“ 细菌型”pepc2基因反向表达载体构建及在莱茵衣藻中表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC, EC 4.1.1.31)在植物碳代谢中处于代谢纽的关键位置,是调节细胞蛋白质和脂肪酸含量的关键酶,通过抑制pepc基因的表达,可以提高细胞的含油率。通过克隆莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因的部分序列（简称Crpepc2）和莱茵衣藻融合启动子Hsp70A-RBCS2（简称HR）,将HR和Crpepc2片段插入pSP124s中,获得Crpepc2反向表达的莱茵衣藻高效表达载体pSP124s-HR-reve- Crpepc2。利用基因枪将pSP24s和pSP124s-HR-reve-Crpepc2分别转入莱茵衣藻cc-503藻株,得到空质粒型和反向型突变藻株。利用qPCR检测莱茵衣藻野生型、空质粒型和反向型藻株“细菌型”pepc2基因的相对表达量,结果表明空质粒的导入对莱茵衣藻pepc2基因的相对表达量影响很小,为野生型的92.95%;而反向型pepc2基因的导入明显降低了莱茵衣藻pepc2基因的相对表达量,仅为野生型的2.94%。该结果一方面说明我们建立了利用qPCR快速检测莱茵衣藻pepc2基因相对表达量的方法,另一方面也证明利用Crpepc2反向表达的方法（即“反向载体技术”）可以有效的抑制莱茵衣藻pepc2基因的表达,为进一步筛选稳定的含油量高的藻株奠定了良好的基础。     

“细菌型”pepc2基因反向表达载体构建及在莱茵衣藻中的表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC, EC 4.1.1.31)在植物碳代谢中处于代谢纽的关键位置,是调节细胞蛋白质和脂肪酸含量的关键酶,通过抑制pepc基因的表达,可以提高细胞的含油率。通过克隆莱茵衣藻“细菌型”pepc2/基因的部分序列（简称Crpepc2）和莱茵衣藻融合启动子Hsp70A RBCS2（简称HR）,将HR和Crpepc2片段插入pSP124s中,获得Crpepc2反向表达的莱茵衣藻高效表达载体pSP124s-HR-reve-Crpepc2-。利用基因枪将pSP24s和pSP124s-HR-reve-Crpepc2分别转入莱茵衣藻cc 503藻株,得到空质粒型和反向型突变藻株。利用qPCR检测莱茵衣藻野生型、空质粒型和反向型藻株“细菌型”pepc2/基因的相对表达量,结果表明空质粒的导入对莱茵衣藻pepc2/基因的相对表达量影响很小,为野生型的92.95%;而反向型pepc2/基因的导入明显降低了莱茵衣藻pepc2/基因的相对表达量,仅为野生型的2.94%。该结果一方面说明我们建立了利用qPCR快速检测莱茵衣藻pepc2/基因相对表达量的方法,另一方面也证明利用Crpepc2反向表达的方法（即“反向载体技术”）可以有效的抑制莱茵衣藻pepc2/基因的表达,为进一步筛选稳定的含油量高的藻株奠定了良好的基础。     

荒漠微藻XLD-9的分离、初步鉴定及其特性分析

[目的]从新疆的典型干旱荒漠生境中分离出具有一定生物学特性的微藻品系,进行鉴定及分析特性.[方法]扫描电镜和光学显微镜确定细胞形态,并用18S rDNA分子标记方法对此品系进行初步鉴定.XLD-9品系培养在BBM液体培养基上并在此培养条件下确定最佳pH条件,重金属(Cd2+、Ag+、Hg2+)和抗生素(素氯霉素、四环素、链霉素)抗性最佳浓度和生长最高耐受浓度.在BBM固体培养基上培养确定NaCl抗性最佳浓度和生长耐受浓度.[结果]据18S rDNA分析结果将XLD-9鉴定为Marvania geminata;其细胞近球形,个体较小;属嗜碱性微藻,pH 12.0的培养基中能正常生长.对重金属有一定的抗性,Cd2+的抗性达0.333 Mm.对氯霉素和四环素有很好的抗性,分别为41.7与60 μg/mL,但对链霉素敏感.对盐的抗性已到400 mM,超过了模式生物的莱茵衣藻CC-124突变株抗性范围(350 mM).[结论]从沙漠土壤中分离得到的微藻品系XLD-9,表现出对抗生素、NaCl显著的抗性,并能在pH 12.0的环境内生长,在抗盐基因的筛选及盐化土壤的治理方面有一定利用价值.     

