家蚕、野桑蚕线粒体Cyt b基因片段序列分析及分子进化研究

以家蚕中系一化地理品种延吉、印度多化品种迈索尔、欧系一化品种法 4 0 8油和中国镇江地区野桑蚕为材料 ,采用PCR技术扩增了其线粒体 (mitochondrialDNA ,mtDNA)细胞色素b(cytochromeb ,Cytb)基因 ,测定其 5′端5 91bp的核苷酸序列 ,并从GenBank中调取中系家蚕品种C10 8、夏芳 ,日系家蚕品种青熟 ,韩国家蚕品种Backokjam和日本野桑蚕的相应序列 ,进行同源性比较 ,发现日系家蚕品种青熟 ,印度家蚕品种迈索尔 ,欧系家蚕品种法 4 0 8油 ,韩国家蚕品种Backokjam和中系家蚕品种C10 8、延吉序列间的同源性最高 ,相互间均为 10 0 % ;日本野桑蚕与各家蚕品种序列间的同源性约 94 %～ 95 % ;中国野桑蚕与各家蚕品种序列间同源性约 98%～ 99%。分子进化树分析显示日本野桑蚕和各家蚕品种相应序列的分歧时间远远早于中国野桑蚕与各家蚕品种序列的分歧时间 ,这是在分子水平上证实家蚕起源于中国野桑蚕的证据之一。     

中华鳖日本品系和清溪乌鳖线粒体12S rRNA基因部分序列分析

采用PCR产物直接测序法测定了中华鳖日本品系和清溪乌鳖2个国家水产新品种线粒体12S rRNA基因部分序列,克隆获得了12S rRNA基因992个可比对位点。中华鳖日本品系和清溪乌鳖核苷酸A、T、C、G含量相似,平均含量分别为21.90%、37.20%、16.53%、24.37%;22.00%、37.54%、16.35%、24.12%。除1处插入/缺失位点外,两者序列间有11个变异位点,其中转换1个、颠换10个,得到了3个12S rRNA基因单倍型。使用NJ法对包括GenBank报道的安徽和韩国中华鳖在内的5种12S rRNA单倍型进行聚类分析,结果表明:中华鳖日本品系与韩国产中华鳖聚为一支,清溪乌鳖与安徽产中华鳖聚为一支。     

水貂12S rRNA基因的克隆

为探讨水貂的系统发育关系,对金州水貂的12S rRNA基因进行了克隆测序,序列长度为450 bp。结果表明,金洲水貂的12S rRNA基因与伶釉的同源性为92.48%,与林釉的同源性为91.83%,与北美水貂的同源性为90.99%,与獾的同源性为90.99%。     

野桑蚕、家蚕LSP基因5''''侧翼区的克隆与序列分析

根据已报道的家蚕朝日×东海的幼虫血清蛋白LSP基因序列设计1对引物,以野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的基因组DNA为模板,分别克隆了野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的LSP,基因5’侧翼区,约1.9kb,并进行了序列测定与分析。结果表明:克隆的野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的LSP基因5’侧翼区涵盖了第一内含子、第一外显子、启动子区及其5’上游区;野桑蚕LSP基因5’侧翼区与朝日×东海LSP,基因5’侧翼区的同源性达96.4％,其中第一内含子、第一外显子的同源性分别为91.6％,100％;家蚕苏·菊×明·虎的LSP基因5’侧翼区与朝日×东海LSP基因5’侧翼区的同源性达98.9％,其中第一内含子、第一外显子的同源性都为100％,核心启动子区具有典型的TATA盒,还有数种昆虫脂肪体内组织特异性表达基因的共有序列和推定的激素响应元件等功能元件;野桑蚕的LSP基因启动子的5’上游区(-304～598bp)与J139家蚕丝素轻链基因第一内含子区域(7639～7933bp)的同源性达90.6％,-913～-1383bp为失活的部分水手转座子元件。     

