大肠埃希菌O157∶H7 eae A基因的克隆及其表达质粒的构建

采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌O157∶H7021210的染色体DNA中扩增出eaeA基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2 800 bp的基因片段。T-A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET-eaeA。大肠埃希菌O157∶H7 eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及eaeA基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

为建立肠出血性大肠埃希菌O157:H7的多重PCR检测方法,针对O157菌特异性eaeA基因、fliC基因、志贺毒素基因(stx1和stx2)及rfbE基因设计5对引物,构建多重PCR反应体系,优化反应的引物浓度和温度检测其特异性和敏感性,并对牛、猪、鸡及犬等不同动物来源的样品进行了大肠埃希菌O157检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,敏感性达到5×10~3CFU。从检测阳性样本中均分离到目的菌。应用建立的方法在确定样品中是否含有大肠埃希菌O157的同时,还能对菌株毒力进行初步判定。成功建立了肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法,为该病原菌感染的预防和监测提供了简便、快速的技术手段,具有良好的应用前景。     

上海市动物及其产品中大肠埃希菌O157:H7带菌情况的调查

为了解上海市动物及动物产品中大肠埃希菌O 157∶H 7带菌情况及其毒力采集上海市猪、牛等动物粪便以及市场和超市猪肉、牛肉、牛奶、虾仁等样本568 份,应用免疫胶体金技术、分离培养、形态特征观察生化特性鉴定、血清学试验、多重引物PCR进行大肠埃希菌O 157∶H 7的分离、鉴定及毒力基因分析。结果表明,上海市动物及动物产品中存在大肠埃希菌O 157∶H 7,检出率为2.05%。其中牛粪、猪粪中检出率较高,分别为9.76%和8.57%。     

屠宰场分离大肠埃希氏菌O157:H7药敏试验及耐药基因分析

为了解2018年-2019年从广东省内生猪屠宰场分离的19株大肠埃希氏菌O157:H7耐药情况,采用微量肉汤稀释法测定阿莫西林等16种抗菌药物对分离菌株的最小抑菌浓度(MIC),并用普通PCR法检测blaNDM-1等10种耐药基因。结果表明,19株大肠埃希氏菌O157:H7分离菌株对不同抗生素存在耐药差异,其中对阿莫西林、氨苄西林、青霉素、氯霉素和恩诺沙星的耐药率均为100%,对头孢哌酮的耐药率最低为5.26%,其余10种抗菌药物的耐药率位于31.58%～84.21%之间;mcr-1、tetM、floR和rmtB 4种耐药基因未检出,blaNDM-1等6种耐药基因检出率范围为5.26%～89.47%。生猪屠宰场大肠埃希氏菌O157:H7耐药且多重耐药严重,分离株携带丰富的耐药基因。     

肠出血性大肠埃希菌O157疫苗研究进展

肠出血性大肠埃希菌感染是重要的新发传染病，在世界范围内多次暴发流行。肠出血性大肠埃希菌O157能引起人的出血性结肠炎、溶血性尿路综合征和血栓性血小板紫癜等全身性并发症。控制该病暴发流行的最好措施是免疫预防，但目前还没有研制出可用于人的疫苗。该菌的主要毒力因子包括染色体上原噬菌体编码的志贺毒素、LEE致病岛编码的毒力相关蛋白及质粒编码的肠溶血素等。研制中的O157疫苗种类包括亚单位苗、基因工程减毒活菌苗、重组载体活菌苗和转基因植物疫苗等。近年来，随着基因组序列的解析及分子生物学技术的发展，针对大肠埃希菌O157免疫预防研究取得了重要进展。     