氧化铁/水界面Cd吸附研究:CD-MUSIC模型模拟

以针铁矿和赤铁矿为研究对象,研究p H、Cd浓度等对不同类型氧化铁Cd吸附行为的影响,构建氧化铁Cd吸附的CD-MUSIC模型,并分析氧化铁表面Cd的形态分布特征。结果表明:氧化铁表面Cd吸附量和吸附密度均随p H升高、Cd浓度增大而增大。针铁矿对Cd的吸附量和吸附密度显著高于赤铁矿。CD-MUSIC模型能准确模拟Cd在氧化铁/水界面的吸附特征,拟合结果表明Cd主要以(Fe OH)2Cd+1、(Fe OH)2Cd OH0两种形态吸附在氧化铁表面,其在针铁矿和赤铁矿表面亲和常数(lg KCd)分别是7.3、12.8和6.1、11.0。Cd的形态分布受p H的影响显著,但几乎不受Cd浓度的影响。p H 5.0和7.0时,针铁矿的Cd形态分布与赤铁矿相似,(Fe OH)2Cd+1是主要吸附形态。p H 9.0时,针铁矿上超过80%的Cd以(Fe OH)2Cd OH0形态存在。赤铁矿上,Cd浓度较低时,(Fe OH)2Cd+1是主要吸附形态;随Cd浓度增大,(Fe OH)2Cd+1和(Fe OH)2Cd OH0所占比例均逐渐接近50%。     

胞外聚合物对莱茵衣藻砷富集和形态转化的影响

为探明胞外聚合物(EPS)对微藻砷的富集和迁移的作用效果,采用1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)对莱茵衣藻EPS进行提取,测定EPS含量及其主要成分,运用LIVE/DEAD BacLight staining–LSCM观察去除和未去除EPS的莱茵衣藻的生长情况,并对藻细胞进行AsV处理(20μg/L、处理6.0 h),比较有(无)EPS的莱茵衣藻对砷的吸收、吸附和转化的差异。结果表明:莱茵衣藻EPS总量为16.12 mg/g,其主要成分为多糖(89.96%),并含有少量的蛋白质(7.41%)和DNA(2.63%),EDTA提取EPS后没有细胞自溶现象产生,不影响微藻的生长;去除EPS后的莱茵衣藻对AsV的还原能力显著降低,且在6.0h内对砷的吸收没有明显变化,但砷吸附量占富集的比例(43.03%～66.23%)显著高于有EPS的砷吸附占比(10.68%～31.90%),表明EPS在莱茵衣藻对砷的富集和形态转化中具有重要作用。     

镉胁迫下NO对胡杨细胞Cd2+吸收调控机制的研究

本文研究了NO对胡杨愈伤细胞Cd2+耐受性的影响。结果表明:Cd2+(50 μmol/L)显著抑制了胡杨细胞的生长,而硝普钠SNP(NO供体,25 μmol/L)能明显缓解Cd2+对胡杨细胞生长的抑制作用,并减轻镉对细胞膜的伤害以及镉胁迫导致的细胞活力下降。利用非损伤微测技术等研究了NO对Cd2+动态吸收的影响。CdCl2(50 μmol/L)处理之后,胡杨细胞表现出Cd2+内流,而SNP(25 μmol/L,6 h)显著抑制了Cd2+的内流,并降低了Cd2+在细胞内的积累。研究发现,NO是通过调控钙离子通道来抑制胡杨细胞对Cd2+的吸收。镉胁迫下Cd2+内流被钙离子通道专一性抑制剂氯化镧明显抑制,表明Cd2+是通过钙离子通道转运进入细胞。并且发现,NO是通过促进Ca2+的内流来竞争性地抑制胡杨细胞对Cd2+的吸收,从而缓解了镉胁迫对胡杨细胞造成的生长抑制。      

