CYcD2基因转入丽格海棠研究

[目的]改变丽格海棠的开花时间,为丽格海棠分子育种奠定基础。[方法]以丽格海棠叶片为外植体,利用液氮直接转化法将pBI121-CYcD2转入根癌农杆菌EHA52中,再通过农杆菌介导法将CYcD2基因导入丽格海棠中。[结果]选择100 mg/L的卡那霉素作为转化外植体的起始选择压力。将经农杆菌共培养及过渡培养后的材料转入筛选培养基中,60 d后获得15个不定芽,再在生根培养基中培养20 d后,全部生根。PCR检测发现,15株卡那霉素抗性植株中有6株表现出与阳性对照相同的特异性条带,剩余植株为假转化体。Southern杂交分析表明6个转化植株中有5个出现了杂交信号,即为转基因植株,仅有1个为假阳性。[结论]该研究已成功地将外源基因CYcD2转入丽格海棠受体中。     

根癌农杆菌介导反义PG基因对桃的遗传转化

以白粉桃茎段为材料,通过根癌农杆菌介导用反义多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因对桃进行了遗传转化.将预培养3d的受体材料经根癌农杆菌菌液(D600=0.4)浸染10min后共培养60h,转移至分化培养基MS+1.0mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA+50mg·L-1卡那霉素+250mg·L-1头孢氨苄青霉素上诱导产生不定芽,将抗卡那霉素的不定芽先后在含有50mg·L-1卡那霉素的生长、增殖和生根培养基上继续选择,获得了完整植株,经PCR检测初步证明反义PG基因已导入桃中.     

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因转化番茄的研究

通过根癌农杆菌介导，采用叶盘转化法，探讨了黄瓜花叶病毒外壳蛋白（CMV－CP）基因导入番茄栽培品种‘红宝石’的适宜条件。结果表明：适宜的卡那霉素（Km)浓度，根癌农杆菌浓度，根癌农杆菌感染时间以及共培养时间分别为35mg/L,D600约0.5,10-15min和2－3d；将诱导形成的抗性愈伤组织转接到含有35mg/L Km的分化培养基和生根培养基中使其分化不定芽和生根，获得了抗Km的番茄再生植株。对再生植株进行再欠离体培养抗Km鉴定和PCR分子检测，补CMV-C基因已导入番茄再生植株的基因组中。     

盆栽小菊高效遗传转化体系的建立

采用根癌农杆菌介导的叶圆片遗传转化方法,建立了盆栽小菊稳定而高效的遗传转化体系.试验结果表明:黑暗条件下预培养2d,根癌农杆菌A600约0.5、侵染10 min,共培养3 d,延迟培养5 d能获得较高的转化率;10～15 mg/L的潮霉素具有很好的筛选效果.获得的抗性芽再生植株经PCR检测,初步证实外源基因已转入受体植物的部分株系中.     

根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指’葡萄的研究

以'美人指'葡萄离体叶片及叶柄为农杆菌介导转化Barnase基因的受体,对农杆菌侵染时间、共培养时间、预培养时间、卡那霉素选择压以及头孢霉素浓度等因素进行了研究.结果表明:最佳的农杆菌介导'美人指'葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,预培养3 d,卡那霉素选择压3.0 mg·L-1,头孢霉素质量浓度250 mg·L-1.采用此体系对'美人指'葡萄进行转化,共获得了12株抗性苗,农杆菌感染后的不定芽再生率为1.78%.利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法进行检测,结果表明,其中只有2株GUS染色呈阳性,阳性率为16.67%;有3株通过了PCR检测,初步证实Barnase基因已经整合进入'美人指'葡萄基冈组中.     

双价表达载体转化辣椒的体系优化

将含有PamPAP和Cry2Aa2的双价表达载体通过农杆菌介导法转化辣椒,并对其遗传转化体系进行优化,从而建立辣椒Flamingo-bill农杆菌介导的高效遗传转化体系。结果表明：Flamingo-bill外植体的不定芽容易伸长,不定芽分化率明显高于带柄子叶;延迟筛选4~6d可显著提高Flamingo-bill外植体不定芽的分化率和抗性率;Flamingo-bill外植体最适筛选浓度为甘露糖18g/L和蔗糖12 g/L;抗性苗生根最佳培养基为MS+0.2 mg/LNAA+     

根癌农杆菌介导转录因子CBF1基因对菊花的转化

利用根癌农杆菌介导法对菊花品种'小金黄'叶片进行遗传转化,研究影响菊花转化的若干因素,建立一套高效的遗传转化体系.结果表明:2 d的预培养,OD600值约为0.5的农杆菌菌液添加50 mg/L AS,侵染时间3 min,2 d的共培养,从分化培养基获得的抗性芽在生根培养基MS+0.4 mg/L NAA+10 mg/L Km+100 mg/L Cef上进行延迟筛选,有利于获得较高的转化效率.PCR检测表明,CBF1基因已整合到菊花基因组中,共获得18株转基因植株,在抗性株系中PCR阳性率为36.7%.     

