H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/2/2005活候选疫苗株的构建及其对鸡致病性的研究

A／Ann Arbor／6／60Ca（H2N2）冷适应疫苗供体株具有冷适应性、温度敏感性和致弱性表型。本研究利用基因工程技术体外合成A／Ann Arbor／6／60Ca（H2N2）冷适应疫苗株具有冷适应性的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M、NS,从A／Anhui／2／2005（H5N1）毒株获得HA、NA,并对HA基因上的多个连续碱性氨基酸基序进行了缺失修饰。将上述8个基因片段分别克隆至pBD双向表达载体中测序鉴定。利用质粒反向遗传操作系统,将构建正确的8个重组pBD质粒转染Vero细胞拯救病毒。经RT—PCR和序列测定鉴定,结果表明本试验成功获得了一株H5N1亚型A／Anhui／2／2005重组病毒,将其命名为AH／AAca,救获的重组病毒具有预期的温度敏感性和冷适应性生物学特性。随后进行了AH／AAca人工感染SPF鸡的感染性和致病性试验,结果表明其对鸡既无感染性,也无致病性。AH／AAca的获得为评价其在小鼠、非人类灵长目等动物模型上的保护效力的研究打下了坚实基础,为我国预防人禽流感的流行建立了技术储备。     

H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/LY1/2017株反向遗传操作系统的建立

为了构建H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/LY1/2017的反向遗传操作平台,通过RT-PCR技术分别扩增该毒株的8个基因片段,并分别克隆至双向转录表达载体PHW2000中.8个质粒共转染293T/MDCK混合细胞,96 h后将细胞板反复冻融3次收获细胞悬液,将其接种10日龄SPF鸡胚,96 h后收集尿囊液并将拯救毒株命名为rH9N2,测定其HA效价为1:256.rH9N2在HA、MDT、EID50、TCID50以及病毒生长曲线、空斑等方面保持了与亲本毒株一致的生物学特性.本研究成功构建了A/Chicken/Shandong/LY1/2017的感染性克隆,为今后通过基因替换、定点突变技术研究H9N2亚型禽流感病毒致病性的分子机制奠定了基础.     

H6N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

为建立H6N6亚型禽流感病-毒(AIV) A/Chicken/GuangDong/S1311/10 (W-CKGD)反向遗传操作系统,本研究构建了W-CKGD的8个重组质粒,拯救出AIV A/Chicken/GuangDong/S1311/10 (R-CKGD).全基因序列测定结果表明,救获病毒R-CKGD与野生病毒W-CKGD的核苷酸序列完全相同.R-CKGD与W-CKGD具有相同的受体结合特性和对BALB/c小鼠均呈低致病性,以106 EID50剂量鼻腔感染BALB/c小鼠,病毒仅在小鼠的呼吸道复制,可以引起小鼠体重下降但均不造成死亡.实验结果表明,R-CKGD与W-CKGD保持了一致的生物学特性,从而为进一步研究H6亚型AIV的致病机理及跨宿主传播机制等提供了良好的平台.     

H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立

利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）的8个基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上,构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞,收取转染48 h时的细胞上清并接种9～11日龄SPF鸡胚,成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定,确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）基因组。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;同时,为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/duck/HuBei/49/05株反向基因操作系统的建立

水禽是禽流感病毒的天然储存库,为了研究高致病性禽流感病毒对水禽致病性的分子基础,研究构建了DKHB/49/05的8质粒反向遗传操作系统。用Trizol从含A/duck/HuBei/49/05株病毒的鸡胚尿囊液中提取总RNA,用RT-PCR扩增PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因片段,将其分别克隆至pBD载体中。利用8质粒反向遗传操作系统,将重组的pBD质粒共转染293T细胞,成功拯救了该病毒,并命名为R-DKHB。     

1株H9N2亚型禽流感变异株HA基因遗传演化分析及反向遗传操作系统的建立

为了解2018年江苏养殖场分离的1株H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Jiangsu/76/2018(JS/76)的遗传变异情况,对其HA基因进行了测序和遗传演化分析,并且成功构建JS/76的反向遗传操作系统.HA基因演化分析结果显示,JS/76毒株的HA基因裂解位点为PSRSSR↓GLF,是典型低致病性禽流感...     

