鸡源大肠埃希氏菌大质粒的探讨

用碱裂解法提取分离的１０株鸡源大肠埃希氏菌的质粒。结果：多数大肠埃希氏菌株含有大质粒，分子量为５０￣２３０ｋｂ。这些大质粒可能含有毒力相关基因，与细菌的耐药性，大肠埃氏菌素的产生及质粒的传递功能等有关。     

畜禽源耐黏菌素大肠埃希氏菌的分离鉴定与特性分析

我国从2017年4月30日起禁止将黏菌素作为动物促生长剂使用,为评估禁用政策效果,并了解畜禽源耐黏菌素大肠埃希氏菌对临床常用药物的耐药情况,在2017年和2020年分别从长春市3个畜禽养殖场采集373份粪便样品分离鉴定出546株耐黏菌素大肠埃希氏菌。分离菌株对黏菌素的MIC为0.25 mg/L～8 mg/L,2020年MIC≥2 mg/L菌株分离率(18.02%)低于2017年(26.24%);16种药物敏感性测定中,2017年和2020年均以耐4种抗生素占比最高,2020年多重耐药菌株占比(60.25%)低于2017年(80.85%);PCR鉴定出34株mcr-1基因阳性菌株,2020年mcr-1基因检出率(3.21%)低于2017年(14.89%);2017年mcr-1基因阳性大肠埃希氏菌中检测到12种类型质粒,2020年mcr-1基因阳性大肠埃希氏菌中检测到7种类型质粒,携带的质粒类型减少。结果表明,禁止黏菌素作为饲料添加剂使用后对大肠埃希氏菌的黏菌素耐药性有很大的影响,但多重耐药情况依然较严重,携带质粒复制子复杂多样,应当持续进行监测。     

3株猪源大肠埃希氏菌耐药基因的初步定位

本试验旨在对临床分离的猪源大肠埃希氏菌耐药基因进行初步定位。采用常规细菌分离培养、16S rRNA PCR扩增和序列测定方法从江西省3个规模化猪场送检的子宫脓液中分离鉴定病原菌,并通过质粒提取、转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞及药敏试验对临床分离株的耐药基因进行初步定位。结果显示,分离鉴定到3株大肠埃希氏菌,其中JX-22分离株仅对氧氟沙星、大观霉素敏感,JX-26分离株仅对链霉素、氧氟沙星等4种药物敏感,JX-28分离株仅对氧氟沙星等3种药物敏感,均为多重耐药菌;3株大肠埃希氏菌均可纯化到分子质量大小不一的质粒。分离株、质粒转化菌及大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞药敏试验对比结果显示,3株大肠埃希氏菌的耐链霉素、林可霉素、甲硝唑、氨苄西林、阿莫西林、大观霉素、丁胺卡那基因,JX-22和JX-26分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐头孢曲松基因,JX-28分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟、诺氟沙星基因均定位于细菌质粒上;JX-28分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐诺氟沙星基因和JX-26分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟基因均定位于其染色体上;3株分离株均无氧氟沙星耐药基因。本试验初步确定3株多重耐药猪源大肠埃希氏菌的大部分耐药基因定位于质粒上,为进一步研究猪源大肠埃希氏菌的耐药机理和有效控制措施奠定基础。     

3株猪源大肠埃希氏菌耐药基因的初步定位

本试验旨在对临床分离的猪源大肠埃希氏菌耐药基因进行初步定位。采用常规细菌分离培养、16S rRNA PCR扩增和序列测定方法从江西省3个规模化猪场送检的子宫脓液中分离鉴定病原菌,并通过质粒提取、转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞及药敏试验对临床分离株的耐药基因进行初步定位。结果显示,分离鉴定到3株大肠埃希氏菌,其中JX-22分离株仅对氧氟沙星、大观霉素敏感,JX-26分离株仅对链霉素、氧氟沙星等4种药物敏感,JX-28分离株仅对氧氟沙星等3种药物敏感,均为多重耐药菌;3株大肠埃希氏菌均可纯化到分子质量大小不一的质粒。分离株、质粒转化菌及大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞药敏试验对比结果显示,3株大肠埃希氏菌的耐链霉素、林可霉素、甲硝唑、氨苄西林、阿莫西林、大观霉素、丁胺卡那基因,JX-22和JX-26分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐头孢曲松基因,JX-28分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟、诺氟沙星基因均定位于细菌质粒上;JX-28分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐诺氟沙星基因和JX-26分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟基因均定位于其染色体上;3株分离株均无氧氟沙星耐药基因。本试验初步确定3株多重耐药猪源大肠埃希氏菌的大部分耐药基因定位于质粒上,为进一步研究猪源大肠埃希氏菌的耐药机理和有效控制措施奠定基础。     

