樟疫多聚半乳糖醛酸酶Pcpg 1、Pcpg 2和Pcpg 4基因的克隆、测序及其遗传转化

研究优化了樟疫(Phytophthora cinnamomi)多聚半乳糖醛酸酶Pcpg1、Pcpg2和Pcpg4基因克隆的PCR条件，并对其进行了克隆、测序和遗传转化。克隆获得了3个基因，其大小均为1011bp；通过构建表达载体和遗传转化获得了3个基因的转基因菌系；3个基因均能指导合成相应的PG酶，其中转化Pcpg2基因的酵母菌(Saccharomyces cewvisiae)所分泌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)酶活性最强，Pcpg4和对照Anpg(Aspergillus niger polygalacturonase)1次之，而Pcpg1基因所指导合成的PG酶无活性。Western blotting表明，所克隆的3个基因所指导合成的PG酶均有不同程度的糖基化。     

草莓多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因（PGIP）的克隆及组织特异性表达

以草莓(Fragaria×ananassa)叶片为试材,采用PCR技术,克隆到1条多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因,命名为FaPGIP.基因组DNA片段包含一个长为168 bp的内含子;cDNA编码区全长999 bp,编码332个氨基酸残基.预测该蛋白质分子量为37.1 kD,等电点为7.67,N端24个氨基酸残基构成的疏水区域为信号肽,具有5个潜在的N-糖基化位点.序列同源比对结果表明,所克隆的FaPGIP基因与GenBank中登录的蔷薇科及其它物种PGIP基因具有较高的同源性.采用SyPred3D软件预测了该基因所编码的蛋白质的三维结构,表明FaPGIP蛋白质的三维模型类似马蹄的结构,含12段α-螺旋和21段β-折叠,中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成.半定量RT-PCR分析显示,FaPGIP在草莓根、茎、叶、花和果五种组织中均有表达,其表达量为果>叶>花>根>茎,相对表达量分别为0.246 0、0.166 4、1.371 2、0.872 1和3.415 4.     

小麦TaKu70和TaKu80基因的克隆和分析

Ku蛋白与动植物细胞DNA损伤修复和辐射敏感性有着密切联系,其功能及表达正常与否,关系到细胞DNA双链断裂（DSBs）的修复能力。为了研究Ku蛋白在小麦DNA损伤修复和对辐射敏感性中的作用,本实验室克隆了完整的小麦Ku70和Ku80 cDNA 序列,分别命名为TaKu70和TaKu80。小麦TaKu70和TaKu80分别编码626个和706个氨基酸残基的Ku70/Ku80蛋白序列。多重序列分析表明小麦Ku70蛋白与水稻和拟南芥Ku70蛋白的同源性分别为94%和78%;小麦Ku80蛋白与水稻和拟南芥Ku80蛋白的同源性分别为85%和69%。结构域和功能分析表明小麦Ku70/Ku80蛋白含有Ku蛋白的核心组分——Ku70/ Ku80-core结构域,以及只有真核生物Ku蛋白才有的vWA 结构域。     

小麦B类MADS-box基因WPI1和WPI2的克隆及表达分析

为探究小麦雌蕊化现象的分子遗传机制,本文从CSTP和HTS-1 2个小麦品系的幼穗中克隆得到了2个B类MADS-box基因WPI1和WPI2。WPI1基因c DNA序列长816 bp,ORF长627 bp,编码208个氨基酸残基;WPI2基因c DNA序列长983 bp,ORF长630 bp,编码209个氨基酸残基。WPI1和WPI2基因均含有典型的MADS-MEF2-like和K-box结构域,C端均具有PI结构基序。系统进化树分析表明WPI1和WPI2基因属于PI/GLO亚家族成员。Real-time PCR分析表明WPI1和WPI2基因在CSTP和HTS-1小穗中的表达模式明显不同。雌雄蕊原基形成期,WPI1和WPI2基因在HTS-1中的表达量较高,而在CSTP中表达量较低,接近为0;药隔期,WPI1和WPI2基因在HTS-1中的表达水平明显低于CSTP中的表达。WPI1和WPI2基因表达模式的改变与HTS-1雌蕊化表型有关。本研究结果为进一步探讨B类基因WPI1和WPI2在HTS-1雌蕊化中的作用奠定了基础。     