野桑蚕、家蚕LSP基因5′侧翼区的克隆与序列分析

根据已报道的家蚕朝日×东海的幼虫血清蛋白LSP基因序列设计1对引物,以野桑蚕、家蚕苏*菊×明*虎的基因组DNA为模板,分别克隆了野桑蚕、家蚕苏*菊×明*虎的LSP基因5′侧翼区,约1.9 kb,并进行了序列测定与分析.结果表明:克隆的野桑蚕、家蚕苏*菊×明*虎的LSP基因5′侧翼区涵盖了第一内含子、第一外显子、启动子区及其5′上游区;野桑蚕LSP基因5′侧翼区与朝日×东海LSP基因5′侧翼区的同源性达96.4%,其中第一内含子、第一外显子的同源性分别为91.6%,100%;家蚕苏*菊×明*虎的LSP基因5′侧翼区与朝日×东海LSP基因5′侧翼区的同源性达98.9%,其中第一内含子、第一外显子的同源性都为100%,核心启动子区具有典型的TATA盒,还有数种昆虫脂肪体内组织特异性表达基因的共有序列和推定的激素响应元件等功能元件;野桑蚕的LSP基因启动子的5′上游区(-304～-598 bp)与J139家蚕丝素轻链基因第一内含子区域(7 639～7 933 bp)的同源性达90.6%,-913～-1 383 bp为失活的部分水手转座子元件.     

野桑蚕Bmand-Sxl基因的克隆及原核表达

鳞翅目(Lepidoptera)扩充是危害农林业的主要害虫类群,生殖和遗传控制是其生物控制的重要发展方向。Sxl是果蝇性别决定调控网络中的关键基因。本文根据家蚕的Bm-Sxl基因序列(NCBI:AB207267.1,AB207268.1),克隆了野桑蚕2条Bmand-Sxl基因序列,并在大肠杆菌中进行了原核表达了其中一条。     

中国野桑蚕和家蚕的AFLP分析

利用AFLP技术和统计学分析原理 ,对我国具有代表性的 10个不同地区野桑蚕和 33个家蚕品种以及 5个作为外群对照的柞蚕品种进行了分子系统学研究。研究结果表明 ,不同地区野桑蚕之间的遗传距离 (0 0 0 0～0 419)与家蚕品种之间的遗传距离 (0 0 0 0～ 0 40 6 )相似 ,而家蚕与野桑蚕之间的遗传距离为 (0 35 5～ 0 5 32 ) ,明显地小于家蚕与柞蚕 (0 76 1～ 0 86 5 )和野桑蚕与柞蚕 (0 776～ 0 839)之间的遗传距离 ,进一步证明了家蚕起源于中国野桑蚕。聚类分析发现 ,中国一化种与二化种聚类在一起 ,中国二化种与热带种聚类在一起 ,热带种不与一化种聚在一个类群 ,这一结果证明中国二化种在进化上介于一化种和热带多化种之间     

野桑蚕性信息素结合蛋白(PBP)亚家族基因的克隆与进化分析

蛾类的性信息素信号传递是研究昆虫化学通讯的模型,性信息素结合蛋白(pheromone-binding protein,PBP)亚家族是研究热点之一。克隆了野桑蚕PBP亚家族的3个基因,命名为pbp1、pbp2、pbp3(GenBank登录号:GQ246497、GQ468569、GQ468570)。分析野桑蚕和家蚕pbp基因的编码区,发现碱基突变主要以转换为主(14/18),氨基酸变异主要为同义突变(16/18),成熟蛋白质的理化性质变化小,二级结构无变化,推测野桑蚕向家蚕的进化过程中PBP亚家族的基因功能没有变化。对具有PBP亚家族3个已知基因的6个昆虫物种进行氨基酸遗传距离和同源性分析,结果表明野桑蚕和家蚕间PBP1、PBP2、PBP3的遗传距离分别为0、0.02、0,同源性分别高达100%、98.6%和100%,物种间基因的进化速率很慢,进化分析显示PBP亚家族在这几个物种分化前已经产生。     