外源钙对盐胁迫下盐地碱蓬生长影响的初步探讨

以不同浓度的Ca2+(0、20 mmol/L)及不同浓度的NaCl(0、100、400 mmol/L)处理盐地碱蓬(Suaeda salsa)幼苗,探索盐渍条件下Ca2+对该植物在生理和分子水平上的影响。结果表明,外源Ca2+处理使盐地碱蓬幼苗鲜质量明显高于对照,Ca2+、K+浓度也高于对照;叶片液泡膜Ca2+-AT-Pase活性升高。Ca2+/H+逆向转运体(Ca2+/H+antiporter)基因的表达量不仅随外源Ca2+处理而升高,而且NaCl处理后也明显升高。以上结果说明,盐对盐地碱蓬生长的促进是依赖Ca2+的,维持盐胁迫下胞质Ca2+浓度稳态的运输体主要是液泡膜Ca2+/H+逆向转运体。     

单壁碳纳米管对莱茵衣藻光合产氢的影响

[目的]研究单链DNA包裹前、后的单壁碳纳米管(SWCNT)对莱茵衣藻光合作用和光合产氢的影响,为利用藻类高效产氢提供新思路。[方法]对单壁碳纳米管进行单链DNA修饰,利用光谱学等方法表征其理化性质。将单链DNA包裹前、后的单壁碳纳米管引入莱茵衣藻培养体系共孵育,观察单壁碳纳米管在衣藻细胞中的分布及其对衣藻光合作用和光合产氢的影响。[结果]单链DNA修饰可以增加单壁碳纳米管在溶液中的稳定性,减少纳米管团聚引起的衣藻细胞聚集。单链DNA包裹前、后的单壁碳纳米管对莱茵衣藻生长仅有轻微抑制。在缺硫条件下,与对照相比,2种形态单壁碳纳米管(ss DNA/SWCNT、SWCNT)均造成衣藻PSⅡ活性下降,呼吸速率显著高于光合速率,从而诱导衣藻细胞更快进入缺氧状态。2种形态单壁碳纳米管均可促进莱茵衣藻光合产氢,但未经包裹的单壁碳纳米管效果更加明显,可提高产氢量5倍以上。[结论]单链DNA包裹可提高单壁碳纳米管在溶液中的稳定性和分散性。单壁碳纳米管可通过影响PSⅡ活性和增强呼吸代谢的方式促进莱茵衣藻光合产氢。     

Cd、Pb对银杏根系离子微域分布影响研究

为阐明重金属在银杏(Ginkgo biloba L.)根尖微区中的富积特性及对其它选择性吸收离子的作用机理,采用X线电子探针技术研究Cd、Pb对银杏根系中离子微域分布的影响。结果表明,Cd、Pb处理后在表皮、皮层、韧皮部和木质部细胞中均可发现Cd2+、Pb2+的积累。Cd、Pb胁迫显著地影响了根系微区的离子分布,使细胞中大多离子的稳态受到破坏,是Cd、Pb对植物产生毒害的机制之一。同时Ca2+和K+在根系微区不同组织中均呈现出较强的峰,Ca2+和K+稳态的维持显示银杏对Cd、Pb胁迫可能具有较强的耐性机制。     