小麦品种陕253ω-醇溶蛋白基因的克隆及序列分析

为了获得优良品种陕253有关ω-醇溶蛋白基因的相关信息,根据已报道的ω-醇溶蛋白基因序列设计特异引物,采用PCR方法对小麦(Triticum aestivum L.)品种陕253总DNA进行扩增,回收1 000 bp左右的片段,经纯化、克隆并测序,获得5个不同的ω-醇溶蛋白新基因,命名为Gli-S253-1、Gli一S253-2、Gli-S253-3、Gli-S253-4和Gli-S253-5,GenBank登录号分别为:GQ423428、GQ423429、GQ423430、GQ423431和GQ423432.序列分析表明:(1)ω-醇溶蛋白基因沉默主要有4种类型(Q→*、I→*、R→*和W→*),并以第一种类型为主(占66.6%);(2)从三联体密码角度看,谷氨酰胺(Q)的两种编码方式最容易发生沉默突变(CAA→TAA和CAG→TAG);(3)从突变位点来看,沉默主要发生于三联体密码的第一位碱基(占77.8%),第二位碱基发生突变的频率占33.3%,但未见第三位沉默突变;GQ423428出现了罕见的ATA→TAA类沉默,同时涉及两个位点的变异;(4)就基因沉默突变的数目而言,GQ423428和GQ423429各高达6次,其中4个位点(349、373、478和592)为上述5条记录所共有;(5)从编码成熟蛋白的结构上看,沉默突变主要集中于ω-醇溶蛋白重复区,信号肽区及N-端区未发现此类变异;(6)进化分析表明,小麦族的ω-gliadin/secalin分成3支,其中小麦来源的ω-gliadin聚成一支.上述结果表明,本研究从陕253成功分离到5条存在丰富多样性的ω-醇溶蛋白编码基因,为深入研究优质的来源及分子辅助育种提供参考.     

甜叶菊葡糖基转移酶基因UGT76G2的克隆及生物信息学分析

本研究利用RT—PCR方法从甜叶菊（Stevia rebaudian）叶片中分离了与甜叶菊UGT76G1高度同源的UGT76G2基因，该基因编码一条分子量为52．029kD的由458个氨基酸残基组成的多肽，含有C-端所特有的高度保守的信号序列PSPG基序和N-端膜结合序列，属于植物中特有PSPG基序的UGT家族成员。半定量RT—PCR分析表明：UGT76G2在甜叶菊根、茎、叶、花不同组织中具有组织表达特异性，在叶组织中的表达丰度略高，在根中不表达而在茎中表达较低。推断的UGT76G2编码产物与其它参与植物次级代谢产物的糖基转移相关酶同源比对和系统发生分析表明该蛋白与康乃馨（Dianthus caryophyllus）DicGT4、棉花（Gossypium hirsutum）GhUGT1、甜叶菊（Stevia rebaudian）UGT76H1及玉米（Zea mays）BX8的一致性较高，分别为41％、35％、35％和32％。对UGT76G2和UGT76G1的次级结构和立体结构分析发现，苜蓿（Medicagosativ曲UGT71G1与二者的一致性皆为23％，它们有类似的次级结构。在C-端的PSPG信号区内具有10个相同的基质结合位点。但在UGT76G2和UGT76G1之间也有个别位置氨基酸存在差异。它们的N-端含有保守的组氨酸H25和天冬氨酸D124残基，可能与受体的结合有关。     

水稻OSNADK3基因的克隆及其遗传转化

从韩国浦项科技大学（Pohang University of Science and Technology,POSTECH）水稻T-DNA插入突变体库PFG_3A-04871.R株系中筛选到一个NADK3（NAD Kinase 3）激酶（LOC_Os05g32210）基因OSNADK3表达缺失的突变杂合体。与其野生型D...     

