血清4型禽腺病毒广西分离株GX2019-010全基因组测序与分析

为了解广西地区血清4型禽腺病毒（FAdV-4）的基因特征,本研究对实验室前期分离的一株FAdV-4（命名为GX2019-010）进行了全基因组测序,对所获核苷酸序列进行同源性比对和遗传进化分析,并进一步分析了主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列。结果显示,GX2019-010全长43 719 bp,GC含量为54.9%,主要包括43个潜在蛋白质编码区域。核苷酸序列同源性比对发现,GX2019-010与致病株MX-SHP95的同源性为95.8%,与非致病株ON1和KR5同源性分别为95.0%和95.2%。遗传进化分析显示,GX2019-010与中国FAdV-4近几年的流行毒株在同一分支,而与国外FAdV-4毒株不在同一分支,说明FAdV-4存在遗传差异,主要的差异存在于基因组的右端,国内分离株均出现1 966 bp的缺失,其中包括ORF19、ORF48和ORF27基因的缺失,说明中国流行的FAdV-4具有地域性。对主要结构蛋白Hexon、Penton和Fiber的氨基酸序列分析发现,3个主要结构蛋白均有氨基酸位点的突变,其中Fiber-2的突变位点最多。本研究丰富了广西地区FAdV-4的基因库,为今后心包积液-肝炎综合征（HHS）的防控及流行病学调查研究提供了参考依据。     

禽腺病毒血清4型贵州株全基因序列分析

为了解禽腺病毒血清4型(FAdV-4)地方流行毒株的分子进化情况,基于实验室分离的2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株,分别对2株FAdV-4毒株进行PCR分段扩增,扩增产物克隆至载体,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后筛选出重组质粒进行测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,获得FAdV-4贵州株的全基因序列,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,通过PCR分段扩增成功获得了2株FAdV-4贵州株(GZ-BJ株和GZ-QL株)的全基因序列,长度分别为43352、43723 bp,FAdV-4 GZ-BJ株全基因序列长度比FAdV-4 GZ-QL株短371 bp,少6个ORF(22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF17、ORF28、ORF42),二者的氨基酸同源性为57.1%。2株FAdV-4贵州株同国内外不同地区FAdV-4毒株核苷酸同源性在88.7%~100%,与FAdV-4经典毒株ON1比对,2株FAdV-4贵州株和国内FAdV-4分离株均缺失ORF19、ORF27、ORF30。系统进化树分析显示,2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株仍属于Ⅰ群C种FAdV。研究结果表明,2株贵州株FAdV-4 GZ-BJ株和FAdV-4 GZ-QL株较国内外FAdV-4毒株均存在进化与突变,且FAdV-4 GZ-BJ株变化较大,但尚未改变其血清型,这为探索FAdV-4致病机理的分子机制研究提供依据。     

禽腺病毒血清4型贵州株全基因序列分析

为了解禽腺病毒血清4型（FAdV-4）地方流行毒株的分子进化情况,基于实验室分离的2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株,分别对2株FAdV-4毒株进行PCR分段扩增,扩增产物克隆至载体,提取质粒进行PCR和双酶切鉴定后筛选出重组质粒进行测序,将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组,获得FAdV-4贵州株的全基因序列,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,通过PCR分段扩增成功获得了2株FAdV-4贵州株（GZ-BJ株和GZ-QL株）的全基因序列,长度分别为43 352、43 723 bp,FAdV-4 GZ-BJ株全基因序列长度比FAdV-4 GZ-QL株短371 bp,少6个ORF（22K、putative 9.1 ku、u-exon、ORF17、ORF28、ORF42）,二者的氨基酸同源性为57.1%。2株FAdV-4贵州株同国内外不同地区FAdV-4毒株核苷酸同源性在88.7%~100%,与FAdV-4经典毒株ON1比对,2株FAdV-4贵州株和国内FAdV-4分离株均缺失ORF19、ORF27、ORF30。系统进化树分析显示,2株FAdV-4贵州株GZ-BJ株和GZ-QL株仍属于Ⅰ群C种FAdV。研究结果表明,2株贵州株FAdV-4 GZ-BJ株和FAdV-4 GZ-QL株较国内外FAdV-4毒株均存在进化与突变,且FAdV-4 GZ-BJ株变化较大,但尚未改变其血清型,这为探索FAdV-4致病机理的分子机制研究提供依据。     

禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白(Fiber2)的特异性单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NusA-Fiber2作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2,取细胞株2G5制备腹水并纯化,利用间接免疫...     