通过根癌农杆菌介导法将抗虫基因CpTI导入辣椒的研究

研究建立了一套简单、高效的辣椒遗传转化系统。利用根癌农杆菌介导的带柄子叶转化法将豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因转入辣椒栽培品种益都羊角椒中。对获得的 3 3株卡那霉素 (Km)抗性再生植株进行PCR检测 ,证明有 6株为转CpTI基因植株     

农杆菌介导小黑杨花粉植株转化体系的建立

通过对影响根癌农杆菌介导小黑杨花粉植株转化效果各种因素的研究,建立了小黑扬花粉植株高效稳定的转化体系.研究结果表明:小黑杨花粉植株叶片外植体在分化培养基中预培养2 d,用OD600值为0.1的工程菌液侵染3～5min,黑暗条件下共培养2～3 d,采用适宜的脱菌方法有利于提高遗传转化率,而用在培养基中加入CaCl2则不利于遗传转化:叶片外植体与农杆菌共培养后.经过抗性芽的诱导、叶片的冉分化和根的再生,3个月后即可获得抗性苗;抗性植株经PCR和Southem斑点杂交检测,表明外源基因已转入小黑杨花粉植株的基因组中.     

根癌农杆菌法转化康乃馨的条件探索

[目的]为构建高效的康乃馨遗传转化体系奠定基础。[方法]以康乃馨叶片为受体材料,通过抗G418筛选,探讨预培养时间、根癌农杆菌菌液浓度、共培养时间等因素对根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的影响。[结果]20 mg/ml G418是康乃馨叶片转化的适宜浓度。随着预培养时间的增加,康乃馨叶片的存活率降低,预培养2~3 d时抗性芽分化率较高。当根癌农杆菌OD600为0.5~0.8时,抗性芽分化率较高,适合康乃馨转化。共培养2~3 d时,康乃馨叶片生长状态好,抗性芽分化率最高。[结论]预培养、共培养各2~3 d,菌液浓度OD600为0.5~0.8是根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的适宜条件。     

通过根癌农杆菌介导法获得新疆甜瓜抗病优质新品系

用新疆甜瓜无菌苗子叶块,通过根癌农杆菌介导法,将黄瓜花叶病毒外壳蛋白ｃＤＮＡ基因导入“新红心脆”等６个品种（系）,经卡那霉素筛选,获得大量Ｋｍ抗性植株,其中部分Ｋｍ抗性植株经Ｌｕｉｓ法检测,表达了胭脂碱合成酶活性。进一步经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ＤＯＴ－Ｅｌｉｓａ,ＰＣＲ特异扩增。Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法检测,结果证明了Ｋｍ抗性植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因,长度为１ｋｂ,并能有效表达,表达产     

甜瓜抗CMV转基因植株的分子生物学研究

本研究建立了转目的基因植物基因整台及表达的分子生物学鉴定系统，并用报告基因检测、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ特异扩增、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法，研究了用叶盘法经Ｔｉ质粒转化的甜瓜再生植株ＣＭＶ－ＣＰ基因的整合与表达。结果表明：再生植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因，长度为１ｋｂ，并能有效表达。表达产物分子量为２４Ｋｄ，确为ＣＭＶ的外壳蛋白，其表达量占细胞总蛋白约５％。     

不同玉米自交系中导入SAMS基因的转化与检测

以优良玉米自交系丹598、郑58、昌7-2、掖478的茎尖为受体,采用农杆菌介导法将抗旱基因SAMS转入玉米,对转化植株进行PCR检测,共获得阳性植株35株,表明SAMS基因已经整合到玉米基因组中.同时对影响茎尖转化效率的主要因素进行研究.结果表明,侵染时间、菌液浓度、共培养时间和乙酰丁香酮对转化率影响显著.菌液OD600值为0.5～0.7,侵染15 min,共培养3d,乙酰丁香酮浓度为100 μmol/L时,有利于提高玉米茎尖转化率,其中昌7-2转化率最高.     

