受体基因表达活性的影响

为了进一步探讨外源蜕皮激素（Moulting hormone,MH）和保幼激素类似物（Juvenile hormone analogue,JHA）处理家蚕的增丝机理,本试验分别于5龄24h注射植源性MH和5龄72h注射JHA,采用半定量RT-PCR方法,测定了蜕皮激素受体（ecdysone receptor,EcR）（BmEcR-B1型）基因在家蚕5龄不同发育时期在中部丝腺和后部丝腺中表达量的变化。结果表明,正常对照家蚕丝腺中,EcR基因的表达均在5龄前期表达量较低,中后期表达量较高,但丝腺不同部位,表达模式不同。5龄24h用MH处理后,无论是中部丝腺还是后部丝腺,EcR基因的表达活性与对照组相比,总体上均是先上调后下降;而5龄72h用JHA处理,EcR基因的表达一直到对照熟蚕前均低于对照区;但两种处理区在对照区熟蚕之后仍有不同程度的表达。说明外源激素可通过影响MH受体基因的表达,从而影响了MH信号转导,进一步影响丝蛋白的合成。     

家蚕后部丝腺细胞数与茧质性状关系的研究

采用OLYMPUS位相差显微镜(10×20)观察计数家蚕后部丝腺细胞数,结果得知:家蚕后部丝腺一侧细胞数在180—260个之间,标准差大多在5—25个之间;不同品种后部丝腺细胞数存在极明显差异;同一品种雌雄间差异不显著,其细胞数的分布属正态分布;同一头家蚕的两条后部丝腺的细胞数,少数个体存在一定的开差。后部丝腺细胞数与茧质性状的线性回归及离回归方差均达到极显著水平;后部丝腺细胞数杂种优势率与茧质件状杂种优势率大多没有显著的相关关系;说明后部丝腺细胞的多少是丝素蛋白产量高低的一个条件,而每个细胞合成、分泌丝素蛋白的能力强弱是产量高低的另一条件。     

柞蚕后部丝腺信使核糖核酸的提取和分离

本文介绍了两步操作提取纯化柞蚕后部丝腺mRNA的方法。第一步用SDS—冷酚法提取全核酸,第二步通过Sepharose 2B柱层析分段分离丝心蛋白mRNA,对提纯的丝心蛋白mRNA经聚丙烯酰胺凝胶电泳,达到一条电泳带的水平,此丝心蛋白mRNA在小鼠Ehrlich腹水癌无细胞体系中,能促进3H—DL、丙氨酸参入达七倍以上,说明用这种方法提取纯化的丝心蛋白mRNA不丧失其活性。     

家蚕彩色蚕中红色素和丝心蛋白相互作用的研究

为探讨茧色的形成机理,对红色蚕及其茧、丝腺进行解剖观察,然后测定丝心蛋白的氨基酸组成和含量,最后应用光谱法测定红色素和家蚕丝心蛋白之间的相互作用。结果显示:红色素在丝腺中全部着色,前部、中部、后部丝腺及吐丝管都完全着色,白蚕和红蚕丝心蛋白组分及含量的变化基本相同,丝心蛋白上的酪氨酸残基参与了猝灭过程,结合作用为氢键结合。     

家蚕丝素P25蛋白的多克隆抗体制备与应用

P25蛋白是家蚕(Bombyx mori)丝素蛋白的主要成分之一。根据BmP 25基因ORF序列设计引物,以家蚕5龄第3天丝腺cD NA为模板,RT-PCR扩增获得BmP 25的ORF全长片段。将构建的含BmP 25的原核表达重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株感受态细胞,对家蚕丝素P25蛋白进行重组表达和纯化,并免疫家兔制备获得多克隆抗体,用于研究家蚕丝腺中P25蛋白的合成和分泌规律。利用制备的多克隆抗体对家蚕品种大造5龄第3天幼虫9个组织的总蛋白质样品进行Western blot检测,结果在中部丝腺和后部丝腺检测到P25蛋白,表明该抗体有较好的特异性。进一步利用此多克隆抗体分别对家蚕5龄第5天幼虫中部丝腺和后部丝腺不同区域进行荧光免疫组化分析,结果在后部丝腺的细胞和腔内观察到明显的荧光信号,而中部丝腺后部的细胞仅有微弱信号,腔内的荧光信号强度随着丝素蛋白的从后向前运输越来越弱,以致在中部丝腺的前部和中部未检测到荧光信号。推测可能是P25蛋白在丝素蛋白从溶胶状态到凝胶状态的转化过程中,被逐步包裹在丝素蛋白聚合物中导致其不能被检测到。利用该多克隆抗体对家蚕不同品种的茧丝蛋白进行Western blot检测,均能获得特异性的杂交条带,表明该抗体还可用于家蚕茧丝及丝制品的分子检测鉴定,为开发丝制品的检测试剂盒提供了条件。     

吲哚丁酸和赤霉素对家蚕后部丝腺谷氨酸—丙酮酸转氨酶活力的影响

就植物激素吲哚丁酸（IBA）和赤霉素（GA_3）对家蚕（Bombyx mori）后部丝腺谷丙转氨酶（GPT）活力和产丝量的影响作了调查和探讨。试验结果表明,在4龄第3日或5龄第1日添食IBA或GA_3,都能提高家蚕5龄期后部丝腺GPT的活力,产丝量也有较大幅度的增加,其中,以3×10~（-5）ppmIBA在4龄3日处理或3×10~（-4）ppmGA_3在5龄1日处理效果最佳,其茧层量分别比对照区提高22％和10％。另外,就这两种植物激素对多丝量品种或少丝量品种的影响差异作了讨论。     

