以WWSV ORF234片段诊断罗氏沼虾白斑病毒病及片段分析

根据GenBank中登录的对虾白斑综合症病毒(WSSV)全基因组序列中和ORF234.相应的序列来设计1对引物,从疑似病例的罗氏沼虾中提取总DNA,并以此为模板,经PCR扩增出约885 bp的特异性片段,克隆进质粒载体pET-28a(+),进行序列测定和分析.结果显示:扩增序列共编码294个氨基酸.预测的相对分子质量为34kDa,与GenBank中登录序列的对应区域同源性达99%,由此确认该罗氏沼虾患有白斑综合病毒病.该序列所编码的蛋白在22～96氨基酸位置有一段球状结构,在142～272氨基酸位置有一个与DUF1335蛋白同源的将近130个氨基酸残基的保守区,其功能未知.同时还对克隆出的片段进行序列分析和蛋白预测,以进一步深入开展蛋白的功能及对该病毒病的防治的研究.     

以 WWSV ORF234片段诊断罗氏沼虾白斑病毒病及片段分析

根据GenBank中登录的对虾白斑综合症病毒(WSSV )全基因组序列中和ORF234相应的序列来设计1对引物, 从疑似病例的罗氏沼虾中提取总DNA, 并以此为模板, 经PCR扩增出约885 bp的特异性片段, 克隆进质粒载体pET- 28a( + ), 进行序列测定和分析。结果显示: 扩增序列共编码294个氨基酸, 预测的相对分子质量为34kDa, 与G enBank中登录序列的对应区域同源性达99%, 由此确认该罗氏沼虾患有白斑综合病毒病。该序列所编码的蛋白在22~ 96氨基酸位置有一段球状结构, 在142~ 272 氨基酸位置有一个与DUF1335 蛋白同源的将近130个氨基酸残基的保守区, 其功能未知。同时还对克隆出的片段进行序列分析和蛋白预测, 以进一步深入开展蛋白的功能及对该病毒病的防治的研究。     

罗氏沼虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆与表达

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是一种广泛分布在动植物体内的酶,并参与细胞多种代谢调控。在甲壳动物中,GS在能量代谢和渗透压调节过程中起着重要作用。实验克隆了罗氏沼虾GS基因。GS基因cDNA全长1 965 bp,开放读码框(ORF)为1 086 bp,编码361个氨基酸(aa),分子量大小为40.75 ku,等电点为5.81。进化树分析发现,罗氏沼虾GS基因与凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾GS聚为一支,氨基酸相似性达到95%。氨基酸多序列比对分析结果显示,罗氏沼虾GS属于无脊椎动物分支的GSⅡ群,有5个保守区域。实验对罗氏沼虾GS蛋白进行表达并制备了多克隆抗体。采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)对罗氏沼虾蜕壳前后的不同组织GS表达进行检测。qRT-PCR结果显示,GS基因在所检测的8个组织中均有表达;蜕壳前,其相对表达量顺序为:肝胰脏肌肉胃肠鳃心脏脑血淋巴。蜕壳后和蜕壳前GS基因在组织中的差异表达比较结果显示,除了在肝胰脏表达下调外,其他7个组织都表达升高,其相对表达量的差异顺序为:脑鳃胃肠肌肉心脏血淋巴。Westernblot结果显示,蜕壳后GS蛋白在鳃和肌肉组织表达量上调,与其mRNA表达一致。此外,罗氏沼虾蜕壳后肝胰脏GS酶的活性和谷氨酰胺的含量下调,而其在鳃、肌肉和血淋巴中上调,结果与其基因表达一致。研究表明,GS基因在不同组织中表达的差异可能和罗氏沼虾的能量代谢、渗透压调节有关。     

罗氏沼虾拉网综合症的症状、病因及防治对策

笔者于2006年7、8、9三个月在江苏高邮市罗氏沼虾主要养殖区域的司徒、周庄、张轩、二沟、三垛搞技术服务时发现一个普遍现象，即只要是拉过网的池塘都会出现零星死亡（当地养殖户称为“滴星”）。笔者暂定此种现象为“拉网综合症”。我们深入塘口调查研究，终于找到了病因并采取了相应措施，收到了很好的效果。现总结如下，供大家参考。     

