荧光定量PCR方法检测IBV病毒在CEK细胞中的动态变化

为揭示鸡传染性支气管炎病毒（IBV）在鸡胚肾细胞（CEK）中复制增殖的动态变化规律,通过实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测IBV病毒感染CEK3、6、12、24、36、48、72h后病毒增殖量的动态变化。结果显示,随着时间增加,IBV病毒增殖出现规律性变化,3～12h时IBV增殖不明显,36h时IBV开始大量复制,48h时达到高峰,但72h后有所下降。试验表明IBV在细胞内复制增殖的最佳时间在接毒后48h,其复制增殖情况与细胞状态负相关。     

荧光定量PCR方法检测IBV病毒在CEK多细胞中的动态变化

为揭示鸡传染性支气管炎病毒（IBV）在鸡胚肾细胞（CEK）中复制增殖的动态变化规律,通过实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测IBV病毒感染CEK3、6、12、24、36、48、72h后病毒增殖量的动态变化。结果显示,随着时间增加,IBV病毒增殖出现规律性变化,3～12h时IBV增殖不明显,36h时IBV开始大量复制,48h时达到高峰,但72h后有所下降。试验表明IBV在细胞内复制增殖的最佳时间在接毒后48h,其复制增殖情况与细胞状态负相关。     

鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病毒基因组保守区域设计1对扩增片段为164 bp的特异性引物,应用SYBR GreenⅠ染料建立了鸡传染性贫血病毒(CIAV)荧光定量PCR检测方法.以本室构建的阳性重组质粒作为模板,制定标准曲线,对CIAV阳性样品进行了敏感性、特异性和重复性、稳定性试验,并应用于临床检测.结果表明引物最佳终浓度为0.2 μmol/L,制作的标准曲线定量浓度范围宽,最低可检测到每个反应相当于10个拷贝的标准品DNA;与IBDV、ARV、MG都不反应;重复性、稳定性试验的变异系数都较小.对保存的25份疑似CIAV样品进行荧光定量PCR检测,结果检出9份阳性.本研究建立的荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染CIAV的检测.     

荧光定量RT-PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。     

猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

通过RT-PCR方法克隆了猪瘟病毒(CSFV) 5′端非编码区(UTR)的一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.同时根据GenBank中的靶序列设计了用于FQ-PCR的一对引物和一条TaqMan探针.通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了CSFV检测的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为 109～100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为19.73、22.95和26.24;变异系数分别为0.61%、1.77%和1.18%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.     

鸡传染性支气管炎病毒Real-time PCR方法的建立及其对感染鸡体内病毒的检测

本研究针对传染性支气管炎病毒（IBV）tl／CH／LDT3／03毒株的N基因（GenBank登录号为AY702975）设计并合成了一对引物,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IBV核酸的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法可检测到初始模板中6．45×10copies／μL的病毒核酸。与常规PCR相比,敏感性高100倍。该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如新城疫病毒（NDV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、禽流感病毒（AIV）、马立克氏病毒（MDV）均不发生交叉反应;重复性试验的变异系数小于2．6％。结果表明,本试验建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于传染性支气管炎的临床诊断。同时应用本方法对人工感染IBV的SPF鸡的主要脏器盲肠扁桃体、肾脏、肺和气管进行了病毒RNA定量检测,结果表明,肾脏的病毒含量最高,盲肠扁桃体中病毒持续的时间最长,从而揭示了IBV在SPF鸡体内复制的动态变化,证实了感染鸡的临床表现与病毒滴度的时间相关性。     

鸡贫血病毒Taq Man探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡贫血病毒(CAV)基因序列,选取一段高度保守的基因序列作为目的片段设计引物与探针,将该目的片段克隆到pMD18-T载体中,作为阳性标准品.通过优化荧光定量PCR反应条件,建立了CAV的荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到10个病毒拷贝/μL,与其他禽病病毒无交叉反应,批间与批内重复试验相关系数都小于5%.实验数据证明该检测方法敏感性高,特异性好,重复性佳.     

