应用噬菌体生物扩增技术检测牛结核分枝杆菌的方法研究

建立噬菌体生物扩增技术检测牛结核分枝杆菌试验方法,探讨最佳检测条件。比较各种检测方法对测定结果的影响。结果:噬菌体工作浓度为1×108PFU/ml、37℃感染2h,杀毒剂浓度在100mmol/L、室温作用10min为最佳检测条件。指示细胞浓度在1×106条/ml时,形成噬菌斑清晰,便于计数。结论:在选择最佳测定条件下,噬菌体生物扩增法检测牛结核分枝杆菌,快速、简便、灵敏。     

牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用

根据已发表的牛分枝杆菌的pncA的基因序列，设计和合成了一对可扩增294bp目的片段的引物，建立了特异性检测牛分枝杆菌的PCR方法。对牛分枝杆菌国际参考株和国内分离株成功扩增出294bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌和草分枝杆菌DNA的PCR扩增结果均为阴性。本PCR方法检测的敏感度可达到50pg。对10份牛分枝杆菌培养阳性和10份阴性样品的DNA分别进行了PCR检测，结果10份阳性样品中有9份样品为PCR扩增阳性，阳性符合率为90％（9／10）；而10份阴性样品则PCR扩增全部为阴性，阴性符合率为100％（10／10）。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

牛结核分枝杆菌PCR检测方法的建立

随着牛结核病疫情日趋严重,快速、高效的分子生物学检测方法建立显得十分必要.试验设计合成了牛结核分枝杆菌特异性引物,优化反应条件,建立了牛分枝杆菌PCR检测方法.结果显示,所建立的牛结核分枝杆菌PCR检测方法可有效检测牛结核分枝杆菌,在模板浓度、引物浓度和退火温度分别为1.32 μg/mL、0.5 μm/L、54℃时最佳;性能评估显示,该方法具有较好的特异性、敏感性和临床应用性,为我省牛结核病的综合防控提供关键技术.     

间接ELISA检测牛分枝杆菌抗体方法的建立及初步应用

针对现行牛结核病检疫方法结核菌素皮内变态反应(TST)的不足,本研究选用牛分枝杆菌特异性抗原MPB83、MPB70及CFP10与ESAT-6融合蛋白(CFP10-ESAT-6)分别建立了检测牛分枝杆菌特异抗体的间接酶联免疫吸附方法(ELISA)。上述3种抗原中一种以上抗原的特异性抗体为阳性时,即可判断为结核检测阳性。以TST为标准,判断ELISA方法的敏感性与特异性。结果证明,ELISA方法具有较好的敏感性(71.4%)。对ELISA检测为强阳性的奶牛进行细菌分离,并对5头结核菌分离阳性奶牛进行TST检测,结果有3头为TST阳性,2头可疑,显示出ELISA方法对严重感染牛的检测较TST具有更高的敏感性。由于TST与ELISA分别以细胞免疫与体液免疫为基础,两种检测方法结合应用可进一步提高牛结核病的检出率。     

噬菌体生物扩增法检测犬结核病

2006年4月12日,四川省崇州市张某将两只贵宾犬(价值80余万元)送四川农业大学兽医院就诊。病犬在成都某宠物医院按照肺炎医治16天,但效果不佳,且症状加剧。在我院经实验室检测,最后确诊为犬结核病。其中一条犬因病情严重,来我     

噬菌体生物扩增技术检测牛结核病的影响因素

噬菌体生物扩增法（PhaB）是一种新型技术,根据其噬菌体生长快、特异性高等特点,快速准确地检出与噬菌体相应的细菌。我们参照文献方法,建立了噬菌体生物扩增技术检测牛结核病的试验方法。并对影响试验结果的各种因素进行探讨,最终确立了最佳试验条件。     

噬菌体生物扩增法检测犬结核病

2006年4月12日,四川省崇州市张某将两只贵宾犬(价值80余万元)送四川农业大学兽医院就诊.病犬在成都某宠物医院按照肺炎医治16 d,但效果不佳,且症状加剧.     

牛体内耻垢分枝杆菌噬菌体的分离与保存

鉴于体外分离噬菌体治疗价值的局限性,本研究从12份副结核血清学检测阳性的牛唾液和鼻黏液中成功分离纯化到不同牛体来源的4株耻垢分枝杆菌烈性噬菌体.电镜观察发现它们均属有尾病毒目,肌尾病毒科.为进一步研究和应用这些噬菌体,以其中一株为受试株,比较了16种保存方法,发现其中8种方法保存效果较好.     