表达禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白的重组耐热新城疫病毒的构建及免疫效果评估

【目的】 研究针对新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)和禽腺病毒(Fowl adenovirus, FAdV)的耐热基因工程疫苗。【方法】 利用反向遗传学操作技术将NDV耐热株的HN基因替换到LaSota疫苗株上, 再将禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)的Fiber2基因插入到其基因组上, 构建表达Fiber2蛋白的重组耐热NDV质粒pTS-HN-Fiber2。通过病毒拯救技术拯救重组NDV rTS-HN-Fiber2, 并测定其生物学特性和作为疫苗候选株的免疫原性和攻毒保护性。【结果】 rTS-HN-Fiber2的鸡胚平均致死时间>168 h, 且脑内接种致病指数为0, 属于弱毒的范畴; 在细胞上的生长曲线结果表明, rTS-HN-Fiber2与亲本LaSota株有相似的生长曲线, 但最终的生长滴度略低于LaSota株; rTS-HN-Fiber2在56 ℃处理15 min后, 病毒滴度下降约10³ TCID₅₀/mL, 而LaSota株56 ℃处理5 min几乎无感染性; 间接免疫荧光试验结果表明, rTS-HN-Fiber2能表达Fiber2蛋白。免疫和攻毒试验结果显示, rTS-HN-Fiber2能产生NDV抗体, 且能显著提高雏鸡在FAdV-4强毒下的存活率, 减轻FAdV-4强毒引起的组织病变, 降低组织中的病毒载量。【结论】 本研究成功构建了表达FAdV-4 Fiber2蛋白的重组耐热NDV, 该病毒保持了亲本LaSota株的弱毒生物学特性, 但热稳定性有显著提升; 重组NDV免疫雏鸡可产生针对NDV和FAdV-4强毒的保护, 该重组NDV可作为开发针对FAdV-4和NDV二联基因工程疫苗的候选病毒株。     

1例鸡源血清4型禽腺病毒感染的实验室诊断

本研究从广州番禺某鸡场送检病死鸡中分离获得1株疑似Ⅰ群禽腺病毒。病鸡剖检以心包积液、肝脏呈土黄色并伴有出血点,肾脏肿胀、出血为主要特征。实验室通过血凝试验、PCR鉴定、序列测定及遗传进化分析、动物回归试验、病理组织学观察等进行一系列检测。结果显示,该毒株不能凝集鸡红细胞,根据FAdV的六邻体(Hexon)基因设计引物,进行PCR扩增和单克隆测序,PCR扩增出分子量约为550bp的特异性条带,通过序列测定和遗传进化分析表明,该分离病毒株与FAdV-4的相似性最高。同时用该分离毒株的鸡胚尿囊液感染28日龄雏鸡,试验鸡可复制出与临床相似病例,病理组织学观察可见,心肌细胞有炎性细胞浸润,肝内有嗜碱性包涵体等病变特征。综上,分离株B13为Ⅰ群FAdV-4。     

