条斑紫菜耐高温杂交重组品系的筛选与特性分析

为改善条斑紫菜优良品系TM-18藻体颜色偏红的弱点,本研究以红色型突变品系(TM-18,特点:藻体偏红色;生长快,色素蛋白含量高,具有一定的耐高温性)为父本;绿色型突变品系(OMO-1,特点:藻体绿色,生长较慢,色素蛋白含量低,耐高温性差)为母本进行种内杂交,从杂合丝状体的F1叶状体中,分离出了优良品系TW-9。通过比较它与亲本品系的特性,获得以下结果:在常温(18°C)和高温(24和25°C)下培养13 d,TW-9品系的壳孢子存活率分别为TM-18品系的1.0、1.1和1.1倍,以及OMO-1品系的1.1、4.7和7.2倍。在18°C组,3个品系的壳孢子苗畸形率无显著性差异,但在24和25°C组,TW-9品系的畸形苗率比TM-18品系分别降低了20.3%和29.5%,比OMO-1品系分别降低了74.8%和69.5%。将在18°C下培养40 d的叶状体分别置于18、24和25°C再培养10 d,TW-9品系的绝对生长率分别为TM-18品系的0.9、1.5和0.8倍,以及OMO-1品系的1.4、1.5和28倍。此外,在24°C下培养25 d或在25°C下培养10 d,OMO-1品系的藻体腐烂严重,最后完全解体;TM-18和TW-9品系藻体在24°C下培养25 d只出现轻微卷曲,但在25°C下,TM-18品系培养15 d就腐烂至完全解体,而TW-9品系培养30 d也只是轻微腐烂。在18°C下培养40 d的TW-9品系叶状体分别再在18和24°C下培养15 d,总藻胆蛋白含量分别为61.5和77.8 mg/g,分别为OMO-1品系的1.4和1.4倍,但与TM-18品系的含量相比无明显差异。在18°C下培养55 d的叶状体平均厚度,TW-9品系为25.6μm,分别比TM-18和OMO-1品系降低了13.5%和17.7%。另外,3个品系的壳孢子放散量无显著性差异。研究表明,TW-9品系不仅具有与TM-18品系相似的特性,如叶状体生长快、色素蛋白含量高、壳孢子放散量大等特性,并且它的藻体更薄、更耐高温,其颜色与野生色相近,符合生产栽培的要求,有望被培育成适宜栽培的新品种。     

条斑紫菜耐高温品系的特性分析与海区中试

通过室内培养和海区栽培实验验证条斑紫菜耐高温品系(T-17)优良性状的稳定性和栽培适用性。结果显示,与野生型品系(WT)相比,T-17品系的叶状体,在生长率、最大光化学效率、主要光合色素含量、藻体厚度和产量等方面均存在明显的优势。将在18℃下培养50 d的小苗再在18、22和24℃下培养35 d,T-17的绝对生长率分别为WT的17.71、15.81和33.00倍,特定生长率分别为WT的4.59、4.38和9.15倍,最大光化学效率分别为WT的1.17、1.29和1.58倍。WT的小苗在22、24和25℃下再分别培养25、15和10 d,叶片的颜色就转深变黑,藻体卷曲变硬,出现腐烂;而T-17的小苗在相同培养条件下培养相同的天数仍表现出良好的生长状态,藻体不变硬,无腐烂,说明T-17具有较强的耐高温性。此外,在日龄65 d的叶状体中,T-17的Chl.a和总藻胆蛋白(PE+PC)的含量分别是WT的1.45和1.54倍;T-17的平均厚度比WT减少26.4%。T-17的壳孢子放散量与WT相比差别不显著。在海区栽培试验中,T-17品系前4次收割的鲜菜总重量比当地栽培野生种(Wt)增加了16.3%,1~4次收割的鲜菜的最大光化学效率分别为Wt的1.06、1.12、1.17和1.27倍,而Chl.a含量分别是Wt的1.41、1.49、1.52和1.91倍,总藻胆蛋白含量分别是Wt的1.94、2.04、2.03和2.34倍。研究表明,与野生型品系相比,T-17品系在产量、品质和耐高温性等方面均明显提高,且性状稳定,生产适用性好,有望在生产上规模化栽培。     

