大熊猫IL-4基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR技术从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫IL-4基因,并将其克隆到PGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定及序列分析,结果表明,克隆得到的IL-4基因开放阅读框由396个核苷酸组成,编码一个由132个氨基酸组成的多肽,包括编码24个氨基酸的信号肽和108个氨基酸的成熟肽。与GenBank中已登录的大熊猫IL-4（DQ166512）的核苷酸序列同源性分别为99.5%和100%;与其他哺乳动物如犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的IL-4核苷酸同源性为50.7%（鼠）～87.7%（犬）;IL-4编码氨基酸同源性在35.7%（鼠）～78.8%（犬）;进化树构建结果表明,大熊猫与犬、猫遗传距离最近。     

猪伪狂犬病病毒受体nectin-2基因的克隆与分子特征

为了进一步了解猪nectin-2基因的结构与功能,本研究采用生物信息学结合RT-PCR的方法从猪脑组织中克隆到了猪nectin-2基因,并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比较分析。猪nectin-2基因的编码区含有1440个核苷酸,编码479个氨基酸,其中信号肽由32个氨基酸组成,胞外域由330个氨基酸组成,含有2个潜在的N-糖基化位点和6个半胱氨酸残基,跨膜区由23个氨基酸组成,胞浆区由94个氨基酸组成,猪nectin-2基因与犬、马、家鼠、人、恒河猴、牛、黑猩猩的nectin-2基因核苷酸序列同源性分别为85.4%、85.7%、78.6%、82.1%、82.1%、81.9%和82.1%;推导氨基酸序列的同源性分别为84.5%、83.0%、74.7%、75.7%、76.4%、78.4%和75.5%。本试验为进一步深入研究猪伪狂犬病病毒与宿主之间的关系奠定了基础。     

广西巴马小型猪IL-4和IL-10基因的克隆和序列分析

为研究猪白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素10（IL-10）在机体免疫应答中的作用,从ConA刺激的巴马小型猪的外周血淋巴细胞提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出IL-4和IL-10基因,将其分别克隆到PMD18-T 载体上,进行序列分析.结果表明,克隆的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列与GenBank上登录的其它猪种的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%～100%、97.0%～99.3%和99.2%、97.7%.     

荣昌猪白细胞介素-6基因的克隆与序列分析

根据GenBank收录的猪白细胞介素-6(PIL-6)设计1对特异性引物,经刀豆蛋白素A(ConA)诱导猪淋巴细胞并提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出荣昌猪IL-6的cDNA。将扩增基因连接到PMD18-T质粒上,经酶切鉴定和序列测定证明该序列是PIL-6。序列分析结果表明:该基因cDNA全长741 bp,开放阅读框由639个核苷酸组成,推测产生的编码产物由212个氨基酸组成。核酸序列分析比对发现:荣昌猪IL-6与GenBank已发表的IL-6序列的同源性较高,为99.8%~100%,氨基酸的同源性为99.5%~100%。对荣昌猪IL-6基因氨基酸的亲水性和蛋白表面可能性进行分析,表明其与IL-6基因氨基酸序列性质一致。     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662 bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

植物乳杆菌α-半乳糖苷酶基因（melA）的克隆与序列分析

试验以L.plantarum1.557的基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增α-半乳糖苷酶基因（melA）基因,PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行SacⅠ和Sph Ⅰ酶切及PCR扩增鉴定,并对melA基因片段进行序列测定。结果表明,测得的melA基因序列全长2240 bp,含有酶切位点、启动子、SD序列及编码738个氨基酸的开放阅读框,理论分子质量为84 ku;4种核苷酸中GC含量为47.45%、AT含量为52.55%;序列中有3个碱基发生了变化,均为无义突变,未导致其推导的氨基酸的改变;序列测定结果与GenBank中登录的序列进行比较,核苷酸和氨基酸序列的同源性除与AY873840相比分别为96.6%和92.2%外,其余均大于99%。试验成功克隆了melA基因,为进一步构建重组表达载体奠定了基础。     