溶菌酶对奶牛子宫内膜炎主要病原的体外药敏试验

选取从患有子宫内膜炎奶牛的子宫黏液中分离出的主要病原菌金黄色葡萄球菌37株、链球菌30株、大肠埃希氏菌12株和化脓棒状杆菌22株,在体外用溶菌酶、庆大霉素、氨苄西林和头孢唑啉按照微量肉汤稀释法进行药敏试验。结果表明,溶菌酶对奶牛子宫内膜炎分离的金黄色葡萄球菌和链球菌具有良好的抗菌活性,对化脓棒状杆菌具有一定的抑杀作用,对大肠埃希氏菌作用较弱;氨苄西林则均产生了大量的耐药菌株,而溶菌酶对庆大霉素、氨苄西林和头孢唑啉耐药菌株同样具有较好的抑杀效果。     

应用质粒图谱分析大肠埃希氏菌毒力差异的研究

对1株无致病性鸡源大肠埃希氏菌（O21）和5株已知毒力强弱的大肠埃希氏菌（O2、O1、X2、148和O78）进行质粒图谱（PP）分析。结果表明这6个菌株属于不同的6种质粒谱型，其毒力的强弱与其所携带质粒的数量和大小有关，但不同毒力株间也有少数几条相同大小的谱带，试验结果表明PP图谱法可作为大肠埃希氏菌分型和鉴别其毒力的间接分子生物学方法。     

某规模化猪场大肠埃希菌O141的分离鉴定及药敏试验

从河北衡水某规模化猪场21日龄发病仔猪脾脏中分离到1株革兰氏阴性杆菌,通过菌落形态、培养特性和微量生化试验,鉴定为大肠埃希菌,应用大肠埃希菌O抗原定型血清鉴定为O141。该菌株对供试的14种抗菌药物均产生耐药性,其中多种常用抗菌药物对其完全没有抑制作用。动物致病性和毒素试验表明,该菌株在20 h内能够导致70%小鼠死亡,并产生热稳定肠毒素,为1株产肠毒素性大肠埃希菌。     

大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体构建

合成胸膜肺炎放线杆菌质粒pKMA2425上长度为126bp及2214bp的2个DNA片段,克隆到大肠埃希氏菌质粒pGSI中,获得重组质粒pGSIA。PCR扩增pTKRED上的大观霉素抗性基因及线性化的pGSIA（126bpDNA片段-pGSI-2214bpDNA片段）,连接,电转化胸膜肺炎放线杆菌,在大观霉素的选择压力下筛选鉴定到连接正确的质粒,命名为pGSIAS。pGSIAS测序结果符合预期。在大观霉素的选择压力下,含有pGSIAS的胸膜肺炎放线杆菌血清1-10型菌株均生长良好;在氨苄青霉素的选择压力下,含有pGSIAS的大肠埃希氏菌生长良好。结果表明本研究构建的大肠埃希氏菌-胸膜肺炎放线杆菌穿梭载体pGSIAS序列正确,在胸膜肺炎放线杆菌及大肠埃希氏菌中均能复制并表达质粒上的相关基因。     

禽源大肠埃希氏菌分离株的病原特性鉴定

1998～2002年从上海地区72个养禽场分离出84株禽源大肠埃希氏菌,结合培养特性、生化特性及血清型等对其进行了鉴定。其形态、染色及生化特性等基本符合大肠埃希氏菌的特点。用138种大肠埃希氏菌"O"抗原定型血清检测84株分离株,其中O7811株,O210株,O978株,O356株,O1256株,O225株,O925株,O1235株,O964株,O263株,O23、O120各2株,O118、O128、O138、O83各1株。其余13株不在其检测范围。药敏试验结果表明,分离菌株已对多种抗生素产生了很强的耐药性。对其中29株菌株进行了小鼠致病性试验,致病率高达72 8%。     