H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建

为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。     

两株不同致病力H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的构建

为研究H9N2亚型禽流感病毒毒株对禽类致病性的分子致病机制,选用A/chicken/Shandong/818/2010和A/chicken/Shandong/196/2011两株致病力存在明显差异的野生型H9N2亚型禽流感病毒,用RT-PCR扩增其全基因组序列,并将其全部克隆于PHW2000双向转录/表达载体。经测序验证后,将其转入293T细胞,并拯救出2株具有血凝活性的毒株。对拯救毒株进行全基因组测序验证后,结果表明拯救出的毒株与2株野生型病毒的核苷酸序列完全一致;体外试验证明,拯救毒株与野生毒株在鸡胚和细胞中的复制能力一致;动物试验证明,拯救毒株保持了野生型毒株对鸡和鸡胚的致病力。这两套反向遗传操作系统的构建,研究了病毒变异规律,发现了可能导致H9N2亚型禽流感病毒增强的关键氨基酸位点,为流感的监测及预防提供依据。     

H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作平台的建立

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)在自然界中广泛存在和传播,给养禽业造成了巨大损失。为了进一步揭示该病毒的致病机制,本研究采用RT-PCR技术扩增禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/1/2006(简称SH1)的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS 8个基因片段,并分别克隆至PLLB双向表达载体上。采用8质粒系统共转染293T细胞,转染48 h后加入TPCK胰酶作用2 h,将上清液和细胞一同接种9~11日龄SPF鸡胚,并检测其血凝效价。经序列比对,拯救获得的病毒rSH1的8个基因片段序列均与亲本病毒SH1的序列相同。实验结果表明,本研究成功建立了H9N2亚型禽流感病毒反向遗传操作系统,为该病毒的致病机理和传播机制研究等奠定了技术平台。     

H5N6亚型禽流感病毒反向遗传疫苗株的构建及免疫保护试验

为应对抗原性已发生变异的第2.3.4.6分支H5N6亚型禽流感病毒(AIV)引发的潜在流行,本研究利用反向遗传操作技术,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以H5N6亚型AIV A/Chicken/SC/6/2014(C6)的基因组为模板,经RT-PCR扩增其HA及NA基因,并对HA基因进行分子修饰,去除与H5亚型AIV致病力有关的HA蛋白裂解位点处的多个碱性氨基酸,使其获得低致病性AIV的分子特征(即将-PLRERRRKR-突变为-PQRETR-),成功构建了H5N6亚型AIV疫苗候选株r C6。免疫效力试验表明,r C6重组灭活疫苗可以诱导产生高水平的血凝抑制抗体。免疫攻毒保护试验表明,r C6重组灭活疫苗可以提供SPF鸡抵抗同源和异源H5N6病毒100%的保护,而针对第2.3.4分支的Re-5疫苗仅能提供大约10%的保护。利用反向遗传技术构建的r C6重组疫苗候选株为该分支病毒的防控提供了有益的尝试。     

H5N1亚型禽流感病毒A/Guangxi/1/2005株抗药机制的研究

为研究H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的抗药机制,本研究选取Clade2.3.4亚群中一株对金刚烷胺敏感的人源AIV A/Guangxi/1/2005(H5N1)(S-GX05),用抗流感病毒药物金刚烷胺对其进行定向诱导,筛选出一株抗药性病毒株,命名为R-A/Guangxi/1/2005(R-GX05)。通过全基因测序并与S-GX05全基因序列进行对比,结果显示S-GX05只在其M2蛋白中有一个氨基酸位点发生突变,即A30P;抗药性鉴定这两株病毒的半数药物抑制浓度(IC50)分别为0.9μM和48.9μM,表明R-GX05对金刚烷胺表现出一定程度的抗性。动物实验证实,这两株病毒对BALB/c小鼠的致病性基本一致,均表现出高致病性,其MLD50分别为4.7 log10 EID50和5.0 log10 EID50,两株病毒在小鼠体内各组织脏器中的分布及增殖能力也基本相同。这些结果表明,S-GX05在药物压力下产生抗药性后,并未引起其它生物学特性的改变。A30P的发现为进一步从分子水平上研究H5N1亚型AIV的抗药机制及新型抗流感新药的研发奠定了基础。     

富集H5N1亚型禽流感病毒生物磁珠的制备

制备了一种可以从大体积、低浓度病毒液体样品中富集H5N1亚型禽流感病毒的新型生物磁珠。比较了氨基磁珠与羧基磁珠作为生物磁珠载体的效果。结果表明,以pH 4.5MES（2-（N-吗啉）乙磺酸）为活化缓冲液活化羧基磁珠每毫克可以结合9.8μg的胎球蛋白,pH 4.5PBS（磷酸盐缓冲液）为活化缓冲液每毫克可以结合9.25μg的胎球蛋白;以5%戊二醛为活化剂活化氨基磁珠1h较以2.5%、7.5%的戊二醛为活化剂每毫克结合胎球蛋白量多,为8.12μg。制备完成的羧基型生物磁珠与氨基型生物磁珠均可富集H5N1亚型禽流感病毒,而羧基型生物磁珠可以富集检测出15倍病毒稀释液,敏感性较氨基磁珠富集检测出7倍病毒稀释液高。     

利用反向遗传技术拯救H9N2重组病毒

为研制高效特异的H9N2亚型AI疫苗,选取我国具有代表性的毒株A/chicken/Shanghai/10/01(H9N2)(简称SH10),以12质粒系统为基础,利用反向遗传操作技术构建了1株表面基因由SH10提供、内部基因由12质粒系统提供的重组病毒SH/PR8,为新型疫苗的研制提供了新的毒株。     