中国野桑蚕滞育激素基因的克隆与序列分析

根据家蚕DH PBAN基因序列设计特异引物 ,以中国野桑蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增 ,获得了1 5 85kb的目的片段 ,将其克隆进pMD18 T载体 ,测序和同源性比较结果表明 :该片段由 3个外显子、2个内含子组成 ,2个内含子均为典型的GT AG结构 :该片段编码中国野桑蚕滞育激素 (DH)及DH引导肽 ;中国野桑蚕DH及引导肽与家蚕及日本野桑蚕的DH及引导肽氨基酸序列完全相同 ,其基因cDNA序列的同源性分别为 99 3%、97 2 %。研究结果进一步显示了中国野桑蚕与家蚕之间的近缘关系。     

野桑蚕丝胶1基因Ser1A′及其上游调控序列的克隆和序列分析

家蚕由野桑蚕驯化而来,而野桑蚕sericin1及其上游调控序列的相关研究较少。本研究以家蚕sericin1及其上游调控序列设计引物克隆野桑蚕sericin1及其上游调控序列,将克隆得到的野桑蚕Sericin 1序列翻译后用muscle软件与家蚕Sericin 1蛋白序列比对,结果表明预测的野桑蚕Sericin 1氨基酸序列与家蚕Sericin 1 A′(Ser1 A′)氨基酸序列相似性很高,达98%。野桑蚕丝胶1基因上游调控序列与家蚕一样也存在多态性,克隆得到了1061bp和636bp的两条序列,中间存在425bp的插入序列,与家蚕丝胶1基因上游调控序列相似性分别为98%和97%。     

中国野桑蚕mtDNA中A+T丰富区片段的克隆及序列分析

对中国野桑蚕mtDNAA +T丰富区片段进行了克隆和序列分析。在所测定的 72 0bp左右的片段中 ,A +T含量为 92 0 8% ,与不同家蚕品种的mtDNA相近 ,中国野桑蚕与家蚕之间的核苷酸序列呈高度同源性 (98%以上 ) ;但与日本野桑蚕相比 ,中国野桑蚕mtDNA的A +T丰富区片段 ,缺少 2个 12 6bp的重复单位 ,A +T含量低 0 9% ,核苷酸序列同源性也较低 (72 % )。该片段与中系家蚕mtDNA比较 ,有 15个变异位点。对mtDNAA +T丰富区的中国野桑蚕和日本野桑蚕及中系、日系和韩国的 4个家蚕品种进行聚类分析表明 ,日本野桑蚕有可能由中国野桑蚕分化而来。     

中国野桑蚕和日本野桑蚕的RAPD研究

用RAPD PCR技术初步研究了中国野桑蚕与日本福冈野桑蚕之间的DNA多态性。结果表明 ,不同地域中国野桑蚕个体之间及其与日本福冈野桑蚕个体之间均呈现出丰富的DNA多态性。中国野桑蚕同家蚕共有带率达 3 5 5 % ,同日本福冈野桑蚕为 4 5 1% ,而日本福冈野桑蚕同家蚕为 3 2 % ;中国野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为0 5 2 ,日本野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为 0 6 3,与中国野桑蚕的为 0 5 8,而且与中国沈阳地区野桑蚕之间的遗传距离最近 ,为 0 4 8,以此创建了它们的系统进化树。     

太湖流域野桑蚕的生态学研究

通过对太湖流域地区的野桑蚕进行跟踪调查 ,发现吴县地区的野桑蚕年发生代数多为 4代 ,吴江市南部乡镇的野桑蚕年发生代数以 3代为主。建立了该地区野桑蚕的生态学数据库     

