转基因动物制作技术及其基因载体研究进展

论文概述了家畜转基因动物的制作方法,初步分析了用于转基因技术的基因载体种类,深入探讨了不同载体的优缺点,并展望了基因载体的发展趋势.     

慢病毒载体的构建及其应用于转基因动物的研究进展

为提高慢病毒载体构建水平,提高转基因整体效率,作者综述了慢病毒载体结构及围绕改善生物安全性、提高目标基因装载量、扩大宿主范围而进行的慢病毒载体改造研究发展历程,指出新型慢病毒载体去除了病毒所有辅助基因,引入了外源调控序列,替换了包膜蛋白,大大提高了慢病毒载体的安全性、基因转移效率和表达效率,使宿主细胞类型更广范,而下游表达载体转染方法的研究又为转基因方法的集成与优化奠定了基础。慢病毒载体制备与多种转基因技术的优化集成,将有助于发展简便、高效、经济的转基因新技术,提高转基因技术的整体水平。     

转基因动物研究进展

本文从转基因动物的产生、转基因细胞载体的运用、基因的转移、转基因的命运、转基因的载体、基因功能的研究,生物医学模型、制备重组蛋白、改善乳成分等方面综述了转基因动物的最新研究成果。     

转乳铁蛋白肽和α干扰素基因的牛胎儿成纤维细胞的制备

旨在构建含有乳铁蛋白肽基因和a干扰素基因的载体,并制备转基因牛胎儿成纤维细胞,为研制抗乳房炎和口蹄疫转基因克隆牛提供供体细胞.本研究构建了由山羊β-酪蛋白启动子启动的牛乳铁蛋白肽基因和由CMV启动子调控的人α干扰素基因的载体,以EGFP基因作为报告基因,neo基因作为筛选基因;分别采用脂质体和电击法转染牛胎儿成纤维细胞,G418筛选得到转基因阳性细胞,并用PCR方法检测转基因细胞中目的基因的整合情况,用Western blotting检测α干扰素蛋白的表达.结果,得到了同时含有牛乳铁蛋白肽基因和人α干扰素基因的转基因牛胎儿成纤维细胞,并且α干扰素蛋白在转基因细胞中能有效表达.     

精子载体法转基因技术研究进展

精子载体法是以精子作为外源基因的载体,在受精过程中将外源基因导入动物胚胎,从而使外源基因进入子代的基因组中。作者就精子结合外源基因的机制,精子与外源基因结合的方法、影响精子转染外源基因和生产转基因动物的精子因素进行简要介绍,并对发展起来的输精管内注射转染法、曲细精管微注射法和睾丸直接注射法等精子载体转基因新途径进行综述。     

动物转基因的整合、表达及其调控方法

本文综述了转基因在动物体内整合表达机制的研究进展,以及基因构件、调控序列、转基因拷贝数和载体序列等对转基因整合表达的调控,并对转基因技术的现状与前景做了小结和展望。     

转座子在转基因动物中的应用

转座子是发现新基因和基因功能分析的有效工具之一,作为插入突变原和分子标签已被广泛用于基因的分离和克隆,一些转座子已作为转化载体用于制备转基因动植物。转座子对多种生物尤其是对脊椎动物的成功转化让人们看到了他们作为转基因载体的巨大潜能。     

转基因小鼠多重PCR快速检测方法的建立

以转赖氨酸基因小鼠为研究对象,根据转入基因的载体结构分别设计赖氨酸基因、新霉素抗性基因、转基因启动子及小鼠基因组内参基因特异性引物,优化反应条件,建立转基因小鼠多重PCR检测方法。结果表明,建立的方法可以用于转赖氨酸基因小鼠的检测,同时为转基因动物检测标准的建立提供试验依据。     

哺乳动物精子载体转基因技术新研究

精子载体法是以精子作为外源基因的载体，在受精过程中将外源基因导入动物胚胎，从而使外源基因进入子代的基因组中。相对于显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞法等方法而言，它的主要优点是利用精子的自然属性克服了人为机械操作给胚胎造成的损伤，提高了转基因效率，而且操作简便、成本低廉。因而成为转基因动物研究的热点技术。现就精子结合外源基因的机制进行简要介绍，并对发展起来的精子细胞输精管内注射法、曲细精管徽注射法和睾丸直接注射法等精子载体转基因新途径进行综述。     

