重组Ⅸ蛋白检测犬传染性肝炎病毒抗体间接ELISA方法的建立

[目的]建立用重组蛋白Ⅸ检测犬传染性肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。[方法]分别设置不同抗原包被浓度、包被条件、封闭液等,比较ELISA反应效果。[结果]最佳抗原包被浓度为5.0μg/ml;最佳包被条件为,37℃包被1 h、4℃过夜;最佳封闭液为5%BSA;HRP-羊抗犬IgG的最佳工作浓度为1∶1 600。[结论]建立了检测犬传染性肝炎病毒抗体的间接ELISA方法。     

三种Dot-ELISA法检测Bt杀虫蛋白的研究

运用3种Dot-ELISA法对提纯的Bt杀虫蛋白进行检测,结果表明:直接法Dot-ELISA的最低可检测值为4.06~8.13 ng,夹心法Dot-ELISA的最低可检测值为8.13 ng,间接法Dot-ELISA(AKP-IgG)的最低可检测值为2.03 ng,间接法Dot-ELISA(HRP-IgG)的最低可检测值为2.03~4.06 ng。三者相比,以间接法Dot-ELISA的效果较好。     

检测新城疫抗体的Dot-ELISA方法的建立及其与HI方法的比较研究

建立了检测鸡群中新城疫病毒(New Castle disease virus,NDV)血清抗体的Dot-ELISA方法,对Dot-ELISA的最佳反应条件进行了研究,初步确定了该方法的感染保护临界值为7log2。通过对大量临床血清样本的检测,表明Dot-ELISA与血凝抑制试验(HI)相比,具有敏感、特异和稳定性好的优点。     

利用Dot-ELISA检测Bt棉杀虫蛋白的研究

用苏云金芽孢杆菌HD-1和HD-68晶体杀虫蛋白的碱溶产物作为抗原,制备相应的抗血清,建立了检测Bt杀虫蛋白的Dot-ELISA,可检测Bt杀虫蛋白的最低水平为87.5ng/ml。用Dot-ELISA对2个转基因抗虫棉和它们的亲本进行了检测,并与生物学测定的抗虫性进行比较,结果基本一致。因此,对测定大批量转基因抗虫棉的抗虫性,Dot-ELISA是一个快速、敏感、特异、有效的方法。     

监测重组蛋白EgM9免疫犬的特异性抗体变化

[目的]探索EgM家族重组蛋白(EgM 9)与Iscom为佐剂结合免疫犬后血清抗体变化规律.[方法]利用间接ELISA法检测免疫组与对照组血清特异性抗体(IgG、IgGi,IgG2,IgA、IgM和IgE)的变化规律,并以Western-blotting方法进行验证.[结果]经统计学方法分析显示,免疫组与对照组特异性抗体IgG及其亚类IgG1,IgG2,差异极显著(P <0.01),而特异性抗体IgA,IgM和IgE差异不显著(P > 0.05).[结论]证实EgM家族重组蛋白(EgM 9)与Iscom为佐剂结合能引起犬特异性免疫应答.     

联合检测鸭瘟和鸭病毒性肝炎血清抗体的Dot-ELISA方法研究

本研究提取和纯化了鸭瘟病毒(DPV)和鸭肝炎病毒(DHV)的抗原作为Dot-ELISA的膜载抗原,以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG作为ELISA反应的第二抗体,建立了能够同时检测DPV和DHV抗体的Dot-ELISA方法。与中和试验相对比,本方法具有敏感、特异、快速的优点。     

禽流感(H9N2亚型)酶标抗体的制备及双抗夹心Dot-ELISA检测方法的建立

采用AIV灭活油乳苗（H9N2）对AIV非免疫鸡进行接种并获取高免血清，取高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法，经过Sephadex G25层析柱提纯后可获得纯度很好的IgG。将IgG应用过碘酸钠法标记辣根过氧化酶（HRP），制备禽流感酶标抗体（IgG—HRP），利用所提取的AI—IgG和所制备的禽流感酶标抗体按照双抗夹心Dot—ELISA试验操作步骤，采用方阵法分别摸索包被抗原及酶标抗体的最佳浓度，以及各步反应时间等最佳反应条件，以建立一种优化的AIV双抗夹心Dot—ELISA检测法。结果表明，所制备的AI高免血清HI效价为10log2；AI酶标抗体克分子比值为2．45；优化的Dot—ELISA各条件为：包被AI—IgG最佳稀释倍数为1：50；最佳封闭剂为1％牛血清白蛋白；AI酶标抗体最佳稀释倍数为1：100；待检抗原与2种抗体的感作时间均为0．5h（37℃）。优化后的检测方法可在2．5h内诊断结果。制备好的包被膜在4℃下保存2个月不影响其效果。而且敏感性提高了3倍，与新城疫病毒液、传染性支气管炎及减蛋综合症病毒液无交叉反应。     