野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmmace1)5′端非翻译区序列的剪切方式分析

通过5′cDNA末端快速扩增(RACE)的方法,克隆了野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmmace1)的cDNA 5′端非翻译区序列(5′UTR)区域,与家蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmace1)的cDNA 5′UTR(242个碱基)进行比较分析表明,Bmmace1的5′UTR包含有231个碱基,存在2个位点的点突变和一段连续11个碱基的缺失。通过克隆和测序分析野桑蚕基因组中Bmmace1的5′UTR片段,表明Bmmace1和Bmace1基因的RNA剪切都遵循GT-AG规则,但在其cDNA 5′UTR的RNA剪接过程中可能存在差异,Bmmace1在其cDNA上游+33处存在比Bmace1少剪接的序列TGATTTGAAGG,而在其基因组中5′UTR的TGATTTGAAGG序列下游-4位点缺失ACAGA序列。研究结果可为深入探讨Bmmace1基因与野桑蚕产生抗药性的关系提供基础信息。     

野桑蚕羧酸酯酶基因(BmmCarE-2)的克隆及表达分析

羧酸酯酶参与昆虫对有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂抗性的产生。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了一个野桑蚕羧酸酯酶全长基因(BmmCarE-2)。序列分析表明该基因包含1个1 623 bp的开放读码框,有57 bp的cDNA5′端非翻译区序列(5′UTR)和79 bp的cDNA3′端非翻译区序列(3′UTR),编码540个氨基酸,GenBank登录号为EU328351。序列比对分析表明BmmCarE-2与家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-2(GenBank登录号:DQ311250)的氨基酸序列相似性最高,达98.9%。利用半定量RT-PCR进行组织表达分析表明,BmmCarE-2在野桑蚕幼虫的头部和脂肪体表达量较高,在丝腺和中肠稍低,而在血液中的表达量最低。     

野桑蚕脑组织cDNA文库的构建及化学感受蛋白基因(CSP3)的克隆和序列分析

利用TAKARA公司生产的cDNA Library Construction Kit构建了野桑蚕脑组织的cDNA文库,经鉴定文库的滴度达3.5×105pfu/mL,文库插入片段的平均大小为1.2kb。从文库的测序结果中获得野桑蚕化学感受蛋白基因(CSP3)完整的开放阅读框(登录号:EU439267)并对其进行了序列分析。结果表明:该基因读码框由384个核苷酸组成,编码127个氨基酸,分子质量为14.6kD。通过对该基因编码的氨基酸和其它17种昆虫的CSP编码的氨基酸进行进化分析,发现该基因与家蚕CSP3的同源性最高,达96.85%。该基因的发现对于研究家蚕和野桑蚕对化学农药的敏感性差异具有重要意义。     

野桑蚕CYP305B1V1基因的克隆与序列分析

对野桑蚕CYP305B1V1基因进行克隆和序列分析的结果显示,野桑蚕CYP305B1V1基因的ORF为1 464nt,编码487 aa;同源性分析表明,在DNA水平上野桑蚕CYP305B1V1基因与家蚕CYP305B1基因的同源性达99%,与推导的氨基酸序列完全一致。通过和NCB I中家蚕基因组数据比对和拼接,预测野桑蚕CYP305B1V1基因结构中至少含有6个内含子,且内含子与外显子之间的连接符合GT-AT法则。     

野桑蚕线粒体ND5基因及其两端侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的ND5基因及其两端侧翼区域进行了克隆和序列分析。结果表明,在所测定的2．2kb左右的片段中,含有ND5基因的完整序列及Phe-tRNA(UUC)、Ser-tRNA(AGC)、Glu- tRNA(GAA)、His-tRNA(CAC)等4个tRNA基因,该片段的基因组结构与家蚕及其它地域来源野桑蚕的基因组结构基本一致,显示蚕类线粒体基因排列的保守性。ND5结构基因在不同家蚕及野桑蚕之间的比对分析表明,它们在核苷酸水平、氨基酸水平的同源性很高,相似性达96%以上。4个tRNA基因的碱基错配率较高,TψC环缺乏相对保守的T-ψ-C-Pu-A序列,各臂的碱基配对数、各环碱基数目变化较大。以ND5基因的核苷酸序列及氨基酸残基序列进行了家蚕及野桑蚕的分子进化分析,进一步证明家蚕起源于中国野桑蚕。