水稻Rubisco小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建

高效特异表达的启动子往往是转基因研究的关键因素。Rubisco小亚基启动子具有光诱导性、组织特异性和高表达的特性,可利用该启动子为转基因研究服务。本文以水稻（Oryza sativa）中花11叶片为材料,根据GenBank所报道的水稻Rubisco小亚基启动子序列,设计特异引物从水稻基因组DNA中扩增得到长度约1600bp的DNA片段,将该片段连接至T载体pMD18-TSimple,测序结果表明该片段序列与GenBank报道序列一致为100%。Plant CARE序列分析表明,该启动子具有12个与光诱导表达相关的元件。为构建光诱导表达载体,将该启动子和植物表达载体pCactF分别以KpnⅠ和XbaⅠ酶切后连接。光诱导表达载体的构建为进一步研究基因功能及利用光诱导表达载体改良作物品质奠定基础。     

一氧化氮对增强UV-B辐射后白菜叶绿素荧光特性和Rubisco活化酶的影响

一氧化氮(NO)在调节植物生长发育和响应胁迫方面起着很重要的作用。为探讨NO对白菜经增强UV-B辐射后的修复作用,以中白60白菜为材料,外源喷施NO、模拟增强UV-B辐射及两者复合进行处理,研究白菜幼苗生长发育、叶绿素荧光特性、Rubisco活化酶(RCA)含量、活性及其编码基因表达量的变化。结果表明,增强UV-B辐射后白菜幼苗生长受到抑制,表现为幼苗生物量、叶片数、叶长都大幅降低,叶绿素含量减少,光合作用强度降低,叶绿素荧光特性均减弱,RCA含量、活性及其编码基因表达量均下降。而NO+增强UV-B复合处理后,受到抑制的白菜幼苗生长得到一定程度的缓解,生物量、叶片数、叶长显著提高,叶绿素含量增多,光合作用强度、叶绿素荧光特性、RCA含量、活性及其编码基因表达量均显著上升。综上,NO可以增加叶绿素含量、植株生物量,减少胁迫造成的损害,提高幼苗光合作用强度,促进增强UV-B胁迫下白菜幼苗的生长,从而防止由于增强UV-B导致白菜产量减少所引起的农业问题。本研究结果为进一步探究一氧化氮气体分子在植物抗逆生理过程中的作用提供了理论依据。     

水稻条纹病毒CP与叶绿体Rubisco SSU引导肽融合基因的构建及其原核表达

PCR扩增获得水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)叶绿体Rubisco SSU引导肽基因和水稻条纹病毒(Rice stripe virusRSV)外壳蛋白(coat protein,CP)基因.分别借助于pGEX-4T-1和pET-29a表达载体,通过两种方法构建了融合基因PR-CP和PR-S-CP.测序表明,其读码框完整,连接部位正确.将重组子pGEX-PR-CP和pET-PR-S-CP转化大肠杆菌(Eschetichia coli)BL21(DE3)并诱导表达.SDS-PAGE电泳检测其表达产物分子量分别为64和40 kD,与预期结果大小一致.Western blot鉴定发现.两种融合基因的表达产物均能与RSVCP抗体特异结合,说明融合蛋白中RSVCP蛋白保持了自身的抗原活性,叶绿体Rubisco SSU引导肽并未影响其正确表达.可以推断两种融合基因PR-CP和PR-S-CP在生物体内表达时,融合蛋白中的Rubisco SSU引导肽和RSV CP蛋白可能都能保持各自独立的结构和功能.     

青枯菌侵染对烟草叶片H202代谢、叶绿素荧光参数的影响及其与抗病性的关系

对青枯病菌抗性的不同2个烟草品种接种青枯菌后,随接种时间的延长,病株叶片中过氧化氢(H2O2)、超氧物阴离子自由基(O2)、丙二醛(MDA)累积明显高于健株,感病品种"红花大金元"累积幅度大于抗病品种"岩烟97",抗病、感病品种间差异达到显著、极显著水平;病菌感染初期叶片超氧物歧化酶(SOD)活性下降,随后升高,抗病品种活性高于感病品种;过氧化氢酶(CAT)活性先上升而后下降,感病品种降幅高于抗病品种;过氧化物酶(POD)活性先下降而后上升,感病品种升幅大于抗病品种;病株叶绿素可变荧光(Fv)、光系统Ⅱ原初光能转换效率(Fv/Fm)及光系统Ⅱ的潜在活性(Fv/Fo)均受到抑制,感病品种受抑制程度大于抗病品种,这表明烟草品种对青枯菌的抗性与H2O2代谢以及叶绿素荧光参数有着密切关系.     