条斑紫菜优良品系(LC-14)的筛选与特性分析

从条斑紫菜(Pyropia yezoensis)绿色突变体和红色突变体种内杂交产生的F_1叶状体中,分离出新品系LC-14。该品系的F_1叶状体在生长速度和品质等方面均显著优于条斑紫菜野生型栽培品系(WT)。日龄70 d的叶状体平均长度和湿重,LC-14品系分别为106.53 cm和3.07 g,分别是WT品系的4.39和10.27倍。培养至第55天,LC-14品系的3种主要光合色素(叶绿素a、藻红蛋白和藻蓝蛋白)含量分别为9.85 mg/g、52.09 mg/g和23.26 mg/g,分别比WT品系提高了65%、65%和49%,而其藻体的平均厚度(20.89μm)反而降低了32%。此外,LC-14品系的壳孢子放散总量为761.32×10~4 ind/壳,是WT品系的1.28倍。上述结果表明,LC-14品系具有生长快、品质优、壳孢子放散量大的优点,藻体颜色与野生色(棕褐色)相近,是条斑紫菜的优良品系,有望在生产中应用。     

条斑紫菜种内杂交优良品系的筛选与特性分析

以条斑紫菜(Pyropia yezoensis)野生型品系(Py-WT,特性:颜色好,生长慢,藻体厚,主要光合色素含量低,耐高温性差)的叶状体作为父本,红色突变型品系(Py-HT,特性:颜色较红,生长快,藻体薄,主要光合色素含量高,具一定的耐高温性)的叶状体作为母本进行种内杂交,从杂交丝状体的子一代叶状体中分离出1个耐高温的重组优良品系(HW-4)。在24℃下培养13 d,父本Py-WT和母本Py-HT品系的壳孢子存活率分别为18.3%和65.2%,而HW-4品系的壳孢子存活率为77.5%。在25℃下培养13 d,3个品系(Py-WT、Py-HT和HW-4)的壳孢子存活率分别为16.9%、47.1%和67.3%。在高温(24℃和25℃)下培养的HW-4品系的壳孢子存活率分别是Py-WT品系的4.2倍和4.0倍,是Py-HT品系的1.2倍和1.4倍。常温(19℃)培养50 d的壳孢子萌发体,在24℃再继续培养25 d,Py-WT、Py-HT和HW-4品系的叶状体平均体长分别增加了0.6、0.6和2.3倍,HW-4品系的平均体长分别是Py-WT和Py-HT品系的5.9倍和2.6倍;在25℃再培养25 d,Py-WT、Py-HT和HW-4品系的平均体长分别增加了0.3、0.4和1.5倍,HW-4品系的平均体长分别是Py-WT和Py-HT品系的5.3倍和2.1倍。另外,两个亲本品系的叶状体在高温(24℃和25℃)下培养10~15 d会卷曲和腐烂,培养至25 d时藻体严重卷曲且大面积腐烂;而HW-4叶状体在高温下培养25 d时藻体仅轻度卷曲,35 d后仍未见腐烂现象。常温(19℃)培养的HW-4叶状体分别在常温(19℃)和高温(24℃和25℃)继续培养15 d,总藻胆蛋白含量分别为76.0、111.1和132.3 mg/g,分别是Py-WT品系的3.1、2.2和2.0倍,是Py-HT品系的1.2、1.1和1.1倍,均显著高于双亲品系(P0.05)。3个品系的壳孢子放散量之间无显著性差异(P0.05)。上述结果表明,与亲本品系相比,HW-4品系的壳孢子和叶状体的耐高温性均明显提高,叶状体的生长速度和色素含量也大幅度提高,是一个生产适用性好的优良品系。     

上海低盐海区的坛紫菜栽培试验

为建立低盐度海区的紫菜栽培模式,选用人工选育的耐低盐坛紫菜品系(DY-1),于2010—2013年在芦潮港海区开展了生产性栽培试验.2010—2011年度试验栽培面积为0.2 hm2,获得了初步成功;2011—2012和2012—2013两个年度试验栽培面积均为1 hm2,生产期分别为181 d和174 d,均采收了4...     

条斑紫菜叶状体的养殖

紫菜营养丰富，味道鲜美，是人们自古以来喜爱的珍贵食品。早在隋唐时期，孟铣在《食疗本草》中就对紫菜进行过描述。在宋朝时据《平潭县志》记载，紫菜已列为贡品，明朝年间，李时珍在《本草纲目》中曾提到紫菜能“主治热气”，并建议“凡瘿结积块之疾，宜常食紫菜”。近年来据报道，     