猪脑心肌炎病毒GXLC株的分离及其3D基因分子特征的分析

采集临床疑似脑心肌炎死亡仔猪的组织作为接种材料,接种于BHK-21细胞系,观察细胞病变（CPE）,并用RT-PCR和间接荧光抗体试验（IFA）进行鉴定,证实分离到1株脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）,命名为GXLC株。应用RT-PCR方法扩增GXLC株的3D基因,扩增产物克隆入pMD18-T载体后进行测序,对获得的3D基因序列进行分析。序列分析结果表明,GXLC株3D基因全长1380 nt,编码460个氨基酸,含有7个抗原表位。同源性分析结果表明,GXLC株与国内外其它EMCV分离株3D基因核苷酸序列的同源性在84.7%～99.7%之间,氨基酸序列的同源性在96.1%～99.6%之间。遗传进化分析结果表明,基于3D基因核苷酸序列绘制的系统进化树可将所有EMCV分离株分成2个群：Ⅰ群和Ⅱ群,Ⅰ群可再细分为Ⅰa亚群和Ⅰb亚群,其中猪源EMCV在Ⅰ群和Ⅱ群中均有分布,而鼠源EMCV分布在Ⅰ群,人源EMCV分布在Ⅱ群;GXLC株与其它中国分离株均属于Ⅰa亚群。     

水貂白细胞介素-4基因的克隆、序列分析与原核表达

为了获得高纯度的白细胞介素-4（IL-4）蛋白,对分离得到的水貂外周血淋巴细胞经植物血凝素（PHA）诱导后,提取淋巴细胞总RNA,根据GenBank中登录的雪貂IL-4基因序列,设计并合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得了水貂IL-4基因序列全长399 bp,编码132个氨基酸,与雪貂氨基酸序列同源性高达99.2%,与熊猫、犬同源性均为90.0%。将编码成熟蛋白基因构建到原核表达载体pProEX-HTb,IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting结果显示,IL-4表达产物为15 ku的包涵体蛋白。通过His-Trap HP亲和层析预装柱变性、复性洗脱可获得高纯度的重组IL-4蛋白。本试验为水貂IL-4基因的进一步研究奠定了基础。     

鸡IL-2基因的克隆及GST-chIL2融合蛋白的表达

根据Sundick等发表的鸡IL-2基因(chIL2)序列设计合成特异性引物,用RT-PCR从ConA诱导的鸡脾淋巴细胞扩增出450 bp的目的片段,酶切鉴定及序列测定结果表明为鸡IL-2基因。该基因包括鸡IL-2基因的全部开放阅读框,编码142个氨基酸组成的蛋白质,与GenBank鸡IL-2基因相比,在编码氨基酸的49位有一个氨基酸缺失;而与Broiler、SC、Chenren和Xiaoshan鸡在编码氨基酸上完全一致,具有较近的亲缘关系;与Kestrel来航鸡、来航SPF鸡、Obese、Silky和Xianju鸡等有1-4个氨基酸的差异;与火鸡和鹌鹑的氨基酸同源性分别为69.9%和59.4%。将克隆到的基因插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-6p-1中,得到重组表达质粒pGEX-IL2。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,表达出了大小约为40 ku的GST-chIL2融合蛋白,其中GST部分为26 ku,鸡IL-2为14 ku,与预期的鸡IL-2成熟蛋白大小一致。     

猪白细胞介素-4基因的克隆与表达

利用RT-PCR技术,从被刺激诱导的PBMC中克隆IL-4基因,序列分析表明:克隆的猪IL-4基因序列与GenBank上登录的IL-4基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99%和97.8%.然后用表达型引物从T载体上扩增IL-4基因,双酶切PCR产物后与表达载体pGEX连接,构建重组表达质粒pGEX-IL-4,用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出38 ku融合蛋白,占菌体总蛋白的30%以上,并且以包涵体的形式存在,这为猪重组IL-4规模化生产和疫苗佐剂的研制奠定了基础.     