不同冷敏感型甘蔗茎尖Ca2+和Ca2+-ATP酶活性对低温的响应

为了探明不同冷敏感型甘蔗品种茎尖Ca2+和Ca2+-ATP酶活性对低温胁迫的响应机制,本研究利用植物组织化学技术结合电子显微镜观察了2个不同冷敏感型甘蔗品种茎尖在低温胁迫前后Ca2+和Ca2+-ATP酶的变化规律.供试品种为桂糖28号(抗冷型)和园林6号(冷敏感型),在0℃条件下,分别处理0、2、4和6 d后切取茎尖进行组织化学定位,获得如下结果:1)低温胁迫前后桂糖28号形态和细胞结构变化不明显,但园林6号发生质壁分离现象,线粒体空泡化,细胞崩溃,组织水溃状明显;2)低温胁迫开始,2个甘蔗品种细胞质和细胞核Ca2+沉淀颗粒均增多,但随着低温胁迫时间的延长桂糖28号细胞质和细胞核Ca2+沉淀颗粒减少,并维持在一个低稳态水平,而园林6号细胞质和细胞核一直维持在高Ca2+浓度水平;3)低温对桂糖28号Ca2+-ATP酶活性与分布影响不大,其活性一直维持在较高水平,而园林6号Ca2+-ATP酶活性随着低温胁迫时间的延长而变弱.结果说明,低温条件下细胞质和细胞核Ca2+浓度增高是导致甘蔗茎尖细胞受伤害的重要原因,维持较高Ca2+-ATP酶活性有助于避免Ca2+-中毒.     

外生菌根真菌Paxillus involutus吸收Cd2+及H2O2对Cd2+内流的调控作用

目的本文研究了外生菌根真菌Paxillus involutus对Cd2+的吸收作用以及H₂O₂对Cd2+内流的调控作用。方法以Paxillus involutus的2种菌株MAJ和NAU为研究材料,利用50 μmol/L CdCl₂对材料进行24 h处理,应用非损伤微测技术测定菌丝的Cd2+和Ca2+离子流。结果结果显示,Cd2+处理后,MAJ和NAU菌丝的Cd2+内流增强,同时也显著促进了Ca2+的内流。Ca2+通道抑制剂(Verapamil、GdCl₃、TEA)处理后,Cd2+和Ca2+内流强度均明显减弱,表明Cd2+是通过钙通透性离子通道(CaPCs)进入菌丝细胞的。Cd2+处理促进了Cd2+和Ca2+的内流,很可能是Cd2+激活了菌丝质膜的CaPCs。Ca2+和Cd2+的竞争性实验结果显示,高浓度的Ca2+抑制菌株MAJ和NAU的Cd2+内流;反过来,测试液中Cd2+浓度的提高也明显降低了Ca2+的内流强度,这证明Ca2+和Cd2+是竞争性地通过CaPCs进入菌丝细胞的。此外还发现,H₂O₂(1.0 mmol/L)能增强菌丝的Cd2+和Ca2+内流,而ROS清除剂DMTU却显著抑制了菌株对Ca2+和Cd2+的吸收,表明H₂O₂在调控菌丝细胞CaPCs介导Cd2+内流的过程中具有重要作用。结论 综上,外生菌根真菌Paxillus involutus对Cd2+具有富集作用并且可以通过H₂O₂激活CaPCs促进Cd2+内流。      

硒对镉胁迫下白术抗氧化能力的影响

[目的]探讨硒对镉胁迫下白术抗氧化能力的影响,为白术种植中重金属污染防治提供参考.[方法]采用室内水培试验,利用1/2 Hoagland＇s营养液培养白术幼苗30 d后,按营养液中单独加入4 mmol/L镉及不同浓度的硒（Na2SeO3）（10、20、40、60、80和100 μmol/L）分别与4 mmol/L镉混合设7个处理,另设不添加镉和硒的营养液处理为对照,48 h后取各处理的白术叶片进行相关生理指标测定.[结果]镉胁迫导致白术的H2O2和丙二醛水平显著升高,而超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化酶（CAT）酶活性下降.在镉胁迫下,添加不同浓度的硒后,白术抗氧化系统出现不同的反应.当加入相对较低浓度（10～60 μmol/L）的硒对,SOD和CAT酶活性显著增加,而H2O2和丙二醛水平显著下降,表明镉胁迫造成的过氧化伤害有所减轻;而加入相对较高浓度（80～100 μmol/L）的硒对,SOD和CAT酶活性下降,H2O2和丙二醛水平上升,表明镉胁迫造成的过氧化伤害没有缓解.[结论]较低浓度的硒处理有利于增强镉胁迫下白术幼苗抗氧化能力.     