UV-B紫外辐射对条斑紫菜生理生化的影响

条斑紫菜(Pyropia yezoensis)作为一种生长在潮间带的经济海藻,在适应干露失水时的高紫外辐射上有其独特的特性。本研究以无UV-B辐射为对照组,0.5 W/m2(低)和2 W/m2(高)UV-B辐射为实验组,检测条斑紫菜对UV-B紫外辐射响应的叶绿素荧光光合参数、多光谱荧光参数以及酪氨酸酶活性的变化。结果显示,受到UV-B辐射的条斑紫菜的叶绿素荧光光合参数(QY_max、NPQ_Lss、qP_Lss和Rfd_Lss)随辐照时间呈不同程度的下降趋势,并且高辐射强度下的各光合参数值低于低辐射强度,表明条斑紫菜光合作用受到辐射的负面影响;极早期胁迫参数F440/F690和F440/F740的差异表明,2 W/m2 UV-B辐射组条斑紫菜比0.5 W/m2辐照组更早(1 h)进入胁迫状态,且UV-B辐射下条斑紫菜酚醛类物质减少;与叶绿素浓度呈负相关的参数F690/F740变化表明,0.5 W/m2辐照组叶绿素浓度高于对照组,而在辐照3 h内低于2 W/m2辐照组,2 W/m2辐照组叶绿素浓度则先上升,并在辐照4 h下降,至6 h呈显著降低,说明藻体可耐受较低UV-B辐射,而高UV-B长时间辐照对藻体造成明显的伤害;对酪氨酸酶的活性检测结果表明,受到UV-B辐照的条斑紫菜酪氨酸酶活性显著高于对照组,且高辐照组的酶活性高于低辐照组的酶活性。     

不同品系条斑紫菜丝状体育苗试验

为进一步优化我国北方地区的条斑紫菜育苗技术,并筛选适宜的条斑紫菜种菜品系,于2018年5月-10月,在山东省烟台市牟平海边基地开展了黄优1号新品系、大连野生品系、青岛野生品系、赣榆生产品系、半叶紫菜共5个品系的条斑紫菜丝状体常温育苗试验,对育苗期间的温度、光照强度、营养盐等环境因子的调控方法进行了详细的记录,对育苗期间发生的病害及其防治方法和管理操作要点进行了总结。     

条斑紫菜6个品系的SRAP分析

为鉴别条斑紫菜不同品系的种质,使用相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记对条斑紫菜的5个选育品系和1个野生品系进行遗传分析,结果从35对引物组合中筛选出可扩增出稳定清晰条带的组合11对,共获得131个扩增位点,其中多态性位点125个,多态性比例高达95.42%。6个品系 间的遗传距离为0.364 3～0.867 9,平均为0.593 0。用UPGMA法进行聚类分析,结果将6个品系分为2个群,所反映的亲缘关系与各品系的来源基本一致,说明SRAP 标记技术可以成为条斑紫菜品系间遗传分析的有效工具。在131个多态性位点中,选择扩增出的4个位点构建了6个品系的指纹图谱。另外,通过ME1/EM6引物组合 扩增得到耐高温品系TM-18的特异性条带,经回收测序和重新设计引物,该条带在其丝状体和叶状体DNA中均能稳定地被扩增出来,可用于该品系的种质鉴别 。     

条斑紫菜营养细胞的分离培养试验

本文介绍了用条斑紫菜的单个营养细胞培养成叶状体的试验。试验表明，单个营养细胞，在适宜的培养液中有可能经过20天培养成小紫菜叶状体；其成活率为33％左右。此外，还介绍了冷冻度夏后的叶状体单个营养细胞的培养试验和不同含水量的叶状体营养细胞的培养试验。     

条斑紫菜双单倍体群体主要经济性状的遗传分析

条斑紫菜叶状体主要经济性状的遗传参数及相互间的遗传关系,是开展分子育种的基础。实验以条斑紫菜野生型品系(Py-WT2,父本)和红色突变型品系(Py-HT,母本)杂交后产生的杂合丝状体为材料,构建由152个品系组成的条斑紫菜双单倍体(DH)群体。该群体叶状体的6个经济性状(L50、W50、FW50、SGR-L、SGR-W、SGR-FW)的表型值用单样本Kolmogorov-Smirnov检验。结果发现,各性状均为数量性状。L50和SGR-W为超亲遗传性状,其余4个性状的变异介于双亲之间,其中W50偏向于母本,FW50、SGRL和SGR-FW偏向于父本。6个性状的变异系数介于21.11%~56.68%,均属中等强度变异。相关性分析表明,L50、W50和FW50相互之间均存在极显著正相关性,SGR-L、SGRW和SGR-FW相互之间也存在极显著正相关性。利用单因素方差分析法估算出L50、W50和FW50的遗传力分别为58.17%、64.00%和57.64%,控制3个性状的基因对数分别为6.61、12.63和8.09,遗传力(y)与基因对数(x)的二次回归方程为y=0.2922x~2–4.6533x+76.162(R~2=1)。基因间互作方式的检测结果显示,控制L50和控制FW50的多基因间均分别不存在互作;控制W50和控制SGR-W的多基因间均分别存在互补作用;控制SGR-L和控制SGR-FW的多基因间均分别存在重叠作用。研究表明,条斑紫菜叶状体L50和FW50的遗传力高、基因对数少且基因间无互作,可进行早代选择。另外,L50、W50和FW50之间的相关性高,可进行间接选择以提高育种效率。     

