致猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛单克隆抗体的研制及其初步应用

将致猪水肿病大肠杆菌 F18ab菌毛提纯 ,以其免疫 BAL B/ c小鼠 ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,经 3次融合 ,共筛选出 4株能稳定分泌针对 F18ab菌毛的特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株 4 G8、4 H11、4 A2和 3A12 ,腹水单抗的直接凝集价最高可达 1∶ 32 0 0。免疫印迹试验表明 ,4株腹水单抗均可特异识别 F18ab菌毛 Mr 15 0 0 0左右的主要亚单位多肽。应用所研制的单抗对 11株猪水肿病大肠杆菌分离株 F18ab菌毛表达情况进行了检测 ,结果显示 ,上述分离株中F18ab菌毛的出现率为 72 .7% (8/ 11) ,检出的 F18ab菌毛阳性分离株的 O血清型均为 O1 39。     

致猪水肿病大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种快速鉴定致猪水肿病大肠埃希菌的多重PCR检测方法.分别针对大肠埃希菌16S rDNA、志贺毒素Stx2e A亚基和菌毛F18ab A亚基保守序列设计合成3对特异性引物,优化多重PCR反应条件,并进行特异性和敏感性检测.结果显示,阳性对照菌株扩增产物大小分别为1 062、733和313 bp.特异性和灵敏性检测结果表明,与肠炎沙门菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌和猪链球菌等猪常见致病菌均无交叉反应;菌体直接扩增法最低检出量为1 875 CFU.利用建立的多重PCR检测方法对分离收集的128株大肠埃希菌进行鉴定,得到36株致猪水肿病大肠埃希菌,其中30株既有菌毛F18ab又产志贺毒素Stx2e,另外6株仅产志贺毒素Stx2e.结果表明,本试验所建立的多重PCR检测方法对致猪水肿病大肠埃希菌的快速诊断和流行病学调查具有一定的应用价值.     

海安县猪水肿病的流行病学与病原特性研究

对江苏省海安县2003年5月-2004年5月各乡镇猪水肿病的发病和死亡情况进行了流行病学调查,发现猪水肿病在该地区呈零星散发性发生,发病率为0.31%～1.84%,死亡率为0.07%～0.56%,病死率为16.0%～35.0%。水肿病主要侵害仔猪,育成猪也偶有发生,一般以气温比较高的季节多发。同时从疑似猪水肿病的病料中分离到12株大肠杆菌,经O血清型鉴定,5株为O139,2株为O45,O55、O93、O9、O101、O119各1株。经多重PCR检测毒素基因(STa、STb、LT、SLT-2e)和大肠杆菌粘附素单抗(F4、F5、F6、F41、F18)检测菌毛,共6个分离株带有SLT-2e基因,其中O139分离株5株,O55分离株1株,其余6株均带STb基因。12个分离株中,单独表达F18菌毛的4株(O1392株,O45、O119各1株),F5 F411株(O93),F41 F181株(O139),F5 F41 F182株(均为O139)。经药敏试验,多数分离菌株对壮观霉素和新霉素高度敏感。     

牛产肠毒素大肠杆菌毒力因子多重PCR检测方法的建立

通过多重PCR扩增产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigentic E.coli，ETEC）的毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa肠毒素的编码基因来检测和鉴定ETEC。试验中对影响PCR扩增的dNTP、Mg^2＋、引物浓度以及退火温度等因素进行优化，在优化条件的基础上，确定多重PCR的特异性和灵敏性，以此建立同时检测ETEC多个毒力因子的多重PCR方法。用该方法对分离于犊牛腹泻和犊牛肠毒血症的7株大肠杆菌进行检测，结果2株为F41、K99和STa阳性，4株为F41、STa阳性，1株为K99STa阳性。这与玻片凝集试验检测菌毛的结果一致。试验表明，该方法特异性强、敏感性高、简便、快速，适用于临床鉴定和检测牛ETEC菌株。     

致仔猪水肿病大肠杆菌快速检测方法的建立

将水肿病菌株S在TSB培养基中连续传代两次 ,离心后用生理盐水洗涤 ,制成1×108的细菌悬液。菌液倍比稀释 ,分别与适当浓度的F107菌毛单抗作玻板凝集、间接ELISA、斑点 -ELISA试验 ,结果表明 ,当单抗100×稀释时 ,三种方法的细菌最小检出量分别为2.5×107、6×105、1×103,斑点 -ELISA最敏感。从患水肿病的仔猪小肠黏膜上刮取黏液 ,溶于PBS中 ,将此溶液一部分稀释后在麦康凯平板上菌落计数 ,另一部分作为抗原做斑点 -ELISA。结果显示致病菌在小肠黏膜上大量存在 ,斑点 -ELISA能敏感、快速的检测出来。这一检测方法的建立 ,为其它大肠杆菌病的诊断提供了较好的借鉴。     