梨果黑斑病菌磷酸二酯酶PDE基因克隆及其在侵染结构分化中的表达分析

磷酸二酯酶(PDE)能够特异地催化cAMP/cGMP 3', 5'环磷酸的3'环磷酸键水解,调节胞内cAMP水平,进而调控致病真菌的生长发育,但PDE基因在梨果黑斑病菌中的具体调控机制有待研究。本研究采用反转录PCR(RT-PCR)克隆了梨果黑斑病菌Alternaria alternata中的PDEL和PDEH基因;通过TMHMM、ProtScale、SOPMA等在线分析工具对AaPDEL和AaPDEH基因及其编码蛋白进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了PDEL和PDEH基因在梨果黑斑病菌侵染结构分化过程中的表达特性。克隆得到梨果黑斑病菌PDEL和PDEH,分别命名为AaPDEL和AaPDEH,蛋白编码区(CDS)长度分别为3 132和2 886 bp,分别编码1 043和961个氨基酸。生物信息学分析表明AaPDEL和AaPDEH均属于不稳定亲水蛋白,不含信号肽也无跨膜结构,均具有多个磷酸化位点,分别定位于线粒体和细胞核上;AaPDEL和AaPDEH分别具有Class Ⅱ型和Ⅰ型保守催化结构域。系统分析结果表明,AaPDEL和AaPDEH与小麦褐斑病菌(Pyrenophora tritici-repentis)和番茄匍柄霉(Stemphylium lycopersici)亲缘关系最近,同源性分别高达79.25%和88.80%。qRT-PCR结果显示,疏水性诱导,A. alternata侵染结构分化过程中,AaPDEL和AaPDEH基因在附着胞形成阶段(6 h)表达量显著提高,较萌发初期阶段(2 h)分别上调1.19和1.97倍,表明AaPDEL和AaPDEH在A. alternata侵染结构分化中具有重要的调控作用。本研究为进一步从分子水平揭示PDE调控机制奠定了基础。     

侵染新疆甜瓜的ZYMV衣壳蛋白基因克隆及其序列分析

新疆作为中国有名的瓜果之乡,其瓜类不仅成为其中最具代表性的品牌也日益成为农民增收致富的经济支柱产业.然而近年来由于新疆瓜果日益受到病毒病威胁,严重时造成大面积减产甚至绝收,大幅度制约了农民生产积极性和生活水平的提高.小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaicvirus,ZYMV)是其中比较具有代表性的病毒,为了对新疆不同主栽地区甜瓜(Cucumis melo) ZYMV进行生物防治和抗病毒甜瓜的研究.本研究利用同源克隆的方法,扩增获得了新疆19个样点ZYMV分离物衣壳蛋白(coat protein,CP)基因全长序列,ZYMV分离物CP基因全长介于1 080～1 180 bp,编码253～301个氨基酸,蛋白质大小约33 kD.序列比对发现,ZYMV核酸序列的3'和5'非编码区末端保守性较低,编码区及其周围序列保守性较高,氨基酸序列的N端保守性高于C端.ZYMV同源性比对结果发现,病毒属于同一ZYMV基因型.通过核酸序列构建的分子进化树可以将ZYMV分为4个亚组,亚组分离依据符合地区分布特性.根据对蛋白质理化性质,包括蛋白质的动力学、化学和热力学稳定性分析得出,ZYMV均属于稳定性蛋白.结合新疆夏季平均降水量和平均气温变化趋势发现,其与对应地区ZYMV CP的疏水性指数和脂溶性指数的变化趋势存在一定相关性.分析认为,不同地区ZYMV CP的稳定性存在一定的差异,这可能与新疆特殊的气候条件与分离物所处地理环境有关.本研究通过序列分析获得19个样点ZYMV CP核酸序列以及CP特征,为今后以RNA干扰技术或基因组编辑技术培育抗病毒甜瓜,进行生物农药研发等提供了基础的数据支持,同时为开展对植物病毒的致病机理以及探究环境与病毒传播机制的研究提供初期的研究方向.     