桑蚕的转基因研究

本文简述了桑蚕转基因研究中取得的成果，在桑蚕的转基因研究中已逐步建立了以显微注射、基因枪、杆状病毒载体以及转座因子为基础的转基因系统，获得一系列转基因细胞株或转基因组织，并以这些转基因钷组织研究了桑蚕基因的表达调节方式。     

稳定转化家蚕BmN细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

为了建立稳定转化家蚕细胞持续表达外源基因的技术体系,构建了基于piggyBac转座子的带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)和新霉素抗性基因(neo)表达元件的转基因载体pigA3GFP-IE-neo-FH-hGM-CSF-polyA-fib-L-intron1,以及带有hGM-CSF和吉欧霉素(zeocin)抗性基因的昆虫细胞转化载体pIZT-IE-hGM-CSF,分别转染家蚕卵巢BmN细胞,并以含相应抗生素G418或zeocin的培养液筛选,得到稳定的转化细胞系FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF。ELISA检测结果显示,hGM-CSF在FH-hGM-CSF和IE-hGM-CSF转化细胞系的表达水平分别为1.534 55 fg/个细胞和2.227 38 fg/个细胞。     

柑橘黄化脉明病毒RNA干扰载体的构建及遗传转化

本研究利用RNAi介导的病毒抗性的原理,以柑橘上发生频繁、危害严重的柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)为研究对象,以期得到对CYVCV具有抗性的转基因植株。根据CYVCV的CP基因和RP基因序列设计含有不同酶切位点的特异性扩增引物,获得RNA干扰片段,分别构建RNA干扰载体ihpCP-pGN、ihpRP-pGN和ihpCPRP-pGN,将干扰载体转入农杆菌EHA105后,采用农杆菌介导法进行柑橘的遗传转化,获得两株转基因阳性植株,为培育抗CYVCV病毒柑橘品种提供技术参考和理论基础。     

Selection of donor nuclei in somatic cell-mediated gene transfer using a co-transfection method

In this study, we introduced a co-transfection method for the selection of donor nuclei in somatic cell-mediated nuclear transfer. Two vectors were constructed in our experiment. One was pMSCV-GFP carrying the neomycin-resistant gene (Neo(r)) and the green fluorescent protein (GFP) reporter gene; the other was pBC1-GFP carrying the mammary gland-specific promoter and target gene GFP. Ovine adult fibroblasts were co-transfected with pMSCV-GFP and pBC1-GFP. The data from this work demonstrated that the GFP genes in both vectors could successfully co-integrate into the genomes of ovine adult fibroblasts in three of the four transgenic cell clones assayed. Furthermore, PCR analysis of transgenic embryos proved that the GFP genes in both vectors could co-integrate into the genomes of the reconstructed embryos. Subsequently, analysis of the developmental rate of the reconstructed embryos after nuclear transfer indicated that the blastocyst rate from the co-transfected donor cells was similar (approximate 8 percent) to that from individual pMSCV-GFP transfected donor cells. The influence of co-transfection resulting in modification of donor nuclei on development of reconstructed embryos was also investigated. The results of flow cytometric analysis indicated that the co-transfected ovine fibroblasts had similar quiescent characteristics in terms of cell cycle (G0+G1 percent: 73.20 +/- 4.04) to the individual pMSCV-GFP transfected fibroblasts (G0+G1 percent: 70.77 +/- 1.19) after they were treated with serum starvation for five days. Our results suggest that the co-transfection method can be used for selection of donor cell clones in somatic cell-mediated gene transfer experiments. It can be potentially extended to applications related to expression of functional protein in mammary glands and other transgenic research relevant to nuclear transfer.     

慢病毒载体法制备转基因动物研究进展

慢病毒能够感染分裂细胞和非分裂细胞,因而被发展成为重要的转基因载体,已成为制备转基因动物的一种工具,转基因效率明显提高。该文介绍了制备转基因动物的技术方法,比较了慢病毒载体制备转基因动物的特点和优势,介绍了慢病毒载体安全设计的发展,并将近年来国内外利用慢病毒载体法制备转基因动物的研究进行了概述。     

Myostatin基因沉默绵羊成纤维细胞系的建立

旨在获得肌肉生长抑制素( Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础.针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染成纤维细胞,采用RT-PCR进行筛选;构建慢病毒干扰载体,包装病毒,感染成纤维细胞,采用流式细胞技术分选阳性细胞,阳性细胞予以测序鉴定并检测沉默效果.结果,获得Myostatin基因沉默效率约90％的RNA干扰片段PSL1,包装病毒获得滴度为1×108的病毒颗粒,流式细胞技术分选得到纯度达99％的Myostatin基因沉默成纤维细胞系.采用慢病毒感染接合流式细胞术分选,能较快获得无抗性标记的转基因阳性细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊及探索Myostatin的调控机理奠定基础.     