猪源产肠毒素大肠杆菌三重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种简单、快速、灵敏、准确的产肠毒素大肠杆菌(ETEC)检测方法,根据产肠毒素大肠杆菌菌毛(K88)和毒素(STa和LT)基因分别设计合成了1对引物,对K88、STa和LT基因扩增条件进行优化,建立了检测K88、STa和LT的三重PCR方法。该方法对K88、STa和LT基因的扩增产物分别为499 bp,190 bp和373 bp;此外,该方法具有良好的灵敏性和特异性。本实验建立的三重PCR方法为致幼畜腹泻ETEC的检测提供了快速准确方法。用所建立的三重PCR方法对实验室从临床腹泻样品中分离的120株大肠杆菌进行检测,结果 9株为K88/LT/STa阳性,14株为K88/LT阳性,21株K88/STa阳性,13株LT/STa阳性,8株K88阳性,2株LT阳性,12株STa阳性。     

大肠杆菌F18菌毛的研究进展

F18菌毛是致猪水肿病的产Vero细胞毒素大肠杆菌（VTEC）与某些产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的主要毒力因子之一，现已知，F18菌毛抗原有F18ab,F18ac两种血清型变异，F18ab即为F107，而18ac则包括近来才发现并命名的菌毛2134P及定居因子8813。现将有关F18菌毛的研究进展概述如下。     

致犊牛腹泻肠毒素大肠杆菌多重PCR检测方法的建立

肠毒素大肠杆菌((Ent erot oxi geni c E.col i,ETEC)是引起犊牛腹泻的主要病原之一。本试验建立了多重PCR检测ETEC毒力因子F41菌毛、K99菌毛和STa、LT肠毒素相关基因的技术方法。试验对影响PCR扩增的dNTP、引物浓度以及退火温度等因素进行优化,确定了多重PCR的特异性和灵敏性。结果表明:所建立的多重PCR方法快速、特异、灵敏,在2.5h-3h内就可以完成,为致犊牛腹泻肠毒素大肠杆菌的快速准确检测提供另一种选择。     

猪水肿病大肠杆菌主要毒力因子的B细胞表位预测与验证

猪水肿病是由产类志贺毒素大肠杆菌引起的仔猪的一种急性、致死性传染病,其发病率为10%～35%,致死率在90%以上.研究表明,致猪水肿病大肠杆菌主要产生F18ab菌毛和类志贺毒素II型变异体(SLT-IIe)两类毒力因子,F18菌毛中的FedF是发生粘附作用所必需的结构单位,同时高度保守;SLT-IIe的B亚基具有免疫原性,是水肿病毒素保护性抗原所在处,且其核苷酸序列的同源性达到了100%[1-3].本研究旨在对致猪水肿病的两种主要毒力因子FedF和SLT-IIeB进行生物信息学分析,预测其可能的B细胞表位,人工合成短肽,分别与抗F18ab菌毛蛋白和抗大肠杆菌水肿毒素的猪血清进行反应,鉴定短肽的反应原性:与载体蛋白(BSA)偶联后免疫小鼠,测定反应原性,以期获得既有反应原性又有免疫原性的多肽,为猪水肿病表位疫苗及多表位疫苗的研制奠定基础.     

大肠埃希菌PCR检测方法的建立及应用

本研究建立了一种快速诊断动物大肠杆菌病的PCR检测方法,与传统的细菌分离培养、生化鉴定方法相比较有效缩短了检测时间,提高了检测效率,同时为大肠杆菌病的快速诊断和流行病学调查提供了有效的技术手段。通过对大肠埃希菌ECs1048基因序列分析,利用Premier5.0软件设计并合成了1对特异性引物,建立了检测大肠埃希菌ECs1048基因的PCR检测方法。通过反复试验确定本方法的最佳退火温度为56℃。灵敏性试验和特异性试验表明本方法能够检测出的最低菌悬液浓度为1.5×10~2 CFU/mL,并具有较高的特异性。稳定性与重复性试验表明本方法具有良好的稳定性。利用本方法对临床样品的检测结果与生化试验鉴定结果的符合率为100%。本研究建立的检测方法灵敏性高、特异性强、稳定性好,可应用于动物大肠杆菌病的诊断。     

致仔猪水肿病大肠杆菌减毒株的毒力测定及其在仔猪肠道内增殖的分析

在已构建致仔猪水肿病大肠杆菌S451521菌株的2个毒素敲除菌株（F1、F2）基础上,进一步测定了其毒力及在仔猪肠道内的繁殖能力。选择30日龄的ICR小鼠并随机分成4组,A、B、C试验组分别灌胃接种不同浓度的野生菌株S451521及其毒素敲除菌株F1、F2,D组以灭菌生理盐水作阴性对照;结果表明减毒菌株F1和F2毒力均比野生菌株弱,其中F1株减弱了60.73%、F2株减弱了84.38%。选择24日龄未经仔猪水肿病疫苗免疫过的仔猪共14头,并随机分为2组;第1组口服接种减毒菌株F2,第2组以灭菌生理盐水作阴性对照,定期采集仔猪粪样并进行细菌监测;结果显示,仔猪排出减毒菌株F2的数量随时间不断增多,在接种后28d可达到每克粪样含目的菌约70 000cfu。这说明减毒菌株F2能够在仔猪体内定植并大量繁殖。     