不同高温胁迫条件下的坛紫菜中植物激素分析

为了研究高温胁迫条件下内源性植物激素的变化趋势与坛紫菜在高温耐受性之间的相互关系,实验以在宁波象山采集的"浙东1号"坛紫菜叶状体为样品,以液相色—谱质谱联用的选择离子模式作为分析手段,系统地分析了高温胁迫条件下,坛紫菜中11种植物激素含量的变化。结果显示,在高温胁迫环境中共检测出7种植物激素,分别为异戊烯腺苷、异戊烯腺嘌呤、反式玉米素核苷、吲哚乙酸、茉莉酸甲酯、水杨酸和茉莉酸。在20、25、28和35°C下,茉莉酸和茉莉酸甲酯的含量随着刺激温度的上升而升高;吲哚乙酸、反式玉米素核苷、异戊烯腺苷和异戊烯腺嘌呤在高温组中的含量要明显低于对照组,呈现下降的趋势。以28°C作为胁迫温度,在不同胁迫时间下,吲哚乙酸、反式玉米素核苷、异戊烯腺苷和异戊烯腺嘌呤的含量随着胁迫时间的延长而降低;水杨酸和茉莉酸甲酯的含量随着胁迫时间的延长而上升;茉莉酸的含量先升高后下降。在恢复培养过程中,水杨酸、茉莉酸、吲哚乙酸和茉莉酸甲酯的含量均呈现下降、升高又下降的变化趋势,而反式玉米素核苷、异戊烯腺苷和异戊烯腺嘌呤的含量则随着恢复培养过程的进行而逐渐下降。高温胁迫下,坛紫菜在促进生长类激素和胁迫抑制类激素的共同调控下进行胁迫防御,维持自身生长。然而,坛紫菜的防御能力有限,且高温胁迫引起的藻体自损伤可能难以修复。     

多个条斑紫菜品系采收期内脂肪酸组成、含量的变化分析

为探讨条斑紫菜不同栽培品系、不同采收期脂肪酸组成及含量的变化,本实验对10个栽培品系进行了跟踪测定分析,结果显示:条斑紫菜的脂肪酸组成稳定,与品系、采收期内季节性变化无关,但含量存在明显的差异。各品系的3个采收期的饱和脂肪酸(16∶0为主,包括13∶0、16∶0、18∶0)的相对含量约为20%;不饱和脂肪酸(以EPA为主,包括18∶1 n-9、18∶2 n-6、18∶3 n-3、20∶1 n-9、20∶2 n-7、20∶3 n-7、20∶4 n-6(AA)、20∶5 n-3(EPA))的相对含量为70%左右。在温度最低2月份的采收样品中,总脂肪酸和EPA含量最高,显示低温有利于条斑紫菜脂肪酸尤其是EPA的积累。另外,条斑紫菜富含以EPA为主的不饱和脂肪酸,在整个采收期内,样品中的n-6/n-3比值为4.9～7.7,符合WHO/FAO膳食推荐值。     

高温下芽孢杆菌对坛紫菜生长及生理的影响

坛紫菜是我国东海区栽培的重要经济海藻,其生长适温为20°C,极限高温为29°C。高温和病原菌均会导致坛紫菜生长受抑、藻体病烂。为研究高温下藻际微生物对坛紫菜生长的影响,本文以坛紫菜叶状体和藻际芽孢杆菌(实验证明该菌株在20°C下为紫菜的益生菌)为材料,检测了在28°C下藻际芽孢杆菌对坛紫菜相对生长率(RGR),抗氧化酶(SOD、POD)活性,可溶性蛋白、游离脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)和藻胆蛋白含量等生理指标的影响。结果显示,28°C下,在实验初始阶段,菌藻共培养组坛紫菜比纯培养对照组有较高的RGR,但随着培养时间的延长,两组的RGR无显著性差异;4 d后两组坛紫菜均出现腐烂,菌藻共培养组的藻体腐烂程度更为剧烈;培养24 h后,菌藻共培养组的SOD、POD活性和MDA水平均显著高于对照组,而渗透调节物质可溶性蛋白和Pro显著低于对照组;共培养组中,坛紫菜的藻胆蛋白含量均显著高于对照组。该研究表明,28°C下,虽然在短期内藻际芽孢杆菌会促进坛紫菜的生长,但随着培养时间的延长反而不利于坛紫菜的生长,且加剧活性氧和渗透压胁迫,表明该菌的生态功能因环境变化而发生了改变。     