罗氏沼虾淡化养殖的现状与展望

为了解超氧化物歧化酶 (SOD)分子生物学特性和免疫功能,实验克隆了罗氏沼虾胞质锰SOD基因 (MrcMnSOD),制备多克隆抗体,并分析在嗜水气单胞菌感染下该基因的表达模式。结果显示,嗜水气单胞菌感染可显著诱导MrcMnSOD在转录水平和蛋白质水平进行高表达。为探究MrcMnSOD参与免疫应答的机制,进一步的抑菌实验表明,该蛋白质可显著抑制3种革兰氏阴性细菌 (大肠杆菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌)和2种革兰氏阳性细菌 (无乳链球菌、金黄色葡萄球菌)的生长,且抑制作用与蛋白质浓度的关系不显著。研究表明,MrcMnSOD可能作为一种免疫相关分子参与免疫应答反应。本研究初步探讨了MrcMnSOD的免疫生物学功能,旨在为深入研究罗氏沼虾SOD的功能奠定相关基础。

     

罗氏沼虾胞质锰超氧化物歧化酶的功能

为了解超氧化物歧化酶 (SOD)分子生物学特性和免疫功能,实验克隆了罗氏沼虾胞质锰SOD基因 (MrcMnSOD),制备多克隆抗体,并分析在嗜水气单胞菌感染下该基因的表达模式。结果显示,嗜水气单胞菌感染可显著诱导MrcMnSOD在转录水平和蛋白质水平进行高表达。为探究MrcMnSOD参与免疫应答的机制,进一步的抑菌实验表明,该蛋白质可显著抑制3种革兰氏阴性细菌 (大肠杆菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌)和2种革兰氏阳性细菌 (无乳链球菌、金黄色葡萄球菌)的生长,且抑制作用与蛋白质浓度的关系不显著。研究表明,MrcMnSOD可能作为一种免疫相关分子参与免疫应答反应。本研究初步探讨了MrcMnSOD的免疫生物学功能,旨在为深入研究罗氏沼虾SOD的功能奠定相关基础。     

罗氏沼虾nanos1基因克隆、表达及亚细胞定位

为探究nanos1基因在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)生殖发育中的功能,克隆了罗氏沼虾nanos1基因,其cDNA序列全长2 811 bp,编码243个氨基酸;系统进化分析结果表明其与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的同源性最高,与鱼类的nanos1同源性较高,与哺乳类同源性较低。半定量PCR检测发现,nanos1在卵巢中特异表达。通过实时荧光定量PCR检测该基因在不同胚胎发育时期及幼体中的表达水平,结果显示：nanso1 mRNA在(卵)未受精时期表达量最高,显著高于(卵)受精期及胚胎发育各期(P<0.05);在胚胎发育期间,(卵)受精时期表达量最高,显著高于卵裂期且极显著高于胚胎发育后期(P<0.01);该基因在卵裂期的表达水平显著高于囊胚期至幼体期;而囊胚期至幼体期之间表达水平较低且无差异。原位杂交技术检测显示,nanos1 mRNA在卵原细胞及初级卵母细胞(Oc1,Oc2,Oc3,Oc4)的细胞质中表达。以上结果表明,nanos1与罗氏沼虾雌性生殖细胞发育有着密切的关系。     

外源Fe3+诱导罗氏沼虾铁蛋白mRNA的表达

探讨铁蛋白ferritin基因在罗氏沼虾中的组织表达分布及外源Fe3+对ferritin mRNA表达的影响。通过RT-PCR表明,ferritin mRNA在罗氏沼虾精巢、卵巢、肌肉、心脏、中肠腺和血淋巴中均有表达;荧光定量PCR结果证实了ferritin mRNA在中肠腺中表达量最高,其次是精巢。对罗氏沼虾进行FeCl3溶液肌肉注射后,荧光定量PCR结果表明,肌肉中ferritin mRNA表达量在注射后3 h增加了61倍,高水平的表达一直维持到8 h,随后在12 h表达量急剧地下降;卵巢中ferritin mRNA表达量在3 h有近4倍显著增加,在注射后48 h内一直维持在较高水平;心脏ferritin mRNA表达量在24 h后增加了8倍,48 h后表达量开始下降;在血淋巴、中肠腺和精巢注射前后均未发现有显著性差异(P>0.05)。以上实验结果表明,外源Fe3+可以诱导罗氏沼虾铁蛋白mRNA的表达。     

罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体的制备及应用

罗氏沼虾肌肉白浊病（whitish muscle disease of Macrobrachium rosenbergii）是一种发生在罗氏沼虾苗种阶段的流行病,发病虾苗出现肌肉白浊、白斑或白尾症状,死亡率高达60％以上,作者所在实验室在确定其病原是罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachiium rosenbergii Nodavirus,MrNV）的基础上,用MrNV免疫BALB／c小鼠,取小鼠脾细胞与SP2／0鼠骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA筛选阳性孔,经有限稀释法克隆,得到12株能特异分泌抗MrNV的单兜隆抗体（Mab）的杂交瘤细胞。注射小鼠,制备腹水单克隆抗体,ELISA效价为1：10^5～10^6。亚型鉴定结果表明,有6株单抗为IgG1型,4株甲抗为IgG2a型,2株单抗为IgG2b型。12株单抗与对虾白斑综合征病毒（WSSV）和桃拉综合征病毒（TSV）均无交叉反应：挑选效价高的腹水单抗2B5,建立了检测罗氏沼虾诺达病毒的三抗体夹心酶联免疫吸附测定（TAS—ELISA）法,该方法检测灵敏度达0．98ng左右。Wesrtem blot分析表明,2B5能与MrNV 43kD的外膜蛋白特异性结合。     

罗氏沼虾细菌性病原的分离与鉴定

从患病罗氏沼虾体内分离到1株细菌,经形态学检查、生理生化性质测定,鉴定为温和气单胞菌(Aeromonassobria)。人工注射感染健康虾,半致死剂量为3×105个/mL,证实温和气单胞菌为罗氏沼虾的致病菌。药敏试验结果表明,此病原菌对卡那霉素、新霉素、环丙沙星、氟哌酸、氯霉素、庆大霉素、妥布霉素、氟嗪酸、壮观霉素、复达欣、头孢呋肟、菌必治、先锋霉素Ⅵ、头孢噻吩等14种药物高度敏感。     

罗氏沼虾引种复壮技术的研究

长期以来,国内进行罗氏沼虾人工繁殖一直以池塘饲养的成虾作亲本,由此造成该虾种质退化,养殖经济效益下降.为提高其种质和养殖经济效益,于1996年和1997年从马来西亚引进野生原种繁育虾苗,进行复壮技术的研究.研究结果表明,野生种子代和杂交种子代的体长、体重明显高出本地的驯养种.种群间具有标准差、变异系数、第二步足与体长的比值相对较小、额齿数相对较多的特点.通常野生原种体形细长、体色淡黄透明、摄食旺盛、抗病力强、性成熟个体较大.野生种子代和杂交种子代幼体活力强,摄食旺盛,变态期延长,但人工育苗的难度大.研究结果显示,采用繁育难度相对较低的雌(本地驯养种)×雄(野生种)配组方式繁育杂交苗,难度较小,效果好.     

罗氏沼虾池塘水质改良研究

5~9月罗氏沼虾养殖池塘水质氨氮、亚硝酸盐和硫化氢分别上升了4.4、0.096和0.071 mg/L,水源水质3个指标分别上升了2.026、0.149、0.024 mg/L。使用微生物制剂改良罗氏沼虾养殖池水质,17 d后,试验池氨氮、亚硝酸盐和硫化氢分别下降了28.4%、28.8%和56.3%,微生物制剂起到了很好的改良水质作用。     

利用咸井水进行罗氏沼虾育苗技术研究

滨海盐碱地盐度为34．89的咸井水,经沉淀、曝晒、充气、消毒。施用EDTA2～3～106络合重金属离子,再用淡水调成盐度12的半咸水,进行罗氏沼虾育苗试验。当卵子由淡黄变为浅灰时,移至半咸水中孵化,每天5：00用120目筛绢网将孵出的蚤状幼体捞入幼体培育池,布他密度8～12万尾／m3。幼体在动期前,每天投喂卤虫无节幼体2～3次,Z6期后改投蛋黄、蛋羹,口喂8次。4000尾亲虾在290m3水体中,育出虾苗571．9万尾,幼体成活率25％以上。专家鉴定认为,在同类研究中居国内领先水平。     