金柑磷酸蔗糖磷酸酶的基因克隆、表达与蛋白结构分析

磷酸蔗糖磷酸酶（SPP）是植物蔗糖生物合成最后一步催化反应的关键酶,对调控植物生长发育不同时期的蔗糖合成过程有重要作用。为探索金柑（Fortunella crassifiolia Swingle）SPP基因及其编码蛋白的序列特征及其在果实发育过程的表达特性,本研究以四倍体品种脆蜜金柑（F. crassifiolia Swingle cv. Cuimi）为试验材料,采用反转录PCR和cDNA末端快速克隆（RACE）方法从金柑果肉中克隆SPP基因,对其进行生物信息学和原核表达分析,并检测果实发育不同时期该基因在果肉中的表达量。结果表明,FcSPP基因的cDNA序列全长1 638 bp,最长开放阅读框（ORF）为1 191 bp,编码396个氨基酸,理论等电点为6.57,为稳定的亲水性蛋白,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。FcSPP蛋白含有S6PP和S6PP＿C保守结构域,属于植物磷酸蔗糖磷酸酶家族成员。系统进化分析结果显示,FcSPP蛋白与甜橙SPP同源性最高,在进化树上与拟南芥等双子叶植物SPP划归为一类。此外,本研究构建了FcSPP基因的原核表达载体,诱导表达获得纯化的FcSP...     

苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因在白三叶中的表达及转基因植株的抗病性分析

以白三叶(Trifolium repens L.)的两个品种Irrigation和Huia的子叶为转化体，用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将外源的苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因转入白三叶，经过筛选、分化和再生，得到了具有卡拉霉素抗性的再生植株。对这些植株进行PCR、Southern和Northern分析，结果表明，外源目的基因已经整合到白三叶基因组中并且得到了表达。对Northern分析呈阳性的植株进行了抗病性检测，证明表达苜蓿花叶病毒外壳蛋白基因的植株病症减轻，发病率、病情指数及病毒积累量都明显低于对照，有的甚至不表现症状，达到了免疫的程度。     

耐弱光基因型马铃薯在遮阴条件下的光合和荧光特性分析

为探寻遮阴对马铃薯光合和荧光特性及吸收光能分配的影响,本研究采用大田试验,以马铃薯不耐弱光品种‘丽薯6号’和耐弱光品种‘中薯20’为材料,出苗后用遮光率70%的黑色遮阳网进行遮阴处理(T),以自然光照为对照(CK),测定了遮阴30 d后马铃薯叶片的光合作用、光响应曲线、CO_2响应曲线、光诱导曲线和叶绿素荧光参数的变化。结果表明:1)遮阴后净光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)、蒸腾速率(T_r)、最大净光合速率(P_(max))、光饱和点(LSP)、光补偿点(LCP)较CK显著下降;‘中薯20’的P_n、P_(max)、LSP较高,LCP和暗呼吸速率(R_d)较低。2)不同基因型CO_2响应参数无显著差异,但‘中薯20’的最大羧化速率(V_(cmax))和最大电子传递速率(Jmax)较高,CO_2补偿点(CCP)较低。3)高光诱导过程中,‘中薯20’反应较快,光合能力较强。4)初始荧光(F_o)、最大荧光(F_m)、最大光化学量子效率(F_v/F_m)较CK显著增加,PSⅡ实际光化学量子效率(?F/F_m′)、表观电子传递速率(ETR)和光化学猝灭系数(qP)较CK显著下降,非光化学猝灭系数(NPQ)呈增加趋势。5)非光化学热耗散(ФNPQ)和荧光耗散途径(Фf,d)比例显著增加,光化学猝灭耗散途径(ФPSⅡ)比例显著减少,主要以增加热耗散为主。遮阴后,耐弱光基因型‘中薯20’的NPQ和ФNPQ均高于不耐弱光的‘丽薯6号’,说明‘中薯20’的光合机构保护能力更强。综合分析表明,遮阴后耐弱光基因型马铃薯具有较高的净光合速率、较低的光补偿点、较低的CO_2补偿点、较快的光诱导反应速度和较高的非光化学热耗散能力。     