布莱凯特牛心脏脂肪酸结合蛋白基因的序列测定及分析

根据GenBank发表的牦牛心脏脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid-binding protein,H-FABP)基因的序列设计13对引物,分13段扩增出布莱凯特牛H-FABP基因,采用PCR产物直接测序的方式对各个片段进行测序,使用生物信息学软件对各个片段的测序结果进行拼接,得到布莱凯特牛H-FABP基因的全序列,并对其进行序列分析。结果表明,布莱凯特牛的H-FABP基因(GenBank登录号:FJ756345)是由4个外显子(73、173、102和54 bp)和3个内含子(3463、1892和1494 bp)组成;布莱凯特牛与牦牛、普通牛、山羊、猪、马、人、大鼠、小鼠和鸡等9个物种之间的核苷酸同源性大小依次为99.3%、99.0%、96.3%、92.5%、89.8%、88.3%、83.3%、82.8%、75.6%,其氨基酸的同源性为99.2%、99.2%、96.2%、93.2%、91.7%、88.7%、86.5%、86.5%、77.4%;系统发生树将这些物种总体上分成2支,鸡为独立的一支,布莱凯特牛、牦牛、普通牛、山羊、猪、马、人、大鼠、小鼠为另一独立的大分支。因此,渤海黑牛H-FABP基因具有很强的保守性,其进化树符合物种进化规律。     

抗蓖麻毒素单链抗体基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

为构建和表达抗RT单链抗体(ScFv)蛋白,用RT-PCR方法从能分泌特异性抗RT单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞中分离纯化抗体VH和VL基因。用重叠延伸PCR方法将VH和VL拼接在一起,构建抗RT-ScFv基因。将ScFv基因连接到pMAL-p2X表达载体,转化TB1表达菌。阳性克隆用IPTG诱导18h,Western blotting鉴定重组蛋白。结果表明,试验成功扩增出了ScFv基因,长度约为750bp。通过DNA序列测定和分析,构建出VL-(Gly4Ser)3-VH。其VH全长363bp,可编码121个氨基酸,VL全长324bp,可编码108个氨基酸。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,抗RT-ScFv在TB1表达菌中获得高效表达,pMAL-p2X表达的ScFv加上同时融合表达的MBP标签分子质量约为75ku。本试验成功构建了pMAL-RT-ScFv表达载体,并获得了高效表达。     

Bovine reaginic antibody III. Cross-reaction of antihuman IgE and antibovine reaginic immunoglobulin antisera with sera from several species of mammals.

Using antisera specific for the heavy chain of human IgE and bovine reaginic immunoglobulin, the degree of cross-reaction amongst sera from pig, rat, rabbit, guinea pig, goat, cow, horse, dog, cat and human was tested. Antihuman IgE antiserum gave strong reactions with pig, rabbit, cow, goat and human sera (100% to 15.1%) and weak reactions with rat, guinea pig, horse, dog and cat sera (10.1% to 3.22%). Antibovine reagin antiserum produced a considerable amount of cross-reaction with sera from pig, rat, rabbit, goat, horse and human (43.6% to 20.1%) with limited reactions with guinea pig, dog and cat sera (13.9% to 9.3%).     

Reactivity of eleven anti-human leucocyte monoclonal antibodies with lymphocytes from several domestic animals

Nine commercially available monoclonal antibodies and two monoclonal antibodies from The American Type Culture Collection, raised against various human leucocyte surface antigens, were tested on lymphocytes from cow, sheep, goat, swine, horse, cat, dog, mink, and rabbit as well as man. Four antibodies bound to lymphocytes from some of the animals. These were the antibodies against CD8 and CD4 antigen, the antibody to C3b-receptor, and the antibody to the HLA-DR antigen. The CD8 antigen-reactive antibody reacted with lymphocytes from mink, cat, dog, and sheep, while the CD4 antigen-reactive antibody reacted with lymphocytes from mink. The anti-C3b-R antibody reacted with lymphocytes from horse, swine, dog, and cat, and the anti-HLA-DR reacted with lymphocytes from cow, goat, sheep, horse, dog, cat, and mink.     