利用转基因RNA干涉提高家蚕对BmNPV的抗性初探

基于探讨利用转基因RNA干涉技术使家蚕获得对核型多角体病毒抗性的目的,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的DNA聚合酶基因、蛋白激酶(PK1)基因以及bro-d和orf1629基因的部分编码片段,分别以其反向重复的形式与家蚕Actin3启动子连接,构建了基于piggyBac转座子载体的转基因表达载体,通过显微注射于家蚕卵,获得了36~107个G1蛾区,得到了20~23头转基因阳性家蚕。经Southern杂交及RT-PCR分析表明,BmNPV的4个反向重复片段都已经导入家蚕基因组中,并且可以进行转录。攻毒实验结果表明,BmNPV的DNA聚合酶基因和PK1基因反向重复片段对病毒的增殖有抑制作用,从而使家蚕对BmNPV具有一定抗性;而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重复片段对病毒的增殖没有抑制作用。针对特定病毒的转基因RNAi技术有望使家蚕获得对该病毒的抗性。     

几个杨树木质部特异启动子片段表达载体的构建与功能分析

木质部纤维素合酶基因(CesA)在植物正常生长期的木质部特异表达,受到外界压力时可诱导在韧皮部表达,因而被用作杨树抗桑天牛转基因研究中的特异性表达启动子。将前期分离的CesA上游DNA片段JCesAP、YCesAP和MDCesAP分别替换植物表达载体pCAMBIA1302中的组成型启动子CaMV35S,构建成新的植物组织特异性表达载体pJCesAP-GFP、pYCesAP-GFP和pMDCesAP-GFP,然后采用农杆菌介导法转化烟草,均得到完整的再生烟草植株。经PCR初步检测证明目的基因已整合到烟草基因组中。荧光检测JCesAP、YCesAP和MDCesAP片段均能启动GFP蛋白的表达,在395 nm激发光下出现黄绿色荧光,显示3个CesA片段均具有在木质部特异表达的启动子活性。     

Transgenic mouse offspring generated by ROSI

The production of transgenic animals is an important tool for experimental and applied biology. Over the years, many approaches for the production of transgenic animals have been tried, including pronuclear microinjection, sperm-mediated gene transfer, transfection of male germ cells, somatic cell nuclear transfer and the use of lentiviral vectors. In the present study, we developed a new transgene delivery approach, and we report for the first time the production of transgenic animals by co-injection of DNA and round spermatid nuclei into non-fertilized mouse oocytes (ROSI). The transgene used was a construct containing the human CMV immediate early promoter and the enhanced GFP gene. With this procedure, 12% of the live offspring we obtained carried the transgene. This efficiency of transgenic production by ROSI was similar to the efficiency by pronuclear injection or intracytoplasmic injection of male gamete nuclei (ICSI). However, ICSI required fewer embryos to produce the same number of transgenic animals. The expression of Egfp mRNA and fluorescence of EGFP were found in the majority of the organs examined in 4 transgenic lines generated by ROSI. Tissue morphology and transgene expression were not distinguishable between transgenic animals produced by ROSI or pronuclear injection. Furthermore, our results are of particular interest because they indicate that the transgene incorporation mediated by intracytoplasmic injection of male gamete nuclei is not an exclusive property of mature sperm cell nuclei with compact chromatin but it can be accomplished with immature sperm cell nuclei with decondensed chromatin as well. The present study also provides alternative procedures for transgene delivery into embryos or reconstituted oocytes.     

精子载体转基因的研究进展

精子载体法培养转基因动物是目前操作最简便，成本低廉且危险隐患相对较低的一种转基因方法。近10年来的研究结果表明，精子载体法可得到转基因阳性动物，并且引起了更多科研人员的关注。