添加卫星RNA对黄瓜花叶病毒寄主反应及其在系统寄主中含量的影响

为了解卫星RNA(satRNA)对辅助病毒在系统寄主中的直接影响,将1株黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)的卫星RNA(satRNA)sat-Yi与本身不携带卫星RNA的CMV分离物CNa在体外进行假重组,获得了人工构建的假重组毒株CMV-NY。通过寄主反应测定、双链RNA分析和全序列分析,显示satYi与CMV-CNa基因组RNA能够稳定共存,经过反复转接也没有发现卫星RNA的序列突变。通过测定CMV-CNa和NY这2个病毒株的寄主反应,发现satRNA-Yi的存在明显延迟了CNa在所有供试寄主中的发病时间,而且明显减弱了其在多数供试寄主上的症状表现,其中在葫芦科植物上表现出减轻症状的效果最明显;用一种新建的核酸玻片杂交方法,定量测定寄主植物中CMV基因组CP基因及卫星RNA的相对含量变化,结果显示:26℃条件下,在接种5、10、15、20、25和30d的心叶烟中,2个毒株的CP基因含量都呈下降趋势,在相应的时间内,NY-CP基因在同一寄主中的含量均低于CNa-CP基因的含量;接种10d,NY与CNa的寄主适应性没有显著差异,二者基因组CP基因在6种寄主植物中的相对含量均为番茄>假酸浆>心叶烟>西葫芦>南瓜>曼陀罗。由此得出以下结论:sat-Yi降低了CMV CP基因在寄主中的含量,且随着接种时间的增加,卫星RNA的影响作用越明显;sat-Yi不改变CMV基因组RNA的寄主适应性,但是通过降低CP基因含量改变其症状特征。     

盐地碱蓬SsDREB基因的克隆与表达分析研究

盐地碱蓬（Suaeda salsa L.）是典型的盐碱地指示性植物。本研究以盐地碱蓬为材料,根据其他植物中干旱应答元件结合蛋白保守区的氨基酸序列设计简并引物,通过PCR扩增到一条长180bp的cDNA片段,继而利用RACE技术克隆了一个盐地碱蓬DREB基因全长cDNA,命名为SsDREB。SsDREBcDNA全长为14...     

侵染上海番茄的黄瓜花叶病毒及其卫星RNA的32P分子标记杂交检测及分子鉴定

2004和2005年夏季,在上海郊区露天栽培的番茄地出现典型的病毒病危害,并造成严重的产量损失。分别以32P标记的CMV基因组RNA3部分序列和卫星RNA的cDNA探针对自然感病的番茄叶组织和提纯的病毒粒子中提取的总RNA进行杂交检测,确定以上植物组织和病毒粒子中均具有CMV及卫星RNA。dsRNA分析确定自然感病叶组织中具有典型黄瓜花叶病毒(CMV)基因及其卫星RNA条带。以常规引物对感病植物的总RNA进行RT-PCR扩增,获得CMV RNA3全长克隆,经测序显示该RNA3序列属于CMV亚组Ⅱ;通过在卫星dsRNA两端分别加上15nt的单链DNA接头,以接头互补序列为引物进行扩增获得一个383nt的卫星RNA的全长序列。同源性分析结果显示其与已报道的CMV卫星RNA同源性为72.6%~99.5%,但其3′末端存在多个碱基的突变。根据同位素杂交检测及分子鉴定,CMV及其卫星RNA变异类型在上海自然感病番茄上发生和普遍存在,可能对病害流行和新的症状出现产生影响。     

茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3＇-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1（GenBank登录号为HQ225758）。该基因开放阅读框...     