保幼激素和蜕皮激素对桑蚕后部丝腺核酸合成的影响

JHA和MH对桑蚕后部丝腺核酸合成的影响,因蚕儿的发育时期及使用剂量不同而异;在5龄前期,JHA抑制后部丝腺的核酸合成,MH促进合成;而在5龄后期,JHA的促进作用大于MH;若用JHA和MH连续处理或一次性高剂量注射,则两种激素均具有强烈的抑制作用。     

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。     

表达Ⅰ型类人胶原蛋白和脯氨酰4-羟化酶α-蛋白的转基因家蚕品系构建

家蚕丝腺具有高效合成与分泌蚕丝蛋白质的能力,探究利用转基因方法开发家蚕丝腺为生物反应器生产高附加值外源蛋白质的技术途径。将Ⅰ型类人胶原蛋白基因(HCool-Ⅰ)和胶原蛋白羟基化修饰所必需的脯氨酰4-羟化酶α-亚基基因(BmP 4Hα)通过piggyB ac转座子及显微注射方法,同时转入家蚕早期胚胎,在丝素轻链基因fib-L启动子驱动下转入的2个外源基因在家蚕幼虫后部丝腺获得表达。利用反向PCR和生物信息学等方法鉴定、分析转基因家蚕基因组中有19个外源piggyB ac的整合位点,分别位于基因的外显子区域、内含子区域和基因间区,可定位至家蚕的15条染色体上。实时荧光定量PCR检测不同整合位点的转基因家蚕品系幼虫后部丝腺中HCool-Ⅰ基因mRNA转录量存在极显著差异,转录量最高和最低的品系间相差23倍左右;转基因家蚕后部丝腺中BmP 4Hα基因mRNA的转录量比野生型家蚕高出2万多倍。利用SDS-PAGE检测转基因家蚕G3代5龄5 d幼虫的后部丝腺总蛋白质在55 kD和64 kD处分别存在特异性蛋白条带,表明BmP 4Hα和HCool-Ⅰ蛋白已在G3代转基因家蚕丝腺中获得表达。     

PI3K/AKT/TORC1信号通路对丝素蛋白合成转录因子SGF1表达的影响

SGF1(silk gland factor 1)是一种转录调控因子,属于Fox家族的Fox A亚家族成员,能够启动丝素基因的表达,合成丝素蛋白。已知果蝇和其他高等动物中的PI3K/AKT/TORC1信号通路可以调控Fox转录蛋白的表达。为了探究家蚕幼虫后部丝腺(PSG)中PI3K/AKT/TORC1信号通路对SGF1表达水平的影响,对4龄第4天和5龄第7天家蚕幼虫分别注射信号通路抑制剂Wort、Rapa和LY294,24 h后解剖取出后部丝腺,一组用于免疫组织化学染色实验,另一组用于提取蛋白质进行Western blot检测。免疫组织化学染色实验表明,与对照组相比,注射3种信号通路抑制剂的家蚕幼虫后部丝腺组织的绿色荧光亮度明显减弱;Western blot检测表明,与对照组相比,实验组家蚕幼虫后部丝腺的蛋白质浓度有所下降。综合以上结果初步得出PI3K/AKT/TORC1信号通路抑制剂处理均可降低家蚕幼虫后部丝腺中SGF1表达的结论,即提示可以通过上游信号通路PI3K/AKT/TORC1影响SGF1的表达水平,进而调控丝素蛋白的合成。     

浅析不结茧蚕发生的原因及对策

<正>蚕桑生产中常常发生熟蚕不吐丝,上蔟数天后死于蔟中,或吐出少量的丝而不结茧等情况,严重影响蚕农收入,挫伤蚕农养蚕积极性。笔者通过多年生产实践,对此进行分析,提出相应对策,期望对减少不结茧蚕的发生有所帮助,促进蚕农增收。1不结茧蚕发生原因分析1.1生理因素1.1.1丝腺异常。丝腺发育异常,出现丝腺过于肥大、丝腺内液状丝物质脱水不充分、中部或后部丝腺气管分布异常等,成为不结茧蚕。     

关于家蚕四元杂种亲本组配的研究:Ⅲ、杂交原种后部丝腺核酸分析

本研究采用STS改良法抽提家蚕后部丝腺的两类核酸(DNA和RNA),研究家蚕杂交原种后部丝腺的核酸含量与若干数量性状的遗传相关,从定量分析上证明了DNA控制RNA的转录合成,并决定家蚕的生物学产量;RNA决定丝蛋白代谢的速度和强度,并从微观上证明了多丝量品种的体弱难养,为育种实践上应用核酸分析预测产量创造了条件。     

新编养蚕学大要 (续)第五章 蚕儿的形态、生理、生态和遗传 第七节 绢丝腺和茧丝的形成

1、绢丝腺 (1) 绢丝腺的形态绢丝腺是生产茧丝的原料——液状绢的重要器官。其大部分在消食管的下方,呈特殊的形态。大致可分为前部丝腺、中部丝腺和后部丝腺。其中,最粗的中部丝腺呈“S”状屈曲,由前往后,分为前区、中区和后区。吐丝口开口于最前端的蚕儿头部,接着分为两条,前部丝腺左右合并成一条的部