胞外ATP、H2O2、Ca2+与NO调控木榄根系离子平衡机理研究

运用非损伤微测技术(NMT),研究了短期盐胁迫下胞外ATP(eATP)、H2 O2 、Ca2 + 与NO 对非泌盐红树木榄根 系K+/Na+ 平衡的调控作用。NaCl(100 mmol/L,24 h)与等渗甘露醇处理的实验表明,木榄根尖对盐胁迫的响应具 有高度的离子特异性。盐胁迫增强了木榄根尖的Na+ 外流,但Na+ 外流被Na+ /H+ 逆向转运蛋白抑制剂Amiloride 和质膜H+ -ATPase 抑制剂Vanadate 抑制,表明Na+ 外流源于根尖表皮细胞质膜Na+ /H+ 逆向转运系统驱动的Na+ 外排。短期盐胁迫处理能诱导木榄根尖K+ 外流,但被氯化四乙胺(TEA,外向K+ 通道抑制剂)明显抑制,证明K+ 外流是由激活的去极化外向型离子通道KORCs 介导。胞外ATP(300 mol/L)、H2 O2 (10 mmol/L)、Ca2 + (10 mmol/ L)与SNP(NO 供体,100 mol/L)均能增加短期盐胁迫下的Na+ 外流,同时抑制K+ 外流。其中,促进Na+ 外流效果 较强的是H2 O2 和Ca2 + ,而Ca2 + 和NO 抑制K+ 外流的效果突出。这些实验结果表明,胞外ATP、H2 O2 、Ca2 + 与NO 这4 种盐胁迫信使是通过上调木榄根系细胞质膜Na+ /H+ 逆向转运体系(Na+ /H+ 逆向转运体和H+ 泵)活性,在促 进Na+ 和H+ 逆向跨膜转运的同时,抑制去极化激活的K+ 离子通道来减少盐诱导的K+ 外流。      

Cd胁迫下绿豆幼苗根部对K·Ca·Mg含量的影响

[目的]研究Cd胁迫下绿豆(Phaseolus raditus L.)幼苗根部矿质元素的代谢。[方法]用1μmol/L Cd2+模拟Cd污染,通过火焰原子吸收分光光度仪(FAAS)对矿质营养元素K、Ca、Mg含量进行测定。[结果]Cd胁迫下,根中的Mg含量降低,K含量先升高后降低,Ca含量却有所升高。[结论]Cd间接影响植物的生长发育。     

微波消解-石墨炉原子吸收光谱法测定川牛膝中铅和镉

[目的]建立微波消解-石墨炉原子吸收光谱法测定凉山川牛膝中铅和镉元素含量的方法。[方法]用浓硝酸微波消解样品,选用10μl浓度2 g/LMg（NO3）2＋2 g/L NH4H2PO4和10μl浓度2 g/L NH4H2PO4作为基体改进剂,采用标准曲线法测定。[结果]采用微波消解-石墨炉原子吸收光谱法测定川牛膝中铅和镉含量RSD为4.5%~5.2%,回收率为95%~105%。经测定,凉山川牛膝牛含有铅5.24μg/g,镉1.29μg/g。[结论]采用微波消解-石墨炉原子吸收光谱法测定川牛膝中铅和镉含量方法简单、准确,结果令人满意。     