口蹄疫病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据GenBank中FMDV的2B基因序列,设计合成一对引物和一条TaqMan探针,将2B基因克隆到pBlueScriptSK(-)载体中,利用T7体外转录试剂盒制备标准品,通过优化反应条件,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到102拷贝/μL;与其它主要相关病毒均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于3％.本研究建立的FMDV TaqMan荧光定量PCR方法对FMDV的快速检测具有重要意义.     

PCR方法快速检测鸡传染性支气管炎病毒

本试验建立了一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒的通用性 Ｐ Ｃ Ｒ 方法。通过对纯化后 Ｉ Ｂ Ｖ核蛋白基因进行直接 Ｐ Ｃ Ｒ及套式 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增表明,两次 Ｐ Ｃ Ｒ 产物的大小为０．７ ｋｂ 和０．５ ｋｂ,与实际设计相符。而对照的 Ｎ Ｄ Ｖ 及 Ｉ Ｂ Ｄ Ｖ 的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物均为阴性。用 Ｉ Ｂ Ｖ Ｈ Ｂ株感染 Ｓ Ｐ Ｆ鸡后,应用我们所建立的 Ｐ Ｃ Ｒ 方法去检测不同时期所采集的肾脏、气管、盲肠扁桃体、肺脏和肝脏中的 Ｉ Ｂ Ｖ,在 Ｓ Ｐ Ｆ鸡感染 Ｉ Ｂ Ｖ后的２１ ｄ 仍然能够检测到 Ｉ Ｂ Ｖ 的基因组, Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 杂交试验证明了我们获得的 Ｐ Ｃ Ｒ 产物为 Ｉ Ｂ Ｖ 的核蛋白基因。该 Ｐ Ｃ Ｒ 检测方法比免疫荧光抗体（ Ｆ Ａ）法更具敏感、特异、快速等特点,完全适用于不同来源及不同血清型 Ｉ Ｂ Ｖ 的检测。     

禽白血病J亚群病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在通过荧光定量PCR方法研究禽白血病J亚群病毒(ALV-J)在家禽体内各个器官的分布。根据ALV-J NX0101毒株基因5 258—5 510bp的碱基序列,设计了1对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为253bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性,特异性和重复性试验。然后用已建立的方法对人工感染ALV-J的SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、腺胃进行3次重复检测,将Ct值带入标准曲线公式得出各个组织的病毒拷贝数。试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.991 4,检测极限约为81拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有ALV-J能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。通过比较数值以得出胸腺ALV-J基因含量是最高的,肺脏、脾脏、法氏囊含量也比较高,心脏拷贝数最低。自然感染发病鸡各器官ALV-J基因均高于人工感染ALV-J的基因含量。本研究所建立的ALV-J基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,初步探讨了禽白血病J亚群病毒在畜禽体内各个器官的病毒分布。这为以后禽白血病的诊断以及治疗提供了重要的技术支持。     

应用Dot—ELISA检测鸡传染性支气管炎病毒的研究

用差速离心结合琼脂糖凝胶层析纯化的鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）制备抗原免疫兔,获得高效价的多克隆免疫血清,提纯ＩｇＧ后用辣根过氧化物酶标记,建立了检测ＩＢＶ的斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）方法。对影响本方法因素的研究表明,当酶标抗体作１：１００稀释、工作时间为３７℃、６０ｍｉｎ时结果最理想;对待检组织用氯仿处理、对硝酸纤维素膜用０．３％Ｈ２Ｏ２处理３０ｍｉｎ可有效地消除组织内过氧化物酶的影响。该方法具有较强的特异性和敏感性,对病毒的最低检出量为０．０１２４ｍｇ／ｍＬ。本法不仅可检测到纯化ＩＢＶ,而且可直接用于检测鸡胚尿囊液或病变组织（如气管、肾）中的病毒;对临床上疑似ＩＢＶ感染的病鸡的阳性检出率达７８．６％,而病毒分离率仅达６０％,两者符合率为９０％。试验结果表明,Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ可作为ＩＢＶ早期诊断的方法,具有简单、快速、样品用量少等优点。     