Molecular and phylogenetic analysis of the H5N1 avian influenza virus caused the first highly pathogenic avian influenza outbreak in poultry in the Czech Republic in 2007

On 19th July 2007 re-occurrence of the H5N1 highly pathogenic avian influenza (HPAI) virus was noticed in Europe. The index strain of this novel H5N1 lineage was identified in the Czech Republic where it caused historically the first HPAI outbreak in commercial poultry. In the present study we performed molecular and phylogenetic analysis of the index strain of the re-emerging H5N1 virus lineage along with the Czech and the Slovak H5N1 strains collected in 2006 and established the evolutionary relationships to additional viruses circulated in Europe in 2005-2006. Our analysis revealed that the Czech and the Slovak H5N1 viruses collected during 2006 were separated into two sub-clades 2.2.1 and 2.2.2, which predominated in Europe during 2005-2006. On the contrary the newly emerged H5N1 viruses belonged to a clearly distinguishable sub-clade 2.2.3. Within the sub-clade 2.2.3 the Czech H5N1 strains showed the closest relationships to the simultaneously circulated viruses from Germany, Romania and Russia (Krasnodar) in 2007 and were further clustered with the viruses from Afghanistan and Mongolia circulated in 2006. The origin of the Czech 2007 H5N1 HPAI strains was also discussed.     

利用假病毒技术筛选H5N1亚型禽流感病毒中和活性单克隆抗体

为筛选H5N1禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)特异性中和抗体,本研究构建了表达HA蛋白的重组质粒,利用该重组质粒及缺失表达人免疫缺陷病病毒1型(HIV-1)囊膜蛋白基因的骨架质粒,构建了表面整合有H5亚型AIV HA蛋白的HIV假病毒。利用该假病毒系统,筛选得到一株具有中和活性的单克隆抗体(MAb)。经测定,该MAb与纯化的全病毒具有较好的反应性,其对HIV-H5HA假病毒的中和效价为64。中和试验表明该MAb能够有效阻断野生型病毒对鸡胚的感染。本研究结果为开发H5N1 AIV的被动免疫治疗方法奠定了基础,同时对亚单位疫苗的研制也具有一定的意义。     

禽流感分离株GD/1/96(H5N1)非结构蛋白结构建模

为预测H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白全长结构,本研究以A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株NS1蛋白氨基酸序列为目标序列,通过同源建模以及蛋白质结构叠合预测出NS1蛋白全长单体以及二聚体初始结构,采用约束分子动力学方法对初始结构进行优化,并利用立体化学、折叠可靠性、残基包装质量等评判方法对优化后的模型进行评估。结果表明所建立的NS1蛋白全长单体及二聚体结构模型具有很高的可信度,可用于基于结构的功能研究及虚拟筛选等工作。     

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的真核表达及其在细胞中的分布

为构建禽流感病毒(AIV) H5N1亚型非结构蛋白NS1的真核表达载体,并鉴定其在哺乳动物细胞中的表达与分布,本研究采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒的总RNA中扩增NS1全长基因,并将其克隆于pXJ40中,构建真核表达载体pXJ40-HA-NSl.将该重组质粒转染293T细胞,通过western blot方法鉴定表达的NS1蛋白;并以免疫荧光技术观察NS1在H1299细胞中的分布与定位.Western blot结果显示NS1基因编码蛋白获得表达,免疫荧光检测显示NS1蛋白主要存在于细胞核中.本研究为NS1蛋白功能和H5N1亚型AIV致病机制的研究奠定了基础.     

两株H5N1亚型禽流感病毒的基因分析及其在不同宿主中致病性的比较

为了解两株高致病性禽流感病毒(HPAIV)的分子特征及其对不同宿主的致病性,本研究对DK/HuN/4/08和CK/GX/2/09进行全基因组序列的测定,分析结果表明:两个病毒分离株HA基因的裂解位点均具有HPAIV特有的基序(341RRR(R)KR345/346),并且均属于Clade2.3.2分支,基因组同源性在97.4%～98.3%之间。致病性试验显示,两个病毒分离株均能够以106EID50感染量在3 d内引起鸡全部死亡,并且各脏器均检测到高滴度的病毒含量;两者在SPF鸭中呈现不同的致病性,CK/GX/2/09在4 d内可以使感染鸭100%死亡,而DK/HuN/4/08只引起25%的死亡率;同样在小鼠试验中,两者致病力差异与在鸭体中的反应一致,其MLD50分别为1.63 log10EID50和6.2 log10EID50。本研究表明,这两株遗传背景相似的HPAIV在鸡、鸭和小鼠中的致病性不同,为进一步利用反向遗传技术研究这两株病毒对水禽和哺乳动物致病力差异的分子机制奠定了基础。