农杆菌介导外源基因转化棉花上胚轴方法的研究

[目的]介绍一种获得棉花转基因植株的新方法。[方法]以棉花感受态萌动的上胚轴作为外源基因转化的受体,用农杆菌介导法将携带有筛选标记NPTII(新霉素磷酸转移酶)基因及GFP(绿色荧光蛋白)报告基因导入棉花,研究了农杆菌介导法用于棉花感受态萌动上胚轴转化的预培养时间,浸菌时间,共培养时间及抗生素处理浓度等。[结果]在新疆棉花离体培养植株直接再生植株基础上,经3~5d预培养处理过的棉花上胚轴,在浸菌15 min共培养2 d后,经50 mg/L kan筛选,用1 000 mg/L头孢霉素抑菌,并用相对高含量细胞分裂素和低含量生长素的组合对其进行直接出芽培养,从而获得抗性小苗。[结论]用农杆菌转化处理棉花上胚轴是一种操作简单、重复性好、非基因依赖型的转化方法。     

杂交枫香胚性愈伤组织遗传转化体系研究

  目的  杂交枫香是我国重要的用材和观赏树种资源,但其遗传转化体系尚未建立。建立杂交枫香遗传转化体系为杂交枫香性状改良和基因功能研究提供了方法。  方法  本研究基于杂交枫香高效的体细胞胚胎发生技术,用根癌农杆菌介导的遗传转化法对其胚性愈伤组织进行遗传转化,对潮霉素选择压、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、以及共培养温度等影响因素采用正交试验等设计进行了研究。  结果  潮霉素对胚性愈伤组织的最小致死质量浓度为10 mg/L;获得最多Gus阳性斑点数的组合的菌液OD₆₀₀为0.8,共培养时间为3 d,侵染时间为10 min,共培养温度为25 ℃;获得最多转基因阳性愈伤组织的组合的菌液OD₆₀₀为0.2,共培养时间为2 d,侵染时间为10 min,共培养温度为23 ℃;且通过极差分析,最优处理组合的共培养时间为2 d,菌液OD₆₀₀为0.2,侵染时间为20 min,共培养温度为23 ℃。  结论  经分子鉴定,共获得210个转基因阳性愈伤组织,初步建立了农杆菌介导的杂交枫香遗传转化体系,为阔叶树种愈伤组织的遗传转化提供了更多的可行性依据。      

以pmf为筛选标记的水稻转基因研究

[目的]建立一种快速、高效的甘露糖安全筛选体系。[方法]以绿色荧光蛋白（GFP）编码基因为报告基因,用农杆菌介导的方法将磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）转入水稻品种皖粳97,并对转化和筛选条件进行优化。[结果]受体品种皖粳97,在32oC光照条件下诱导愈伤的出愈率可达90．3％,且生长较快;培养基中甘露糖筛选压力以5∥L蔗糖＋15g／L甘露糖较为适宜,在该条件下筛选21d,进而分化成苗。转化频率可达20．6％。[结论]该研究确立的甘露糖筛选体系,能明显缩短筛选周期、提高转化效率,有利于转基因水稻的安全生产。     

农杆菌介导的水稻草矮病毒NS6基因的转化

水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus,RGSV)RNA6片段毒义链编码的非结构蛋白NS6,与病害症状密切相关,被称为病害特异蛋白.因此,应用农杆菌介导法,选取对RGSV表现不同抗性的台农67、中花6号、中花12号、中花15号、台中1号、合系28和063817个水稻品种,以其未成熟胚或成熟胚预培养4d后,诱导生长旺盛的愈伤组织为外植体,将NS6基因导入其中,对影响水稻再生及农杆菌转化的主要因素进行了比较研究,并获得了转NS6基因工程植株.结果表明,以未成熟胚为受体,获得的抗性愈伤组织转化率明显高于成熟胚;水稻不同品种对农杆菌转化反应不同;添加一定浓度乙酰丁香酮和葡萄糖,可提高抗性愈伤组织形成率;选用G418进行抗性筛选能获得转NS6基因再生植株,用卡那霉素筛选产生的愈伤组织则未能获得再生植株.     

根癌农杆菌介导烟草K326遗传转化体系优化

[目的]优化根癌农杆菌介导烟草K326遗传转化体系。[方法]以烟草无菌苗的叶片为外植体,通过农杆菌介导法对其遗传转化体系进行了优化研究。[结果]外植体在MS＋2mg/L6-BA＋0.2mg/LIAA培养基上进行2d预培养后,用农杆菌GV3101（浸染浓度为OD600=0.6）浸染5min,转化效率最高,达63%;经过PCR检测初步证明nptII基因已整合到烟草再生植株中。[结论]该研究建立了高效烟草K326叶片农杆菌介导的遗传转化体系。     

亲环素基因GhCYP1在陆地棉中的过量表达及耐盐性分析

通过农杆菌介导法将亲环素基因GhCYP1导入陆地棉棉花栽培品种中棉35中,经过卡那霉素抗性选择、PCR检测和系统选育获得5个不同转基因纯合系。在温室盆栽条件下,于3片真叶期对转基因棉花纯合系和非转基因对照进行200 mmol/L NaCl胁迫处理20 d。结果表明,转GhCYP1基因棉花株系比对照长势强,株高比对照提高2~5 cm,地上部分单株鲜质量比对照增加7.1%~12.4%,抗氧化物酶SOD,POD,CAT等的活性以及叶绿素含量显著高于对照。说明过量表达GhCYP1基因提高了陆地棉对盐碱的抗性。