鸡IBV、NDV和AIV多重RT-PCR检测方法的初步建立

根据鸡传染性支气管炎病毒M基因、禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,初步建立了针对鸡传染性支气管炎(IB)、新城疫(ND)和禽流感(AI)的多重RT-PCR鉴别诊断方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的3对引物可对同一样品中的IBV、NDV和AIV进行特异性扩增,所扩增的目的片断的长度分别为333bp(IBV)、438bp(NDV)和196bp(AIV);建立的多重RT-PCR检测方法能够检测出1ng/μLAIV、1ng/μLNDV和10ng/μLIBV的cDNA,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。本研究所建立的多重RT-PCR方法可用于上述3种鸡病毒性呼吸道疾病的快速鉴别诊断,在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。     

荧光定量PCR检测雏鹅人工感染鹅细小病毒后病毒在体内分布规律

2005年从山东某鹅场16日龄商品代病死鹅中分离到1株鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）,命名为SD2005株。用建立的荧光定量PCR（FQ-PCR）检测鹅细小病毒的方法,检测SD2005株人工感染3日龄雏鹅（GPV抗体阴性）后各器官不同时间段的病毒含量,结果表明：在攻毒8h后能从消化系统及血液、心脏和肝脏中检测到病毒DNA;病毒DNA的含量在48h后达到最高峰,并一直维持到168h。随后各待检脏器中病毒DNA含量持续降低,但在720h后仍能从粪便、肝脏和脾中检测到少量的病毒DNA。本试验为阐明GPV的致病机理及防控提供了重要的试验数据和理论依据。     

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。     

1株禽传染性支气管炎病毒的分离鉴定及其实时荧光定量PCR检测方法的建立

自禽传染性支气管炎病毒流行较严重地区的患鸡组织病料中分离得到1株疑似毒株,利用鸡胚培养、气管环及动物回归试验、电镜观察、RT-PCR等多种方法及对其S1基因序列进行比较分析,确定该分离毒株为禽传染性支气管炎病毒QX型。同时针对该新分离的传染性支气管炎病毒建立了实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:针对该分离毒株的S1基因区设计1对引物和TaqMan探针,制备质粒标准品,建立标准曲线,其线性关系为y=-3.385 7x+42.235,R^2=0.999,扩增效率为97.5%,该法能区分常见禽类流行病毒,检测灵敏度可达42.1拷贝数/μL,比普通PCR检测限度高,重复性良好,因而该实时荧光定量PCR检测方法可靠。本试验同时进行了拷贝数与半数鸡胚感染量(EID50)对应关系研究,证明了在控制病毒代次、冻融次数等条件下,建立线性关系为y=0.249 2x+1.341×10^6(以拷贝数为x轴,EID50为y轴),R^2=0.956 4,可实现拷贝数替代EID50。     

实时荧光PCR快速检测水产品中副溶血性弧菌的研究

目的建立快速检测水产品中副溶血性弧茵的实时荧光PCR方法。方法利用副溶血性孤菌TDH基因的保守序列设计引物和探针,建立快速检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法。结果本研究建立的检测副溶血性弧菌的实时荧光PCR方法,其纯茵检测低限低于10cfu/PCR反应体系;对模拟阳性样品直接检测,检测低限为10~3cfu/g。模拟样品经增茵培养4～6h后,检测低限达1cfu/g;用本法对24株标准菌株/参考菌株进行检测,结果除副溶血性弧菌呈阳性外,其他23株非副溶血性弧菌均呈阴性反应;重复性试验结果:批内和批间变异系数均小于1%。结论本研究建立的副溶血性弧菌实时荧光PCR方法具有快速、灵敏、特异和重复性好的优点,可在8h内对水产品中的副溶血性弧菌进行定性或定量检测。     