榨菜瘤状茎膨大相关基因orf451的克隆及其表达分析

为了更好地了解榨菜(Brassica juncea var.tumida)瘤状茎膨大的分子机制,以榨菜不同发育时期的瘤状茎为材料,分离到一个c DNA-AFLP差异片段,利用c DNA末端快速扩增(rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆了包含有该差异片段的基因的c DNA全长(命名为orf451,Gen Bank登录号:KM213220),并对其序列及编码的蛋白质进行分析。结果表明,orf451的c DNA全长1 512 bp,最大开放阅读框为1 356 bp,与编码多聚半乳糖醛酸酶/糖苷水解酶的基因有很高的相似性(90%),其编码的蛋白具备多聚半乳糖醛酸酶(果胶裂解酶)和糖苷水解酶的功能域。利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对orf451的时空表达进行分析,发现在榨菜瘤状茎形成初期orf451在表皮和外皮层表达量最高,推测orf451参与了榨菜瘤状茎膨大过程中表皮与外皮层多聚糖的水解。本研究为阐明瘤状茎生长发育调控机制提供理论依据。     

花生油体蛋白家族基因的克隆和表达分析

油体蛋白是一类覆盖在油体表面的碱性小分子蛋白.油体蛋白的存在对于维护油体的稳定性非常重要,油体蛋白也是种子作为生物反应器表达重组外源蛋白的重要载体.本研究通过构建花生(A rac his hypogaea L.)未成熟种子的全长cDNA文库,测序得到284条编码油体蛋白的EST.根据编码蛋白分子量的大小可将花生油体蛋白基因分为6个亚族:AhOLE O- 16.9、AhOLEO- 17.7、AhOLEO- 18.6、AhOLEO-22、AhOLEO- 18.4和AhOLEO- 14.3 (GenBank登录号分别为:EG372527、EG373122、EG373716、EG372719、EE125019和EE124234),其中AhOLEO- 16.9,AhOLEO- 17.7和AhOLEO- 14.3分别有2个成员,其它家族的各只有1个成员.本研究首次从花生中克隆了分子较大的AhOLEO-22.cDNA芯片和半定量PCR结果表明6个亚族的油体蛋白基因在花生的不同器官和在种子不同发育时期表达模式相似,在根、茎、叶、花中几乎检测不到油体蛋白基因的表达,在种子中表达量高,在果针入土15d内几乎检测不到油体蛋白基因的表达,随着种子发育成熟油体蛋白基因的表达量逐步提高.本研究为研究花生油体蛋白基因的家族构成和利用花生油体蛋白基因提高花生含油量、生产外源蛋白等提供了有用的信息.     

埃及伊蚊TMOF同源基因表达载体构建及烟草转化

胰蛋白酶调节抑制因子（Trypsin-modulating oostatic factor, TMOF）可以有效地抑制昆虫中肠胰蛋白酶的活性。本文为了研究埃及伊蚊TMOF同源物基因在转基因植物广谱抗虫中的作用,利用人工合成的Aea-TMOF同源物基因,以改造过的pCAMBIA1301质粒为基本载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动Aea-TMOF基因的植物表达载体pCAMBIA1301+ Aea-TMOF。然后,采用冻融法转入农杆菌LBA4404菌株,通过叶盘法对烟草进行了遗传转化。经PCR和GUS染色检测,Aea-TMOF同源物基因已整合到烟草基因组中。     

小麦RPL21基因同源克隆与表达分析

为了解60S核糖体蛋白L21(ribosomal protein L21,RPL21)的基因组结构和表达模式,以GenBank数据库中小麦RPL21基因的部分序列为信息探针,采用RT-PCR和PCR技术从小麦多子房株系幼穗中克隆了RPL21基因的cDNA与DNA片段,并对该基因在小麦多子房近等基因系间的表达差异和多子房...     

抗二氟沙星单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR技术,从抗二氟沙星单克隆抗体X1杂交瘤细胞株总RNA中扩增VH和VL基因片段,克隆入pUC18载体,测序进行（X1）可变区基因的克隆及序列分析。通过互联网检索发现VH和VL基因与Ig同源,分别符合小鼠IgVH和Igκ基因特征。VH基因全长363bp,编码121个氨基酸;VL基因全长为348bp,编码11...     