用重组HN蛋白建立新城疫抗体检测的ELISA方法

用T4噬菌体表达的重组新城疫病毒HN蛋白(rHN)为包被抗原,建立新城疫抗体检测的酶联免疫吸附实验(rHN-ELISA).结果表明,抗原最适包被浓度为1.6μg/100μL,待检血清最适稀释度为1:80,鸡血清样品的光吸收值OD450大于0.126可判定为阳性结果,而SPF鸡血清,非免疫鸡血清以及MD,IBD,IB,ILT,AI阳性血清的检测结果均为阴性.对批内和批间样品重复检测的变异系数分别为3.7%～8.5%和3.1%～7.4%.人工感染NDV的SPF鸡第3 d即可用rHN-ELISA检测到抗体,灵敏度明显高于HI和AGP试验.因此,rHN-ELISA是1种特异、敏感、快速的ND抗体检测方法.     

用重组HN蛋白建立新城疫抗体检测的ELISA方法

用T4噬菌体表达的重组新城疫病毒HN蛋白（rHN）为包被抗原,建立新城疫抗体检测的酶联免疫吸附实验（rHN-ELISA）.结果表明,抗原最适包被浓度为1.6μg/100μL,待检血清最适稀释度为1：80,鸡血清样品的光吸收值OD450大于0.126可判定为阳性结果,而SPF鸡血清,非免疫鸡血清以及MD,IBD,IB,ILT,AI阳性血清的检测结果均为阴性.对批内和批间样品重复检测的变异系数分别为3.7%～8.5%和3.1%～7.4%.人工感染NDV的SPF鸡第3 d即可用rHN-ELISA检测到抗体,灵敏度明显高于HI和AGP试验.因此,rHN-ELISA是1种特异、敏感、快速的ND抗体检测方法.     

重组NP蛋白抗原检测SIV抗体间接ELISA方法的建立

用纯化的H9N2亚型猪流感可溶重组NP蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流感抗体的间接ELISA方法.ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为12.5 μg/mL,37℃ 1 h,4 ℃过夜;血清稀释度为1∶40;酶标SPA稀释度为1∶10 000,37 ℃温育40 min,底物显色37 ℃ 15 min.经重复性试验、交叉试验、竞争抑制试验等试验,结果表明该方法特异性强、灵敏度高、重复性好.利用TG-ROC软件确定了自制ELISA(NP-ELISA)酶标板的临界值为0.20,特异性和敏感性分别为95.83和91.43.与美国IDEXX试剂盒相比较,符合率为94.00,无显著性差异.用已建立的ELISA方法检测临床血清样本356份,总阳性率为35.40.     

单抗直接Dot-ELISA检测禽脑脊髓炎病毒抗原

本研究在已制备的 AEV单抗基础上建立了检测 AEV抗原的直接 Dot- ELISA方法。该方法对 AEV最低检出量为 8.0 3μg.m L-1。人工感染 1日龄 SPF鸡 ,取临床发病鸡 (6～ 1 3日龄 )相应病料 ,各病料样本病原阳性检出率分别为 :脑 98% ,胰 94% ,十二指肠 80 % ,腺胃 85%。对 1 0 0份临床自然发病鸡病料检测 ,阳性检出率为 90 %。对 1 0份 AEV病原分离阳性样品检测阳性率为 1 0 0 %。     

应用重组MSG1蛋白检测猪附红细胞体抗体的ELISA检测方法的建立

 【目的】针对猪附红细胞体g1基因编码的MSG1表面粘附蛋白（rMSG1）和以此蛋白制备的多克隆抗体,建立相应的ELISA方法进行猪附红细胞体的临床检测,并进行效果评估,以获得一种猪附红细胞体感染的有效检测手段。【方法】将MSG1-pET28c_E.coli BL21菌株,在适宜的条件进行诱导表达,经菌体破碎、层析等步骤获取纯化的目的蛋白。以纯化的rMSG1制备免疫原接种小鼠,获取符合要求的多克隆抗体。以rMSG1和多克隆抗体建立ELISA检测方法,分析其敏感性、特异性、符合性和重复性。【结果】接种后获得了符合效价的抗血清;基于rMSG1的间接ELISA方法临床检测猪附红细胞体感染率为46.25%,其中阳性样本对已知小鼠抗血清有明显的阻断作用,并且与其它一些抗原无交叉反应;此ELISA方法的特异性和敏感性分别可达到97.06%和95.92%,较间接血凝试验(IHA)有更高的检出率。【结论】结果显示MSG1具有良好的抗原性,建立的ELISA方法具有较高的敏感性、特异性、符合性和可重复性,在临床检测中可以取得理想的效果。     

重组水泡性口炎病毒基质蛋白制备及ELISA检测方法的建立

水泡性口炎由水泡性口炎病毒(VSV)引起。VSV基因组编码5个结构蛋白,其中基质蛋白(matrix protein,M)是其重要毒力因子,可阻遏宿主细胞mRNA由胞核向细胞质的转运,并抑制感染病毒的细胞产生I型干扰素IFNα/β,使病毒得以快速繁殖。本实验克隆了印第安那型VSV的M基因,在大肠杆菌表达系统中表达制备重组M蛋白,以M蛋白为抗原建立了检测特异M蛋白抗体的间接ELISA方法。采用建立的ELISA方法分析了VSV感染小鼠体内M蛋白抗体的变化规律。     