我国主要流行的4种血清型禽腺病毒-I群感染SPF鸡的致病性比较研究

旨在对我国流行的4种血清型(4、8a、8b和11型)禽腺病毒-I群(fowl adenovirus, FAdVs)对鸡胚和鸡的致病性进行研究,选取12日龄SPF鸡胚和10日龄SPF鸡感染4种血清型FAdVs,对SPF鸡胚和鸡的死亡率及鸡胚胚体质量进行统计;对感染鸡的大体剖检变化、组织学变化进行观察和病毒载量进行研究。结果显示,FAdV-8b和FAdV-11感染SPF鸡胚后其死亡率高于45%,FAdV-8a感染后胚体质量降低最严重,FAdV-4感染后对胚体质量影响最小;FAdV-4感染SPF鸡死亡率高达53.3%,其他组鸡无死亡;除肝出现肿胀、变性、出血和炎性细胞浸润外,4种病毒感染SPF鸡后分别造成不同组织器官的严重损伤,FAdV-4感染出现心包积液、FAdV-8a感染肌胃出现糜烂、FAdV-8b感染导致腺胃肿胀和FAdV-11感染导致胰腺坏死,各损伤组织均出现实质细胞坏死和炎性细胞浸润;4种病毒感染SPF鸡均出现免疫器官的组织学损伤,其中,FAdV-8a、-8b 和-11感染鸡引起的免疫器官内淋巴细胞缺失和损伤较FAdV-4更为严重;组织病毒载量结果显示,FAdV-4感染鸡心和肾病毒载量最高,FAdV-8b和FAdV-11感染鸡胰腺病毒载量高于FAdV-4感染组,且FAdV-4感染鸡心、肝和肾病毒载量在感染后第5天高于第3、7天,除FAdV-8a感染组外,病毒载量与各组织损伤情况相一致。综上表明,4种血清型FAdVs中,FAdV-11对SPF鸡胚的致死性最强,FAdVs对SPF鸡的致死率最高,尽管FAdV-8a、-8b 和-11不致死SPF鸡,但对SPF鸡胚、SPF鸡的消化系统和免疫系统损伤较为严重,这将会造成鸡胚孵化率降低、鸡生长发育缓慢和易于继发其他病原感染。     

鸡腺病毒12个血清型代表毒株Penton蛋白基因分析

为了解鸡腺病毒（fowl adenovirus,FAdV）Penton基因的遗传进化规律,试验根据GenBank中已公布的各基因型序列设计特异性引物,通过PCR技术分别扩增12个血清型毒株的Penton基因,连接至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector上进行序列测定,并将12个血清型毒株Penton蛋白的核苷酸序列与NCBI上已公布的标准毒株的核苷酸序列使用ClustalW法进行分析比对,绘制遗传进化树。结果显示,12种血清型Penton蛋白核苷酸序列与各血清型标准毒株同源性均在99.2%以上,其中FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-10、FAdV-11与对应标准株同源性高达100%,这进一步证实了实验室保存毒株与世界相应标准毒株的一致性。Penton蛋白虽然保守性较高,但不同种之间仍存在明显差异。FAdV-A1与其他种毒株同源性为70.6%~73.3%;FAdV-B5与其他种毒株同源性为70.6%~77.9%;FAdV-C同种不同血清型之间核苷酸同源性为99.6%,FAdV-C4与其他种之间同源性71.2%~73.4%;FAdV-D同种不同血清型之间核苷酸同源性为95.6%~98.7%,与其他种之间最高为85.3%;FAdV-E同种不同血清型之间核苷酸同源性为98.2%~99.4%,不同种间最高为85.3%。即相同种毒株之间差异较小,不同种毒株之间差异较大。依据Penton蛋白的核苷酸序列同样可以将FAdV分为A、B、C、D、E 5个种。本研究通过成功克隆FAdV 12种血清型Penton基因,并进行遗传进化分析,为今后对FAdV诊断、监测及毒株鉴定提供了参考。     