畜禽粪污中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的LAMP检测及其耐药性分析

为深入了解畜禽粪污中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的流行及耐药状况,采用建立的畜禽粪便中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的环介导等温扩增技术（LAMP）检测方法对山东省内牛粪污、猪粪、鸡粪、鸭粪中的金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌进行检测,进而对检测阳性样品进行分离,并对药敏试验中多重耐药性菌株进行耐药基因预测。结果表明,LAMP方法检测畜禽粪污中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌与国家标准方法检测结果符合率为100%,重复性好,特异性高。从80份畜禽粪污样品中分离到的3株金黄色葡萄球菌均对青霉素耐药;34株大肠埃希氏菌对氟苯尼考、利福平的耐药比例高于50%,高于25%以上的还有氨苄西林、四环素、多西环素、磺胺异噁唑、头孢噻吩和头孢噻呋;耐药基因预测结果显示,鸡粪、鸭粪、牛粪和猪粪中的4株大肠埃希氏菌分别携带10、8、20和15种耐药基因;鸡粪中的1株金黄色葡萄球菌携带11种耐药基因。说明山东地区畜禽粪污中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌耐药状况严峻,菌株普遍多重耐药,且携带多种耐药基因。     

中草药消除大肠埃希氏菌耐药性及耐药质粒的研究

在系统鉴定和药敏试验的基础上,对９株大肠埃希氏菌多重耐药菌株进行而药基因定位,结果表明有４株菌株的氨苄青霉素基因位于质粒上。通过对中草药煎煮、水蒸气蒸馏等方法提取其有效成分,对耐药大肠埃希氏菌进行耐药性消除试验,结果发展大蒜油等对大肠埃希氏菌氨苄青霉素耐药性有消除作用;鱼腥草、紫草等对大肠埃希氏菌庆大霉素而药性及耐药质粒有消除作用,消除率分别为２．９８％和４．２０％。     

牛分支杆菌广西分离株Hsp 65基因的克隆及序列分析

利用牛分支杆菌Hsp 65基因特异性引物,对2株牛分支杆菌广西分离菌株进行PCR扩增,产物经纯化后与载体pMD-18连接,然后转染大肠埃希菌DH5α。提取转染后大肠埃希菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNA Star MegAlign对Hsp 65基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的牛分支杆菌的Hsp 65基因进行比较。结果显示,广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列,其核苷酸序列同源性在98.7%～100%之间,推导的氨基酸序列同源性在98.4%～100%之间。表明广西分离的菌株与参考的其他牛分支杆菌菌株的Hsp 65基因差异不大,说明牛分支杆菌分泌蛋白Hsp 65基因十分保守,从而为检测跟踪菌株的变异,研制牛分支杆菌亚单位基因疫苗奠定基础。     

临床分离鸡致病菌超广谱β-内酰胺酶的检测及药敏分析

用全自动微生物鉴定系统(VITEK-32)鉴定了临床分离鸡致病菌,并分别进行了超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的检测,并用试管两倍稀释法测定了各种抗生素对非产酶菌、产ESBLs菌的抗菌活性。结果表明,鉴定分离的33株致病菌有大肠埃希氏菌30株、阴沟肠杆菌1株、铜绿假单胞菌1株、法氏柠檬酸杆菌1株。在这些菌株中,首次从鸡中检测出法氏柠檬酸杆菌,所分离的33株致病菌中产ESBLs8株。产酶菌株对抗生素的耐药性严重,而抗生素与抑制剂联用能降低药物对细菌的最低抑菌浓度(MICs)。     

鹈鹕大肠埃希氏菌的分离鉴定

从一起因呕吐、食欲减退而死亡的鹈鹕的内脏中分离到3株细菌,其培养性状及生化特性基本一致,经VITEK-32鉴定均为大肠埃希氏菌。动物试验表明,分离株对小鼠均具有较强的致病性,且从死亡鼠内脏中回收到相应细菌结果表明,分离到的菌株为致病性大肠埃希氏菌。     

宁夏地区羊源大肠埃希氏菌的分离鉴定及耐药性检测

为了解宁夏地区羊源大肠埃希氏菌的流行情况及对常用抗生素的耐药性,对采集于宁夏地区的108份病料进行大肠埃希氏菌的分离鉴定,采用微量肉汤稀释法测定16种抗菌药物对分离株的最小抑菌浓度(MIC).结果表明,在108份病料中共分离到58株大肠埃希氏菌,分离率达53.7％;分离菌株中耐药株共34株(58.6％),其中15株(4...     