O157∶H7型大肠埃希菌CRISPR/Cas系统结构的生物信息学分析

为了解O157∶H7型大肠埃希菌中成簇的规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）分布和结构特征及cas基因分布情况,本试验通过GenBank数据库和CRISPRdb database获得92株O157∶H7型大肠埃希菌全基因组序列、CRISPR位点位置、CRISPR的侧翼序列及cas基因簇的序列范围,利用多序列比对、启动子预测和RNA二级结构预测等方法分析细菌中CRISPR系统的特点。结果显示,O157∶H7型大肠埃希菌的基因组存在3个CRISPR位点（CRISPR1、CRISPR2和CRISPR3）,每个CRISPR位点上的序列一致;CRISPR1和CRISPR2的重复序列可形成茎环状结构,环上的碱基易发生变化;CRISPR2中存在一段长451 bp的序列（命名为序列X）,该序列X将CRISPR2分为2个部分CRISPR2a和CRISPR2b,其碱基A和T比例为74%,在91株O157∶H7型大肠埃希菌中均存在该序列,在该序列中可预测出至少有1个启动子和9个转录因子结合位点;侧翼序列中的疑似前导序列位于CRISPR2下游,序列长340 bp,其碱基A和T比例为69%,在92株O157∶H7型细菌中均存在该序列,其可预测出至少有1个启动子和3个转录因子结合位点;在20株O157∶H7型大肠埃希菌的全基因组序列中,有15株具有完整的cas基因簇,有5株缺乏cas3基因。本试验结果表明,O157∶H7型大肠埃希菌的CRISPR系统结构稳定,序列具有较高保守性,cas基因簇也相对保守。CRISPR2的结构与其他类型大肠埃希菌有较大差别。本研究发现的序列X在O157∶H7型大肠埃希菌分布广泛且序列保守,可作为鉴定O157∶H7型大肠埃希菌的潜在分子靶标。     

大肠肝菌O157:H7紧密素研究进展

WHO不久前指出在过去的20年里,世界上出现了约30种新的传染病,1982年美国首次报告的由大肠埃希菌O157:H7引起的出血性肠炎就是其中之一。大肠肝菌O157:H7属于肠出血性大肠埃希氏菌(EnterohemorrhagicE.coliEHEC),尽管大肠杆菌O157:H7高致病力的机制尚未明了,但已确定紧密素(int     

国内外致泻大肠埃希氏菌O157:H7的检测标准比较及建议

致泻大肠埃希氏菌O157:H7（STEC O157:H7）是大肠埃希氏菌中致病性最严重的一种食源性致病菌,主要存在于牛肉、牛奶、水果及其制品中,对身体健康造成很大危害,甚至引发死亡。食品中STEC O157:H7检测尤为重要。本文对国内外STEC O157:H7的检测标准进行比较,提出我国标准在样品前处理、快速筛选方法的应用等方面需要加强,以便为该菌快速准确检测提供帮助,实现与国际标准化体系建设接轨,满足实验室检测需要。     

猪场环境大肠埃希菌耐药质粒消除研究

为了解耐药质粒消除对大肠埃希菌耐药性及其他生理特性的影响,参考前期试验分离出的8株携带aac(6')-Ib质粒耐药基因的大肠埃希菌的药敏试验.选取1株耐药性最强菌株用高温及SDS进行耐药质粒消除,PCR检测aac(6')-Ib基因.结果显示,耐药质粒成功消除,耐药性消失,且细菌在不含抗生素条件下培养,耐药性消除状态可稳...     

大肠杆菌O157:H7 rfbE基因和fliC基因的克隆与序列分析

根据已发表的E．coli O157：H7 EDL933株的rfbE基因和fliC基因，设计了两对引物，分别对两个O157：H7，菌株的rfbE基因和一个菌株的fliC基因进行PCR，并将PCR产物克隆于pMD18-T栽体质粒。测序结果表明，获得到了与理论相符的582bp rfbE基因片段和802bp fliC基因片段。一株菌的rfbE基因存在无意义突变（两个）。而另一株菌fliC基因有一个有意义突变（aac→gac）     

大肠杆菌O157 Z4182基因的克隆与表达

根据大肠杆菌0157z4182基因设计1对引物，并在其5'端分别加入NcoI、XhoI酶切位点，用聚合酶链反应（PCR）从本试验用的大肠杆菌O157及1株产志贺毒素大肠杆菌（STEC）08、1株肠道聚集粘附大肠杆菌（EAggEC)和1株产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）菌株中也扩增出了803BP的DNA片段。以大肠杆菌0157菌株94H的DNA为模板，用上述引物做PCR，将其产物连接到载体质粒pET28a( )，然后转化到宿主菌大肠杆菌LE392，从该菌中提取重组质粒，再将其转化到表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），用PCR，限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定，表明Z4182基因定向克隆到了载体质粒Pet28a( )。将转化子培养并经IPTG诱导后，做SDS-PAGE电泳，表明该菌株可以表达Z4182基因。本试验为阐明大肠杆菌O157Z4182基因的分布及探讨该基因产物的功能和致病作用奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7噬菌体的分离纯化

