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从猪睾丸中提取RNA后,采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)方法获得PHGPxcDNA。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳回收,与pMD18-T载体连接,转入E.coli DH5α中筛选鉴定重组子。将质粒经酶切鉴定后,把酶切下的目的基因cDNA进一步克隆到真核表达载体pGAPZ旺A中,经PCR及序列鉴定,证实插入载... 相似文献
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本实验以长白猪背最长肌为实验材料,进行组织RNA的提取及A-FABP基因的克隆,构建p EGFPN1-A-FABP真核表达载体,并通过脂质体转染成纤维细胞,48 h观察荧光表达。同时应用荧光定量PCR法检测猪7种不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、腿肌)中A-FABP基因的差异表达。结果表明:成功构建p EGFP-N1-A-FABP融合表达载体,并在细胞中表达绿色荧光蛋白;A-FABP基因在7种组织中均有表达,其中背最长肌和腿肌中A-FABP基因的表达量最高,与其他组织相比差异极显著(P0.01),而脾脏和肾脏中的表达量相对于心脏、肝脏和肺脏差异显著(P0.05),而A-FABP基因表达量在心脏、肝脏和肺脏中差异不显著(P0.05)。表明该基因能够在真核载体和细胞中表达,并且在猪不同组织的表达具有差异性。 相似文献
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猪Ghrelin基因的克隆及原核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
从猪下丘脑、胃等组织中提取总RNA,根据已发表的猪的Ghrelin mRNA序列设计合成引物,通过RT-PCR进行cDNA扩增,获得了282bp的片段。将该片段克隆于pMD-18T载体后进行序列分析,确认PCR产物为Ghrelin cDNA。从阳性克隆中提取质粒,经NheⅠ和XhoⅠ双酶切,回收282bp的目的片段,定向克隆到pET-28a表达载体中,提取质粒并再次转化到BL21(DE3)中,成功地筛选出阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,通过SDS-PAGE检测出猪Ghrelin基因的表达. 相似文献
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用PCR方法扩增猪圆环病毒PCVwhn株编码Cap蛋白的基因(ORF2),将ORF2插入到真核表达载体pcI)NA3.1( )中构建重组质粒pcDNA-PCV-ORF2,然后肌肉注射免疫小白鼠,通过ELISA诊断试剂盒检测小白鼠的血液中特异性抗体的变化情况.试验结果表明:小白鼠产生了抗猪圆环病毒的特异性抗体,从第1周开始产生抗体,第4周抗体水平达到最高,抗体可维持10周以上.本研究通过对小鼠的免疫试验,产生了特异性抗体,表明成功构建了能够在活体细胞中高效表达的真核表达载体,为进一步研究猪圆环病毒DNA疫苗奠定了基础. 相似文献
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根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)Rice株的gE基因序列设计了1对引物,用PCR法特异性地扩增出了PRV Min-A株的gE基因,并克隆到pUC19中,再与杆状病毒转座质粒pFastBac1连接得到pFastBac-gE,pFastBac-gE转化穿梭载体Bacmid,得到了重组rBacmid-gE表达载体。 相似文献
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根据GenBank发表的Hypodermin C(HC)基因序列设计引物,以原核表达载体pET-HC为模板,PCR扩增HC基因,将克隆基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-HC。将重组质粒pVAX1-HC转染小鼠胎儿成纤维细胞,以间接免疫荧光法检测HC基因在细胞中表达。用真核表达质粒pVAX1-HC经双侧胫前肌注射昆明小鼠,对小鼠进行体液免疫和细胞免疫研究。结果表明,小鼠血清抗体水平和淋巴细胞增殖水平明显高于非免疫对照组。本研究成功构建了真核表达质粒pVAX1-HC,为纹皮蝇核酸疫苗研发奠定了基础。 相似文献
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根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1(+)真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。 相似文献
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《畜牧与兽医》2014,(8):18-21
构建带有myc标签和Kozak序列的猪食欲肽受体2(OX2R)基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-myc/OX2R,观察在HEK293T真核细胞中的表达。设计带有酶切位点(HindⅢ和XbaⅠ)的特异性引物,采用RT-PCR技术从猪的下丘脑中扩增OX2R基因,并克隆入pcDNA3.1(+)质粒中。用限制性内切酶酶切分析及测序分析证明构建成功后,用脂质体法转染HEK293T细胞,蛋白质印迹法检测OX2R基因的表达。结果,成功构建了带有myc标签和Kozak序列的pcDNA3.1(+)-myc/OX2R重组质粒,蛋白质印迹法检测该质粒可在真核细胞中表达。本研究为将来研究猪食欲肽受体2的功能奠定基础。 相似文献
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猪带绦虫TS018基因真核表达载体的构建及其表达 总被引:1,自引:0,他引:1
采用PCR从重组克隆载体pGEM—TSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接,构建重组表达载体pPIC9k—TSO18,转化大肠埃希氏菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9k—TSO18,用SalⅠ线性化,并电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株,以甲醇进行诱导表达,SDS—PAGE和Western-blotting分析结果表明,诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白,目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80%以上,诱导72h目的蛋白表达量为0.5mg/mL。 相似文献
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利用DNA重组技术,将编码K88-ST融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pCAMBIA 1302中,成功的构建了植物重组表达质粒pCAMBIA-K88-ST。并将其转化农杆菌EHA105,为K88-ST基因的进一步研究奠定基础。 相似文献
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为了构建贵州白香猪γ-干扰素真核表达载体,试验以已构建的含有γ-干扰素基因的pMD-GZ-IFN-γ质粒为模版,利用特异性引物进行PCR扩增,得到大小为501 bp的γ-干扰素基因的开放阅读框,将所得IFN-γ基因克隆至经相同双酶切处理后的pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-IFN-γ。测序结果表明:克隆至pcDNA3.1(+)的基因序列为γ-干扰素序列,说明γ-干扰素基因真核表达载体构建成功。 相似文献