花生fw2.2基因的克隆及遗传转化

fw2.2基因是影响番茄果重的一个重要数量性状基因,在心皮的细胞分裂中起负调控作用。本研究以番茄fw2.2基因的序列为探针,从花生EST数据库中筛选同源序列。根据花生的EST拼接序列设计引物对花生进行扩增,目标产物测序后,将推测的氨基酸序列与其他植物fw2.2基因编码的氨基酸序列进行比对,同源性为34.78%～66.8...     

番茄EBF2基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化

为研究番茄EBF2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄果实cDNA中扩增了全长EBF2基因,将其与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合表达载体,在烟草原生质体中进行瞬时表达。结果表明,该基因定位于细胞核内。将该基因定向克隆到植物表达载体pCambia1301,构建成由组成型启动子CaMV35S启动的植物表达载体pCambia1301-EBF2,通过农杆菌介导方法转化MicroTom番茄。经PCR及GUS组织染色检测,外源基因已整合到番茄基因组中。     

农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究

采用携带GUS基因双元表达载体p1301-Pubi-Ecppc的根癌农杆菌菌株C58c1、LBA4404和EHA105对4个春小麦品种的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明,3M1.5为最佳诱导培养基;扬麦158和扬麦10是用于小麦遗传转化的良好基因型。对农杆菌转化条件进行进一步优化,得出用农杆菌C58c1侵染预培养15d的扬麦158幼胚愈伤组织,当侵染液浓度为OD6000.8、侵染40min、共培养3d时,可以提高农杆菌介导小麦遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。对所得到的具有hyg抗性的愈伤和抗性植株进行GUS基因化学组织检测和PCR分子鉴定,初步证明Ecppc基因已整合到小麦再生植株基因组中。本研究初步建立了农杆菌介导小麦的遗传转化体系。     

花生C4H和ANR基因的克隆与表达研究

通过构建花生未成熟种子cDNA文库,结合大规模EST测序,首次从花生中克隆了原花青素代谢途径上的2个关键酶［肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和花青素还原酶(ANR)］基因的全长编码序列。序列分析表明,与其他植物的C4H相比,花生C4H整个编码区高度保守,开放阅读框长度1518bp,编码蛋白长度505个氨基酸,预测的蛋白分子量为57.9kDa,等电点为9.04。花生中ANR开放阅读框长度966bp,编码蛋白长度321个氨基酸,预测的蛋白分子量为35kDa,等电点为8.31。亚细胞定位预测分析表明,C4H定位在线粒体中,ANR则定位在胞外。半定量RT-PCR结果表明,C4H在花生根、茎、叶、花、果针、种子中均有表达,但在茎、叶中表达相对较低,而原花青素合成途径中的关键酶ANR在各个组织中均有表达,其中在果针中表达最强。     

TaPIMP1过量表达提高转基因小麦纹枯病抗性的研究

小麦纹枯病是由禾谷丝核菌和立枯丝核菌引起的世界性土传真菌病害,培育并推广小麦纹枯病抗病品种是控制该病害最经济和最有效的途径.本研究采用基因枪法将由Ubiquitin启动子驱动的TaPIMP1基因导入常规小麦品种扬麦158、扬麦12号和Alondra,获得转TaPIMP1基因小麦阳性植株17株;对上述转基因小麦T1和T2...     

一例特异细胞质雄性不育小麦mtDNA特异片段的克隆和测序

以具有同质同核的二角型小麦花药外露不育系与花药不外露突变不育系为试材,对其mtDNA进行了RAPD分析,筛选出特异片段S32-1582、OPAA16-1753,并进行克隆与测序。结果表明:花药外露型不育系与花药不外露型不育系细胞质内mtDNA存在明显差异,而ctDNA之间不存在差异;二角型花药外露型不育系转化为花药不外露型不育系,很可能是由于mtDNA自发的重排引起的。其差异片段S32-1582、OPAA16-1753序列与核基因组上的序列具有同源性;供试线粒体基因组能够在较短的演化时间内发生变异,从而引起二角型花药外露型不育系向花药不外露型不育系的变异,其特异质核互作可能起重要作用。