分离纯化了抑制肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E coli,EHEC）0157：H7的噬菌体,并对其进行效价测定。将宿主菌EHEC0157：H7培养制成悬液后与污水样品37℃共培养16h,将培养物离心、过滤除菌后得到该菌的噬菌体原液。噬菌体原液采用双层琼脂平板法进行5次纯化,得到直径相同的噬菌斑。纯化后噬菌体的效价达到12×10^pfu。电镜观察表明,该噬菌体呈蝌蚪状。根据ICTV对病毒的分类标准,该噬菌体属长尾噬菌体科,为烈性噬菌体。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与原核表达

根据已经公布的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计合成了1对VP1基因特异性引物,应用RT-PCR技术从O型口蹄疫病毒标准毒株扩增得到VP1基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组原核表达质粒pET-28a-VP1,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,O型口蹄疫病毒VP1基因在大肠埃希菌BL21中得到了正常表达,所表达的融和蛋白与标准O型口蹄疫病毒阳性血清具有特异性抗原/抗体反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性.     

出血性大肠杆菌O157eae-stx1/2B融合基因的构建和表达

构建表达eae和stx1／2B的融合基因，克隆eae基因的C端280个氨基酸残基(Int280)基因部分，以正确地阅读框定向插入到含有stx1／2B融合基因的质粒，构建重组质粒，将其转化于BL21(DE3)，用IPTG进行诱导表达，经SDS—PAGE电泳检测，该融合蛋白获得了高效表达。薄层扫描分析表明：目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的50．67％。由于该融合蛋白由eae、stx1B、stx2B等三部分抗原组成，可刺激机体产生针对紧密素和StxB的抗体，在EHEC O157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7研究进展

本文综述了近年来肠出血性大肠杆菌O157:H7的病原学、流行病学、临床诊断及预防控制等方面的研究进展。表明牛是该菌的主要贮存宿主,主要通过食源性途径传播,以患者出现出血性结肠炎、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并发症为基本特征。目前对该菌的自然携带宿主及其引起的感染尚缺乏有效的治疗手段,因此对该菌的防控就显得尤为重要。     

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白     

新疆牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定及ERIC-PCR基因分型研究

为了了解牛源大肠杆菌（E.coli）O157∶H7在新疆地区的污染状况以及遗传多样性,探究不同地区分离菌株的遗传关系,为控制牛源E.coli O157∶H7的传播提供试验依据。将采集的样品在EC肉汤中进行增菌（37 ℃、180 r/min）,接着将增菌液划线接种到SMAC平板上,37 ℃培养箱中过夜培养18 h左右。挑取SMAC平板上白色或无色单菌落接种MUG培养基,37 ℃培养18 h左右,将无荧光样品接种到SMAC平板上,37 ℃培养18 h左右,隔天挑取白色或无色单菌落进行PCR鉴定,具有rfbE和fliC基因条带的即为阳性菌株。将阳性菌株进行肠杆菌基因间重复共有序列扩增（ERIC-PCR）指纹图谱聚类分析,分析菌株之间的同源性关系。ERIC-PCR结果显示,相似性100%的菌株有3组。从伊犁地区分离到的菌株差异性最大,具有6种分型;其次是乌鲁木齐,具有4种分型。菌株来源多样性最多的在D簇,由此可见通过ERIC-PCR分型,可以进行溯源观察。ERIC-PCR能够区分特定采样点或物种的分离物,它能够证明从不同来源的菌株之间,存在着某些相似的ERIC特性,并聚集在同一个簇群中。该研究中筛选出的E.coli O157∶H7菌株具有广泛的遗传多样性,该方法对于检测不同物种间的细菌差异非常敏感。由此可见ERIC-PCR可以作为E.coli O157∶H7常规监测和鉴定的一个有效的工具。     

牛皮蝇Hypodermin B 基因的克隆及原核表达载体构建

参照牛皮蝇Hypodermin B(HB)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以牛皮蝇总RNA为模板利用RT—PCR扩增牛皮蝇HB基因,并对扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,克隆的牛皮蝇HA基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97．2％和99．3％。同时,将该基因与原核表达载体．PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。     

鹿流行性出血病病毒VP7基因的克隆及原核表达

根据已经扩增的鹿流行性出血病病毒(EHDV)VP7基因序列,设计一对扩增VP7基因特异性引物,用RT-PCR从血清I型EHDV(EHDV-1)总RNA中扩增VP7基因,并将其克隆到原核表达载体pBAD/Thio中,构建了重组原核表达质粒pBAD/Thio-EHDV VP7。将表达载体转入大肠埃希菌(E.coliLMG194),用L-阿拉伯糖诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验结果表明,EHDV VP7基因在LMG194中得到了表达,其表达产物可以与EHDV阳性血清特异性反应,说明该融和蛋白具有免疫学活性。