禽源性大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法的建立与应用

为了解临床禽源致病性大肠杆菌中高致病性毒力岛(High pathogenicity island HPI)流行情况和基因特征,根据Gen Bank已知禽源irp2基因序列,设计、合成一对特异性引物,建立irp2基因PCR检测方法,优化、确定PCR扩增特性,进行敏感性、特异性、重复性检测评价。对256份临床分离禽源大肠杆菌进行irp2基因PCR检测和基因遗传变异分析。结果显示,建立的PCR检测方法敏感性可达2.14×10~(-4)ng/μL;特异性显示与鸡沙门菌、副鸡嗜血杆菌、鸭疫里默菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)核酸均无交叉反应;重复性显示3份阳性样品重复5次检测,变异系数3.4%~5.0%。256份临床样品PCR检测irp2基因,阳性率30.6%。获得了9株分离株irp2基因序列,分析显示,与GenBank已知基因同源性高达96.2%以上。说明建立的禽源大肠杆菌HPI毒力岛irp2基因PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床致病性大肠杆菌毒力岛基因快速检测。     

链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

根据NCBI上已收录的链球菌ef-tu基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门菌hut基因和大肠杆菌23SrRNA基因的序列,设计并合成4对特异性引物,通过优化多重PCR的反应条件,建立了能够同时检测4种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析结果表明,应用该方法可以从链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌以及4种细菌的混合物中扩增出4条大小分别为197、278、495和652bp的特异性条带,其他对照组的检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对4种病原菌基因组DNA的检出量分别为链球菌25.6pg、金黄色葡萄球菌33.2pg、沙门菌35.7pg、大肠杆菌52.1pg;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中特异地检测出4种病原菌。本试验建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效的检测链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌和大肠杆菌的混合感染。     

肉品中肠毒素性大肠杆菌和肠沙门菌多重PCR检测方法的建立

利用肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的LT-A、ST-1毒素基因和肠沙门菌的iroB基因设计3对引物,建立能同时检测ETEC和肠沙门菌的多重PCR方法。结果:多重PCR扩增出了预计的PCR产物,本方法的特异性为100%、灵敏度达10~10~2CFU/mL,用建立的多重PCR方法对30份临床可疑腹泻样品进行检测并与生化试验比较,结果两种方法检出大肠杆菌和沙门菌的阳性符合率达100%。     

牛新孢子虫内标双重荧光PCR检测方法的建立

为建立牛新孢子虫的快速准确检测方法,根据犬新孢子虫种属特异性基因Nc-5序列,设计高度保守的引物和荧光探针,通过引物设计和搭桥PCR法扩增,获得Nc-5荧光PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了牛新孢子虫内标双重荧光PCR检测体系。该方法具有较好的特异性;可以检测到10个拷贝/PCR反应的核酸分子,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当;通过对系列稀释的核酸样品的重复性检测,变异系数为0.50%～1.30%。通过对58份临床样品分别用该方法、不含内标的荧光PCR方法和普通PCR方法检测,结果显示,该方法与不含内标的荧光PCR方法的阳性检出率均为10.3%,比普通PCR方法阳性检出率（7.0%）高;表明该方法可用于临床样品中牛新孢子虫的快速检测,并能对实验室进行质量控制。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

为建立肠出血性大肠埃希菌O157:H7的多重PCR检测方法,针对O157菌特异性eaeA基因、fliC基因、志贺毒素基因(stx1和stx2)及rfbE基因设计5对引物,构建多重PCR反应体系,优化反应的引物浓度和温度检测其特异性和敏感性,并对牛、猪、鸡及犬等不同动物来源的样品进行了大肠埃希菌O157检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,敏感性达到5×10~3CFU。从检测阳性样本中均分离到目的菌。应用建立的方法在确定样品中是否含有大肠埃希菌O157的同时,还能对菌株毒力进行初步判定。成功建立了肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法,为该病原菌感染的预防和监测提供了简便、快速的技术手段,具有良好的应用前景。     

毛皮动物源大肠埃希菌毒力基因二重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速检测毛皮动物源大肠埃希菌耶尔森菌强毒力岛(HPI)中irp2、FyuA毒力基因的二重PCR方法,根据GenBank中irp2、FyuA基因的序列,设计并合成两对引物,扩增得到irp2、FyuA基因片段,大小分别为300bp和951bp。据此建立双重PCR方法,并将反应条件进行了优化。结果表明,用所建立的二重PCR方法可同时特异性扩增出大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因片段,对沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌均无特异性扩增。菌液最低检出量为2.8×105CFU/mL。在78份临床样品检测中,二重PCR检测结果与常规PCR检测结果一致。所建立的大肠埃希菌irp2、FyuA毒力基因二重PCR检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能够提高临床样品检测的效率。