传染性支气管炎病毒山东及北京分离株血清型及RFLP基因分型的比较研究

分离并鉴定出山东省不同地区的IBV分离株A、B、C、D和北京分离株F，利用中和试验分别对各分离株及标准株M41、T等进行血清分型。设计一对此物，分别对各毒株的S1基因进行RT－PCR扩增，扩增片段长约1700bp，利用其PCR产物进行HaeⅢ酶切，根据酶切图谱，进行基因分型。结果表明：A、C、D和M41酶切图谱相同，属Mass基因型，分别为900、400和300bp左右的片段；北京F株有4条酶切条带，与4／91基因型不同，分别为1000、300、200和小于100bp左右的片段；B株有4条酶切条带，理论推断与T株相似，分别为700、500、300和180bp左右的片段，可能为同一基因型。血清学分型结果与基因分型结果不符。     

鸡传染性支气管炎病毒BD01株S1基因的特性分析

用RT-PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DB01株S1基因,获得了约1.7 kb的基因序列,利用DNAMan软件对DB01株S1基因的核苷酸和氨基酸序列与标准疫苗株H120、H52和M41进行比较.结果表明,其同源性均低于80%,亲缘关系比较远.在DB01的S1蛋白氨基酸序列上出现了5个新的糖基化位点,1个糖基化位点丢失,其中有3个变异位点在抗原表位上.亲水性也发生了较大变化.     

Detection of equine herpesvirus-1 in nasal swabs of horses by quantitative real-time PCR

Background: Early identification of inhalation-transmitted equine herpesvirus type 1 (EHV-1) infections has been facilitated by the availability of a number of real-time quantitative PCR (qPCR) tests. A direct comparison between nasal swab qPCR and traditional virus isolation (VI) requires a method for normalizing the qPCR samples and controlling for PCR inhibitors present in some clinical samples.
Objectives: To quantify EHV-1 shedding in viral swabs using an internal control and to compare fast qPCR to VI for the detection of EHV-1 in nasal swabs from horses.
Animals: Fifteen horses experimentally infected with EHV-1.
Methods: Experimental study : Nasal swab samples were collected daily after experimental infection for up to 21 days. VI was performed by conventional methods. The DNA was prepared for qPCR with the addition of a known quantity DNA of Marek's disease virus as an internal control. qPCR was performed.
Results: The qPCR method detected virus up to day 21 after challenge, whereas VI detected virus only to day 5. The median Kaplan-Meier estimates for EHV-1 detection were 12 days for qPCR and 2 days for VI ( P < .0001). When compared with VI, the sensitivity and specificity of qPCR were 97 (95% CI: 86–100) and 27% (95% CI: 20–35).
Conclusions and Clinical Importance: We conclude that fast qPCR of nasal swab samples should be chosen for diagnosis and monitoring of herpesvirus-induced disease in horses. Recommended reference ranges of C _T values are provided as well as justification of a minimum 10-day quarantine period.     

荧光定量PCR检测硬蜱体内莱姆病螺旋体的研究

为建立一个荧光定量PCR检测硬蜱体内莱姆病螺旋体的方法,根据GenBank登录的莱姆病螺旋体鞭毛蛋白FlaB序列,应用生物学软件进行序列比对,在保守的C段区设计与筛选特异引物和TaqMan探针。对荧光定量PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性,并通过对感染螺旋体的蜱样本的检测,评价该方法的实用价值。结果显示,自然感染莱姆病螺旋体的35份蜱标本检测阳性符合率100%,正常蜱20份标本的检测结果均为阴性。该方法对牛巴贝斯原虫、泰勒原虫、边缘无浆体、金龟子绿僵菌、大肠杆菌等蜱体常见病原微生物所抽提的DNA的检测均呈阴性。荧光定量PCR方法检测质粒的灵敏度可达1×102拷贝/μL。TaqMan荧光定量PCR方法检测硬蜱体内莱姆病螺旋体具有较好的敏感性和特异性,可适于莱姆病的流行病学调查和监控。