应用TaqMan荧光定量PCR检测牛分枝杆菌

为建立快速检测牛分枝杆菌(M.bovis)的TaqMan荧光定量PCR方法,本研究以GenBank登录的M.bovis特有229 bp基因为研究对象,设计并合成引物及探针。该方法具有较好的特异性,与标准质控菌株呈阳性反应,与其他微生物样品呈阴性反应;灵敏性最低检测值可达1 pg/mL;对20阳性临床样品进行荧光定量PCR检测,均为阳性;而对培养为阴性的20份临床样品进行检测,6份为阳性。该研究结果表明,建立的方法特异性强,敏感性高,稳定性好,能够用于M.bovis的鉴别检测,对牛分枝杆菌病的快速检测和早期诊断具有重要意义。     

牛结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立可应用于快速检测奶牛结核病、评估鲜乳污染状况、追溯传播途径的试验方法,本研究根据牛结核分枝杆菌基因组设计合成特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化,构建标准曲线,评价该方法的性能。结果显示,本研究所建立的实时荧光定量PCR方法能有效检测牛结核分枝杆菌目的基因,其最佳引物浓度为400 nmol/L,最佳退火温度为52 ℃。所构建的标准曲线相关性好,可用于样本的定量检测。该方法的性能评价显示,其最小检出模板浓度为80.24 ng/L,且该方法具有较好的特异性、可重复性,可对鲜乳样本进行检测。试验结果表明,本研究所建方法可用于牛结核分枝杆菌的定性和定量检测,这为奶牛结核病的诊断与净化及鲜乳食品安全评估提供重要技术。     

Development and Application of FQ-PCR Assay for Detecting Mycobacterium bovis

To develop a detection method for rapid diagnosis of dairy cow tuberculosis, evaluation of the raw milk contamination status and tracing the route of transmission, specific primers of Mycobacterium bovis were designed to develop the FQ-PCR assay and the reaction conditions were optimized.Standard curve of the FQ-PCR test was developed and its properties were evaluated.The results showed that the developed FQ-PCR test could be used to detect the Mycobacterium bovis.The best primer concentration and annealing temperature were 400 nmol/L and 52 ℃, respectively.Properties evaluation showed that the method had good specificity, sensitivity, repeatability and clinical application.The test results indicated this method could be used to qualitatively and quantitatively detect Mycobacterium bovis.It would be an important technology for diagnosis and decontamination of dairy cow tuberculosis and safety assessment of raw milk.     

Establishment and Application of Mycobacterium Typing Triple PCR Detection Method

This study was aimed to establish a triple PCR method to rapidly identify Mycobacterium species, and evaluate its testing reliability.Three pairs of primer that were respectively specific to rv 3036c, rv 1970f and pncA genes of Mycobacterium were designed to establish a triple PCR for preliminary identification of Mycobacterium tuberculosis(M.tuberculosis), Mycobacterium bovis(M.bovis) and other Mycobacterium spp.PCR products were the expected sizes of 500(rv3036c), 125(rv1970f) and 249 bp(pncA), and contained two DNA bands(500 and 125 bp) with M.tuberculosis DNA template, two DNA bands(500 and 249 bp) with M.bovis DNA template.No band or non-specific band appeared with Mycobacterium spp.except M.tuberculosis and M.bovis DNA templates.The sensitivity of the triple PCR was calculated to 50 pg/μL template of genomic DNA.86 acid-fast bacteria were detected by the triple PCR, 16S rDNA and ITS gene sequencing, growth test and biochemical test, and the results were consistent between triple PCR and 16S rDNA and ITS gene sequencing.The detecting accuracy of triple PCR was 100%, and higher than growth test and biochemical test.     

分枝杆菌分型三重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定分枝杆菌的三重PCR方法,并比较分析其在临床检测中的可靠性。根据已发表的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌rv 3036c基因,结核分枝杆菌rv 1970f基因(RD7)和牛分枝杆菌pncA基因的序列,改造并设计合成了3对特异性扩增引物,建立了一种能对分枝杆菌样品进行初步鉴定的三重PCR方法。结果显示该方法可针对rv 3036c、rv 1970f和pncA基因分别扩增出大小为500、125和249 bp的目的片段,能特异性检测出结核分枝杆菌(500和125 bp两条带)和牛分枝杆菌(500和249 bp两条带),并可将结核分枝杆菌、牛分枝杆菌与其他分枝杆菌加以区分。本方法的检测灵敏度为50 pg/μL模板基因组DNA。对86株抗酸染色阳性菌进行三重PCR鉴定,鉴定结果与细菌16S rDNA和ITS序列测定结果一致,检测准确度为100%,优于生长特征和生化试验鉴定。     