NaCl对泌盐红树和非泌盐红树Cd吸收和积累的影响

为研究NaCl对红树植物Cd吸收和转运的影响,本文以非泌盐红树秋茄和泌盐红树桐花树幼苗为实验材料,研究了不同浓度NaCl和CdCl2处理下地上和地下各器官中Na+、Ca2+、Cd2+离子浓度的变化,并利用非损伤微测技术测定植物根尖在不同处理下对Cd2+和Ca2+的动态吸收。结果表明,随着CdCl2处理浓度的增加,2种红树的根、胚轴、茎和叶4器官中的Cd2+含量均明显增加。而泌盐红树桐花树各器官中Cd2+含量均高于非泌盐红树秋茄,分别达到65%(根)、19%(胚轴)、203%(茎)和96%(叶)。利用非损伤微测技术测定Cd2+流,发现Cd2+内流能被Ca2+通道抑制剂LaCl3抑制,表明Cd2+主要通过Ca2+通道实现内流。在NaCl对Cd2+吸收的影响方面,低浓度NaCl(100~200 mmol/L)能促进秋茄对Cd2+的积累,但高浓度NaCl(400 mmol/L)抑制了桐花树和秋茄对Cd2+的吸收。这是由于:1)红树根系对Na+吸收增加,而Na+能与Cd2+竞争膜上转运蛋白上的金属离子结合位点从而减少Cd2+的吸收,2)NaCl促进了植物根尖对Ca2+的吸收,从而竞争性的抑制了Cd2+通过Ca2+通道的内流,最终减少了2种红树根系对Cd2+的吸收和积累。泌盐红树桐花树Cd2+含量高于非泌盐红树秋茄,表明桐花树根细胞质膜上的转运蛋白与Ca2+通道对Cd2+的吸收能力高于秋茄。      

外源NO对棉花幼苗重度镉胁迫的缓解效应

为探讨外源一氧化氮(NO)对棉花幼苗重度镉(Cd)胁迫的缓解效应,以农大棉601号为试验材料,采用水培方法,研究了不同浓度(50、100、200μmol/L)硝普钠(SNP,NO供体)对重度Cd胁迫(75μmol/L)下棉花幼苗生长的影响。结果表明,Cd处理下棉苗株高、叶面积较CK(不添加CdCl_2和SNP)显著下降40.9%、31.9%,干物质积累量、组织含水量仅为CK的34.3%、33.2%,光合速率显著下降。重度Cd胁迫下添加低浓度外源NO(50、100μmol/L),棉花幼苗株高、叶面积较T0处理(75μmol/L CdCl_2)稍有增加(P0.05),叶绿素含量比T0处理(75μmol/L CdCl_2)分别增加4.5%、15.5%(P0.05),光合速率分别增加36.6%、27.9%(P0.05),其他指标均无显著增加;而添加高浓度NO(200μmol/L)下棉苗干物质积累量、根冠比、组织含水量、叶绿素含量均低于T0处理。因此认为,外源NO对重度Cd胁迫下棉苗生长的缓解效果不显著。     

腐殖酸钠对镉胁迫下冬小麦种子萌发及根系生长的影响

[目的]研究腐殖酸钠(HA-Na)对镉胁迫下冬小麦种子萌发及根系生长的影响。[方法]以鲁麦22号为试验材料,研究不同浓度Cd~(2+)溶液处理对冬小麦种子萌发和根系生长的影响,以及不同浓度HA-Na溶液对Cd~(2+)胁迫下冬小麦种子萌发和根系生长的影响。[结果]Cd~(2+)胁迫使冬小麦种子萌发和根系生长均受到抑制,发芽率、发芽指数、活力指数、幼苗根长及芽长均降低。低浓度的HA-Na提高了Cd~(2+)胁迫下冬小麦种子发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数以及幼苗根长、芽长,部分缓解了Cd~(2+)胁迫对冬小麦种子萌发和幼苗生长的抑制作用。其中以50μmol/L HA-Na溶液处理的缓解效果最好,但随着HA-Na浓度的增大,其对Cd~(2+)胁迫的缓解效应逐渐减弱,当HA-Na浓度达200μmol/L时,会明显加剧Cd~(2+)胁迫的毒害作用。[结论]该研究为被重金属污染的农田土壤治理和改良提供了理论依据。