罗氏沼虾幼体及仔虾消化酶活力的研究

以酶学分析方法对罗氏沼虾幼体及仔虾4种消化酶的活力进行研究。结果表明：罗氏沼虾早期个体消化酶类胰蛋白酶、胃蛋白酶和脂肪酶比活力均为蚤状幼体I朗(Z1)＜蚤状幼状IV期(z4)＜蚤状幼体x期(Zlo)＜仔虾I—Ⅱ期(PI—Ⅱ)，各期的类胰蛋白酶比活力明显低于胃蛋白酶；淀粉酶比活力为z＜P期，在pH值2—9．8的范围内，蛋白酶活性出现2个高峰分别为pH2．6—3．2和pH5．6—6．25淀粉酶最适pH值为5．2—5．8，呈弱酸性。     

非离子氨氮对罗氏沼虾幼体的毒性研究

通过非离子氨氮对罗氏沼虾幼体的急性致毒试验表明：Ⅴ期幼体９６ｈ的半致死浓度（ＬＣ５０）值为１．１４ｍｇ／Ｌ,安全浓度（ＳＣ）值为０．１１ｍｇ／Ｌ;Ⅸ期幼体９６ｈ的ＬＣ５０值为１．４０ｍｇ／Ｌ,ＳＣ值为０．１４ｍｇ／Ｌ,建议在育苗期间加强水质管理,有效地控制水体中非离子氨氮的浓度。     

罗氏沼虾仔虾及培育水的瞬时耗氧率研究

以淡化前后的罗氏沼虾仔虾(体长0.82 cm±0.06 cm)为研究对象,测定其瞬时耗氧率,并与溶解氧做相关分析.结果表明,在考虑水呼吸时,淡化前后的仔虾的瞬时耗氧率随溶解氧的升降而升降.同时还测定了各种研究对象所处的水环境的瞬时耗氧率.     

臭氧对罗氏沼虾育苗池水净化作用的研究

选择臭氧仪合适工作条件 :流速为 3L/ min,O3与水的混合时间为 6～ 8min。首先以臭氧仪全循环处理罗氏沼虾育苗池水 ,布苗后每天以臭氧仪原池循环处理池水 3～ 4 h。育苗周期内 ,试验池不换水、不添加任何药物 ,测得其 NO2 -- N、NH3- N和 COD等各指标的变化范围较对照池相应指标分别下降了 18.2 %～ 91.7%、2 5.0 %～ 39.3%和 16.5%～ 50 .0 %。试验池幼体较对照池的强壮、变态率高、变态速率快。出苗率为对照组的 1.7倍 ,出池仔虾平均体长与体重分别为对照池的 1.2与 1.4倍。     

卤虫的营养强化及其对罗氏沼虾幼体培育的影响

用小球藻强化培育卤虫，研究不同时间后卤虫体内脂肪酸的变化，并用此卤虫投喂罗氏沼虾幼体，研究其对罗氏沼虾幼体发育及成活的影响。实验结果表明，卤虫在强化12h后EPA及HUEA含量最高，强化时间延长至24h，EPA和HUFA含量反而下降。卤虫经营养强化可明显地促进罗氏沼虾幼体的生长发育并提高育苗成活率，而且在24h内随着强化时间的延长，效果越明显。     

罗氏沼虾养殖技术之一塑料大棚养殖二茬罗氏沼虾技术

在长江中下游地区,池塘养殖罗氏沼虾一般的放苗时间在5月上中旬,这是因为前期水温低且容易受冷空气的影响,在4月初室外水温还不到15℃,虾苗不能直接下池培育.利用简易塑料大棚进行罗氏沼虾苗种的前期强化培育,对提高罗氏沼虾的单位产量及商品虾提前上市,增加经济效益可以起到明显的作用.