奶水牛牛分枝杆菌的分离与鉴定

从患疑似结核病的广西奶水牛群中进行牛分枝杆菌的分离和鉴定。共收集了238份临床样品(鼻黏液及牛奶),病料经1.25 mol/mL NaOH溶液预处理后,接种罗氏培养基进行细菌分离。分离菌经进一步纯化后进行抗酸性染色并镜检,镜检后判为阳性的细菌再接种到鉴别培养基上进行鉴别培养,同时,应用PCR方法对镜检为阳性的细菌进行进一步的鉴别检验。结果收集的所有临床样品,经37℃培养后共获得细菌12株。这12株菌经抗酸性染色后镜检都为分枝杆菌阳性,进一步经鉴别培养基鉴定12株菌中有2株为牛分枝杆菌,其余均为非典型分枝杆菌。2株牛分枝杆菌经PCR方法鉴定得以确诊。     

荧光原位杂交在布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌检测中的应用

荧光原位杂交技术可快速鉴定病原菌,较传统病原分离鉴定方法具有明显优势。针对我国动物布鲁氏菌病和牛结核病这两个重要的人兽共患病,目前还没有标准的荧光原位杂交检测方法可供参考。为建立布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌荧光原位杂交检测方法,快速诊断动物布鲁氏菌病和牛结核病,利用布鲁氏菌探针Bru-996和结核分枝杆菌探针MTB770,通过优化杂交温度、杂交时间和样品处理等关键条件,确定最佳检测程序;根据已知背景的菌株和临床样品,对Bru-996和MTB770探针的特异性和敏感性进行评价,最终建立了荧光复位杂交诊断方法。结果显示:反应条件优化后,该方法可在4h内完成布鲁氏菌检测;荧光标记Bru-996探针与布鲁氏菌待检菌株的杂交结果均为阳性,而与结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌和大肠杆菌杂交结果均为阴性,并从5个已知背景的组织病料中成功检出布鲁氏菌。牛结核分枝杆菌检测则需要6~8h,杂交前必须对样品用二甲苯和溶菌酶进行处理;MTB770探针可特异性识别并能从牛肺部结节中检出牛结核分枝杆菌。结果表明,荧光原位杂交方法快速、简便,而且Bru-996和MTB770探针分别在布鲁氏菌和牛结核分枝杆菌检测上具有较高的特异性,可替代传统的病原分离鉴定,作为动物布鲁氏菌病和牛结核病的实验室确诊方法。     

Direct Detection of Mycobacterium bovis in Bovine Lymph Nodes by PCR

Thirty‐five lymph node samples were taken from animals with macroscopic lesions consistent with Mycobacterium bovis infection. The animals were identified by postmortem examination in an abattoir in the northwestern region of state of Paraná, Brazil. Twenty‐two of the animals had previously been found to be tuberculin skin test positive. Tissue samples were decontaminated by Petroff’s method and processed for acid‐fast bacilli staining, culture in Stonebrink and Lowenstein‐Jensen media and DNA extraction. Lymph node DNA samples were amplified by PCR in the absence and presence (inhibitor controls) of DNA extracted from M. bovis culture. Mycobacterium bovis was identified in 14 (42.4%) lymph node samples by both PCR and by culture. The frequency of PCR‐positive results (54.5%) was similar to that of culture‐positive results (51.5%, P > 0.05). The percentage of PCR‐positive lymph nodes increased from 39.4% (13/33) to 54.5% (18/33) when samples that were initially PCR‐negative were reanalysed using 2.5 μl DNA (two samples) and 1 : 2 diluted DNA (three samples). PCR sensitivity was affected by inhibitors and by the amount of DNA in the clinical samples. Our results indicate that direct detection of M. bovis in lymph nodes by PCR may be a fast and useful tool for bovine tuberculosis epidemic management in the region.     

牛分支杆菌主要保护性抗原研究进展

牛结核病是一种人兽共患病,是世界动物卫生组织(OIE)列为必须上报的传染病,主要由牛分支杆菌引起,其蛋白可以诱导动物机体产生相应抗体.这些蛋白可以用来诊断结核病,对新型疫苗的研制也具有重要意义.因此,这些蛋白一直是分子生物学研究领域中的热点.论文就牛分支杆菌主要保护性抗原的特性及其在诊断中的应用进行了综述.