坛紫菜与长紫菜种间杂交后代的细胞崩溃现象与成活后代的表现型观察比较

坛紫菜壳孢子萌发的第一次和第二次分裂为减数分裂,结束后形成了一个基因型不同的四分体,随后由这个四分体发育成一个基因型嵌合的叶状体。由坛紫菜与长紫菜种间杂交所产生的杂合丝状体成熟后释放出壳孢子,后者在分裂初期出现了大量的细胞崩溃死亡,通过对单个的壳孢子萌发体进行定点跟踪观察后发现,细胞崩溃死亡不仅会发生在减数分裂的直接产物即处于二细胞期、三细胞期、四细胞期的萌发体,当细胞数大于4个的萌发体在进行有丝分裂时也会出现细胞崩溃死亡。绝大部分的壳孢子能进行第一次减数分裂,形成处于二细胞期的萌发体,随后进行第二次减数分裂,形成处于三细胞期或四细胞期的萌发体。培养4 d,78.6%的壳孢子已发育成含2~4个细胞的萌发体,其余为未分裂的壳孢子萌发体;在含2~4个细胞的萌发体中未出现细胞崩溃死亡的萌发体的百分率为99.7%,0.3%的个体出现了细胞崩溃死亡。随着培养时间的延长,大多数处于二细胞期的萌发体发育成处于三细胞期和四细胞期的萌发体,而大规模的细胞崩溃死亡也出现在处于三细胞期和四细胞期的萌发体中。培养14 d,处于三细胞期和四细胞期的萌发体的百分率分别为38.6%和37.2%,它们当中含有崩溃死亡细胞的个体百分率分别为99.5%和99.2%。此外,8.9%的萌发体能够发育成含4个以上细胞的个体,但在随后的有丝分裂中也出现了细胞崩溃死亡现象。培养35 d,大部分的萌发体其体细胞已全部崩溃死亡,但仍有约1%的萌发体能成活下来,可它们并非是由一个完整的四分体发育而来,而是由四分体中的1~2个成活细胞发育而来。培养45 d,可把成活体的形态和颜色分成类亲本型和重组型两大类。研究表明,利用紫菜种间杂交的后代在壳孢子萌发初期会出现细胞崩溃死亡的现象,不仅可以用于辅助更精确地鉴别物种,而且可以从其成活后代中筛选出具有重组优势的新品系。     

坛紫菜叶状体的抗生素联合除菌效果

为研究坛紫菜及其外生菌群对氯霉素、竹桃霉素和头孢噻肟3种抗生素的敏感性,通过将其与氨苄青霉素、卡那霉素和庆大霉素的组合,优化坛紫菜叶状体的除菌方法,并利用涂布平板、qRT-PCR及16S rRNA测序分析其除菌效果。结果显示,当坛紫菜先以氨苄青霉素(300 mg/L)、卡那霉素(100 mg/L)和庆大霉素(100 mg/L)混合处理18 h,再以氯霉素(50 mg/L)、头孢噻肟(200 mg/L)和竹桃霉素(50 mg/L)混合处理4 d,叶状体的健康率保持在96.3%以上,而对可培养细菌的抑制率达到99.9%。根据qRT-PCR和16S rRNA的结果可知,该种组合方法较前3种抗生素的组合,其菌总数下降41.5%,微生物的丰度和多样性指数明显下降。其中,假单胞菌、交替赤杆菌、交替单胞菌以及海杆菌等得到针对性的抑制。研究表明,多种抗生素的优化组合能够对坛紫菜叶片的菌群结构产生显著影响,使其受到抑制,但仍无法达到绝对除菌的效果。     

条斑紫菜基因组Fosmid文库构建

高分子量基因组文库是开展条斑紫菜基因组学研究的必备工具。构建了由23 040个Fosmid克隆组成的条斑紫菜孢子体无偏倚基因组文库。检测分析表明：文库克隆重组率为100%;插入DNA片段长度为28~40 kb,平均长度为35 kb,文库覆盖率约为条斑紫菜基因组的2.78倍;从超级池中筛查条斑紫菜18S rRNA、atpA、h2A、rbcL基因,至少能得到一个阳性克隆,印证了计算所推测的文库覆盖率;随机选取6个Fosmid克隆经100代传代后插入DNA片段未发生丢失或长度变化,表明克隆传代的稳定性。该文库的构建为开展条斑紫菜基因组特性分析和基因克隆奠定了基础。