牦牛Hepcidin 基因的克隆与序列分析

根据GenBank中公布的普通牛Hepcidin基因序列(登录号为XM-589792.3)设计1对特异性引物。采用RT-PCR技术从牦牛肝脏组织总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列并进行测序分析,同时构建Hepcidin蛋白物种进化树。结果显示,经克隆获得牦牛Hepcidin基因322 bp的cDNA序列（GenBank登录号为EU863791）,含289 bp的开放阅读框,编码82个氨基酸,包括22个氨基酸的信号肽;预测Hepcidin蛋白分子质量和等电点分别为8.88 ku 和 9.24;与已知普通牛Hepcidin序列的同源性达 99%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律。本研究为Hepcidin基因cDNA 全长克隆及基因功能研究奠定了重要基础。     

牛乳铁蛋白肽基因LfcinB的合成及真核表达载体的构建

根据APD抗菌肽数据库报道的牛乳铁蛋白肽LfcinB氨基酸序列,合成编码LfcinB基因的2条互补的寡核苷酸链,退火后在5′端和3′端分别形成含有BamH I和Xho I位点粘性末端的双链DNA。真核表达载体pcDNA3.1（+）经BamH I 和Xho I限制性内切酶双酶切处理后与合成的LfcinB基因进行连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,提取质粒DNA进行测序。测序结果显示,牛乳铁蛋白肽LfcinB基因成功克隆到pcDNA3.1（+）真核表达载体中,为进一步表达和抗菌活性研究奠定物质基础。     

Molecular cloning and expression of bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) interleukin-8

The bottlenose dolphin interleukin (IL)-8 cDNA was molecularly cloned. The dolphin IL-8 has an open reading frame of 303-bp encoding 101 amino acids. The homology of the amino acid sequence with that of other species was: sheep, 89.1%; cattle, 88.1%; pig, 85.1%; dog, 85.1%; horse, 79.2%; human, 74.5%; and macaque, 72.3%. The amino acid sequence suggested that dolphin IL-8 was a CXC chemokine. The recombinant dolphin IL-8 protein was recognized with anti-ovine IL-8 monoclonal antibody.     

中国奶牛PrP基因型分析

根据已报道奶牛朊蛋白(PrP)基因序列设计引物,采用PCR法扩增了28头黑白花奶牛的PrP基因。序列测定及分析结果表明,所克隆的奶牛PrP基因片段为677 bp,编码225个氨基酸的前体蛋白。对其136、154、171位点氨基酸多态性分析结果发现,对TSE中度易感的ARQ型占检测奶牛的82.9%,对TSE抗性的ARR型占7.1%,对TSE高度易感的VRQ型占10%。这说明中国奶牛的基因型对TSE中度易感,为防制TSE的发生提供基础数据。     

牛、羊布鲁菌多重PCR方法的建立与应用

根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列,设计合成了3对引物,以牛种布鲁菌544A、104M和羊种布鲁菌16M基因组DNA为模板,通过优化反应条件,建立了可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法。牛种布鲁菌可扩增出301和114 bp 2条带,羊种布鲁菌可扩增出301和253 bp 2条带,该方法对牛种布鲁菌544A和羊种布鲁菌16M混合DNA模板的最小检出量为100 pg,对大肠杆菌O157∶H7、小肠结肠炎耶尔森菌等15种参照菌的核酸扩增结果均为阴性。应用该方法对吉林省某牛场的106份粪便进行检测,虎红平板凝集试验作对照,结果PCR检测9份为阳性,且全为牛种布鲁菌阳性,对应的虎红平板凝集试验也为阳性。结果表明,建立的多重PCR方法具有良好的敏感性和特异性,为布鲁菌病的鉴别诊断提供了一种分子检测工具。