重组ASl6蛋白抗原检测猪蛔虫抗体间接ELISA方法的建立

[目的]建立检测猪蛔虫抗体的间接ELISA方法。[方法]用猪蛔虫重组ASl6蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定试验确定ELISA的最佳工作条件,包括抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度、最佳包被液、抗原封闭时间、血清反应时间、酶标二抗工作时间和间接EusA判定标准,并通过交叉试验现场对1200份猪血清样本采用该试验建立的EusA和AGP同时进行蛔虫抗体的检测。[结果]ELISA的最佳工作条件是：抗原包被浓度为10μg／ml,37℃1h,4℃过夜;血清稀释度为1：80;酶标SPA稀释度为1：t0000,37℃孵育45min。该试验制备的ELISA酶标板的临界值为0．196。交叉试验检测表明,ELISA方法阳性检出率为45％,而AGP阳性检出率为30％。该方法具有特异高、快速、敏感等特点。[结论]研究结果证实重组ASl6蛋白具有良好的反应原性,可以用来建立ELISA方法诊断猪蛔虫病。     

饲料中沙门氏菌的分离鉴定与Dot-ELISA检测

[目的]建立检测饲料中沙门氏菌的Dot-ELISA法。[方法]采用Dot-ELISA法,对随机采集自西宁市某饲料厂的100份成品饲料、85份鱼粉和50份精蛋白进行了沙门氏菌检测。通过生化试验和血清学试验对饲料样品中的细菌进行了进一步的鉴定。[结果]通过Dot-ELISA检测,成品饲料、鱼粉和精蛋白中的沙门氏菌阳性率分别为38.00%、62.35%和60.00%。Dot-ELISA法与常规分离鉴定技术的符合率为82.23%。[结论]Dot-ELISA法具有较好的特异性和敏感性,与常规分离技术具有较高的符合率,可以用于饲料中沙门氏菌的检测。     

利用σ 3和σ 2重组蛋白检测禽呼肠孤病毒抗体ELISA的建立

将纯化好的两个ARV结构蛋白σ3和σ2作为包被用抗原,分别进行间接ELISA,并确定它们的最佳抗原包被浓度分别为9．5、12．0μg／mL;一抗血清的稀释度为1：200;HRP酶标羊抗鸡IgG稀释度为1：5000,初步建立了能检测ARV抗体的σ3-ELISA、σ2-ELISA以及σ3、σ2两个蛋白同时包被的σ3-σ2-ELISA检测方法。分别用上述3种方法对制备的ARVSPF鸡阳性血清进行检测,结果阳性检出率分别为90．91％、69．70％和100％。表明σ3-σ2-ELISA方法在ARV抗体检测方面具有较高的敏感性。     

应用斑点ELISA技术检测副溶血弧菌

研究了应用斑点酶联免疫吸附试验(Dot-Enzym e L inked Immunosorbent Assay,Dot-ELISA)技术检测副溶血弧菌Vibrio parahaem olyticus的方法。根据棋盘试验,确定副溶血弧菌免疫血清最佳工作浓度为1∶200,酶标抗体最佳工作浓度为1∶100,以出现明显清晰斑点者判定为阳性。用该方法检测时,副溶血弧菌呈阳性,哈维氏弧菌V.harveyi、嗜水气单胞菌Aerom onas hydrophila、河流弧菌Vf.luvialis biotype、溶藻弧菌V.alginolyticus、大肠杆菌Escherichia coli均呈阴性。斑点ELISA方法不仅具有快速、经济的特点,而且可用肉眼直接判定结果,适合在基层单位应用推广。     

检测牛血吸虫病的重组LHD-Sj23蛋白乳胶凝集试验的建立

利用原核表达的日本血吸虫重组LHD-Sj23蛋白作为抗原致敏乳胶,建立诊断牛血吸虫病的乳胶凝集试验(LAT).用制备的乳胶抗原分别检测牛结核杆菌、牛泰勒虫、牛巴贝斯虫、牛口蹄疫、牛边虫、牛传染性支气管炎阳性血清,结果均为阴性,说明建立的乳胶凝集方法具有良好的特异性.用所建立的LAT方法与ELISA方法同时检测169份牛血清,结果表明,建立的LAT方法的特异性为94.29%.敏感性为93.10%,两种方法的符合率为94.08%(P>0.05),差异不显著.用同一批乳胶抗原检测7份牛血清,5次检测结果一致,说明致敏的乳胶抗原是稳定的.保存期试验结果表明,致敏乳胶在25℃可保存1个月,在4℃可保存3个月.这表明建立的LAT方法稳定、特异性强、灵敏度高、操作简便快速,无需昂贵仪器,适宜在临床上推广应用.