小麦RPL21基因同源克隆与表达分析

为了解60S核糖体蛋白L21(ribosomal protein L21,RPL21)的基因组结构和表达模式,以GenBank数据库中小麦RPL21基因的部分序列为信息探针,采用RT-PCR和PCR技术从小麦多子房株系幼穗中克隆了RPL21基因的cDNA与DNA片段,并对该基因在小麦多子房近等基因系间的表达差异和多子房...     

烟草钾转运体基因NtHAK1的克隆及表达模式分析

采用RT-PCR的方法,结合3'RACE与5'RACE,从普通烟草(Nicotiana tabacum)品种K326中克隆出烟草K+转运体基因NtHAK1的全长cDNA序列.该序列长度为2016bp,编码378个氨基酸,其分子量为42.27kDa,等电点7.2.生物信息学分析表明,该蛋白具有6个跨膜区,含有K+转运蛋白...     

PHENOLOGY AND SEED QUALITY RESPONSE OF RAPE (B. NAPUS) VERSUS MUSTARD (B. JUNCEA) TO SULFUR AND POTASSIUM FERTILIZATION IN NORTHWEST PAKISTAN

Inappropriate sulfur and potassium fertilization, particularly with continued soil nutrient mining and yearly fluctuations in rainfall, are major factors contributing to slow growth and low seed quality of canola in northwestern Pakistan. A field experiment was conducted in 2007–2008 on a sulfur (S) and potassium (K) deficient clay loam soil under irrigation at the research farm of NWFP (Northwest Frontier Province) Agricultural University, Peshawar, Pakistan, with an objective to determine response of phenology and seed quality of Brassica oilseed rape versus mustard to S and K fertilizer application. Twenty treatments in a randomized complete block design were consisted of two oilseed genotypes [rape (B. napus canola) and mustard (B. juncea canola)], at three rates each of S (15, 30, and 45 kg S ha^?1) and K (30, 60, and 90 kg K ha^?1), plus control (no K and S applied). Days to flowering, pod formation, seed filling duration and maturity were enhanced with K and S fertilization compared to control plots. The species B. napus took more time to flowering, pod formation, seed filling duration and maturity compared to B. juncea. Both genotypes responded positively for seed quality (oil and protein content) to K and S fertilization, but the magnitude of response varied with level and combination of K and S fertilization. Delay in the phenological stages showed negative relationship with oil and protein content in seed of both genotypes. It is concluded that a combination of 60 kg K ha^?1 + 30 kg S ha^?1 would accelerate phenological development and improve seed quality of rape and mustard in the study area.     

SEED YIELD AND YIELD COMPONENTS RESPONSE OF RAPE (B. NAPUS) VERSUS MUSTARD (B. JUNCEA) TO SULFUR AND POTASSIUM FERTILIZER APPLICATION IN NORTHWEST PAKISTAN

Improper sulfur (S) and potassium (K) fertilizer management, particularly with continued soil nutrient mining, is one of the major factors contributing to low seed yield of canola in northwestern Pakistan. A field experiment was conducted in 2007?2008 on a S and K deficient clay loam soil at the Research Farm of NWFP (Northwest Frontier Province) Agricultural University, Peshawar, Pakistan, with an objective to determine seed yield and yield components response of Brassica oilseed rape versus mustard to S and K application. Twenty treatments in a randomized complete block design were consisted of two oilseed rape (B. napus canola) and mustard (B. juncea canola) genotypes at three rates each of S (15, 30, and 45 kg S ha^?1) and K (30, 60, and 90 kg K ha^?1) fertilizers plus one control (no S and K applied). Seed yield and yield components increased significantly with K and S fertilization as compared to the zero-S/zero-K control. Both genotypes responded positively for seed yield and yield components to K and S fertilization, but the magnitude of response varied with levels of S and K, as well as combined K + S applications. It is concluded that a combination of 60 kg K + 30 kg S ha^?1 would improve seed yield and yield components of rape and mustard in the study area and contribute significantly to increased production. Growing B. napus was better than B. juncea in the study area, because B. napus produced significantly higher seed yield and yield components than B. juncea, indicating that yield components are the most important criteria for selection of Brassica genotypes for higher seed yield.