羔羊源产ESBLs与非产ESBLs大肠埃希氏菌耐药性差异比较及基因型分析

为了明确宁夏地区羔羊源大肠埃希氏菌产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)与非产ESBLs大肠埃希氏菌的耐药性差异和相关基因携带情况差异,对实验室分离保存的87株羔羊源大肠埃希氏菌,采用ESBLs表型检测方法筛选产ESBLs的菌株和K-B纸片法进行药物敏感性试验,采用PCR法对分离株进行相关基因的检测。结果显示,87株大肠埃希氏菌中5株为产ESBLs菌株,检出率为5.75%。产ESBLs株对多数试验药物呈耐药性;而非产ESBLs菌株对多数试验药物敏感,仅对恩诺沙星、复方新诺明和红霉素耐药率超过50%。20种药物中,产ESBLs株大肠埃希氏菌对18种药物的耐药率极显著高于非产ESBLs菌株(P<0.01)。产ESBLs菌株携带blaCTX的阳性率极显著高于非产ESBLs菌株(P<0.01),产ESBLs菌株中的blaTEM和blaOXA基因的阳性率均高于非产ESBLs菌株,但差异不显著(P>0.05)。结果表明宁夏地区羔羊源大肠埃希氏菌产ESBLs菌株流行率低,产ESBLs菌株耐药性严重,且宁夏地区羔羊源ESBLs菌株优势基因型为blaCTX和blaTEM。     

禽源大肠埃希菌质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的检测

从我国部分地区病、死家禽中分离到大肠埃希菌403株。按照CLSI(clinical and laboratory standards institute)推荐的K-B药敏纸片法对其中的344株分离株进行药敏纸片试验;根据GenBank上发表的序列,设计并合成了五对引物,对所有分离细菌进行质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因的扩增:qnrA、qnrB、qnrS、aac(6′)-ib-cr和qepA。1993年-1996年禽源大肠埃希菌分离株仅对萘啶酸的耐药率超过60%;2001年-2008年禽源大肠埃希菌分离株对1-3代7种喹诺酮类药物的耐药率均超过58%。在403株禽源大肠埃希菌中共检出3(0.7%)株qnrB阳性菌株,2(0.5%)株qnrS阳性菌株,5(1.2%)株aac(6′)-ib-cr阳性菌株以及5(1.2%)株qepA阳性菌株,未检测到qnrA阳性菌株。结果显示,近20年来,我国禽源大肠埃希菌对喹诺酮类药物的耐药性不断上升,同时,质粒介导的喹诺酮类药物耐药基因在禽源大肠埃希菌中呈不断上升的流行趋势。     

从高热病猪组织血液内分离大肠埃希氏菌分析

通过分析分离自病猪血液、器官的细菌生物学特性,探讨高热病猪发病病因,寻找预防、治疗的方法。取3头高热病猪组织、血液用羊血及伊红美兰琼脂平板培养、分离出的3株菌株,经VITEK2革兰氏阴性细菌鉴定卡全自动微生物鉴定;ASTGN10药敏卡,药敏分析系统鉴定;小鼠毒力实验;血清凝集实验;16SrRNA基因鉴定;致泻毒力基因鉴定。结果3株均为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)大肠埃希氏菌,并经16SrRNA基因鉴定与GenBank比对结果,3株细菌均鉴定为大肠杆菌。3株菌对氨曲南、头孢吡肟等药物敏感,而对庆大霉素、四环素等耐药。菌株对小鼠有较强的致病力。菌株与159种大肠杆菌诊断血清均不凝集,说明这些菌不是常见的大肠杆菌致病型。致泻毒力基因鉴定均为阴性。分离出3株非常见致病型大肠杆菌在当地猪高热症暴发中起到重要作用。高热病猪尽早配合使用敏感抗生素治疗有减轻病情、减少病死率的效果。     

母猪粪便中乳酸菌菌株体外益生特性初步研究

试验从健康母猪粪便中分离乳酸菌,并对其益生特性进行初步研究。通过形态和生理生化鉴定,再利用16S rDNA序列同源性分析的方法进行16S rDNA基因扩增与测序,并将测序结果与GenBank中菌株的16S rDNA基因序列进行同源性比较分析,得到1株链球菌,2株约氏乳杆菌,4株乳酸片球菌。体外益生特性结果表明,各菌株在pH 2.0~3.0,胆盐浓度0.1%~0.3%均有较强的耐受能力,各菌株对大肠埃希氏菌和单核细胞增多症李氏杆菌均有较好的抑制作用。     

幼鹅大肠埃希氏菌的分离与鉴定

从重庆市4个县(市)24户的36只病死幼鹅中,分离到31株大肠埃希氏菌,经致病性试验、生化特性及药物敏感性试验,表明其中24株为致病菌,致病菌分离率为66.7%;致病菌株的生化特性符合大肠埃希氏菌的生化特性;所有菌株对丁胺卡那霉素、妥布霉素高度敏感,对氨苄青霉素、红霉素、氟哌酸、链霉素、复合磺胺、四环素、万古霉素不敏感,部分菌株对氯霉素、庆大霉素、卡那霉素中度敏感,说明大肠埃希氏菌对常用抗生素药物的抗药性日趋严重。