Gene Analysis of Penton Protein of 12 Serotypes of Fowl Adenovirus

In order to understand the genetic evolution of Penton protein of fowl adenovirus(FAdV),the specific primers of Penton were designed on the basis of published sequences of different genotypes on GenBank.Then Penton gene of 12 serotypes were amplified by PCR and constructed into pEASY-Blunt Simple Cloning Vector for sequencing.The nucleotide sequences of Penton protein of 12 serotypes were analyzed and compared with the nucleotide sequences of standard strains published on NCBI by ClustalW method to draw a genetic phylogenetic tree.The results showed that the nucleotide sequences of Penton protein of 12 serotypes had more than 99.2% homology with their respective standard strain,among which the homology of FAdV-1,FAdV-2,FAdV-3,FAdV-4,FAdV-6,FAdV-7,FAdV-8a,FAdV-8b,FAdV-10 and FAdV-11 were as high as 100%.This further confirmed the consistency between the laboratory preserved strains and the world standard strains.However,although Penton protein was highly conserved,there were still significant differences among different species.The nucleotide homology between FAdV-A1 and other species was 70.6%-73.3%,while that of FAdV-B5 was 70.6%-77.9%.The nucleotide homology between FAdV-C strains of different serotypes was 99.6%,while homology between FAdV-C4 and other species was 71.2%-73.4%.The nucleotide homology between FAdV-D strains of different serotypes was 95.6%-98.7%,while the highest homology between FAdV-D and other species was 85.3%.The nucleotide homology between FAdV-E strains of different serotypes was 98.2%-99.4%,while the highest homology between FAdV-E and other species was 85.3%.In conclusion,the homology difference between strains of the same species was small,and that of different species was significant.FAdV could be divided into A,B,C,D and E species according to nucleotide sequence of Penton protein.This study successfully cloned 12 serotypes Penton gene of FAdV and performed genetic evolution analysis,which laid the foundation for the diagnosis,monitoring and identification of FAdV in the future.     

云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析

2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型(B T V-7)毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BT V-7型毒株并掌握其遗传特征.作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、B H K-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细...     

禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NL-RP3.以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线.通过反应条件...     

血清4型禽腺病毒W株的分离鉴定和全基因组序列分析

为了解血清4型禽腺病毒（fowl adenovirus genotype 4,FAdV-4） W株全基因序列、结构特征及遗传变异情况,本试验采集发病鸡肝脏和肾脏进行PCR鉴定、SPF鸡胚和鸡胚肝细胞分离、电镜观察证明该病毒为FAdV-4,TCID₅₀为10^-7.2/0.1 mL;电镜观察可见70 nm左右的二十面体无囊膜病毒颗粒;经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚后能明显抑制鸡胚发育出现侏儒胚,接种10 d内死亡率达100%;进一步对W株进行全基因组扩增及序列分析。病毒序列分析结果显示,其全基因组长为43 591 bp,共有60个开放阅读框,W株与GenBank中公布的FAdV-4参考毒株全基因组核苷酸序列同源性为98.4%~100%,其中与标准株非致病性毒株ON1（登录号：GU188428.1）的同源性为98.4%,主要缺失ORF19（脂肪酶基因）和ORF27;通过对病毒主要结构蛋白Hexon、Fiber-1和Fiber-2基因分析发现,W株与近几年国内分离株亲缘关系较近,与ON1株及其他国外分离株差异较大。综上说明,该分离株具有高致病性,与国外分离株存在较大差异,为进一步分析FAdV-4的毒力增强机制提供了基础依据。     

鸡心包积液综合征病原的分离鉴定与进化分析

为确诊海南省某鸡场疑似心包积液综合征病例,于2016年5月从海南省某鸡场送检的病鸡中采集病料(肝脏、心脏),研磨,通过卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚,并进行鸡胚病变特征观察、禽腺病毒PCR特异性检测、基因测序和Blast序列比对。结果表明,接种鸡胚后5d开始死胚,剖检可见胚体发育受阻,羽毛稀少,体表潮红,鸡胚皮肤表面有出血点;在病料研磨液、尿囊液及胚体肝脏中均检测到大小约为884bp目的片段,将分离病毒命名为HN1605;hexon基因Blast序列比对及遗传进化分析结果表明,分离毒株与2015年山东和湖北报道的Ⅰ亚群腺病毒血清4型(FAV-4)SDSX、SDSX-15、SDNY2-15、HB1510和HBLF-15分离株亲缘关系最近。本研究表明,此次心包积液综合征病原是Ⅰ亚群禽腺病毒血清4型病毒,该病毒依然危害着我国鸡群,疫情不断扩大,并呈现由我国北方地区向南方地区扩散的趋势。     

I群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立I群禽腺病毒4型血清学检测方法,本研究利用纯化的I群禽腺病毒4型重组Hexon蛋白,通过各反应条件筛选,建立了I群禽腺病毒4型IgG抗体间接ELISA检测方法。结果显示,抗原最佳包被浓度为1 μg/mL;最佳封闭液为1%牛血清白蛋白;待检血清最佳作用浓度是400倍稀释,37℃孵育60min;酶标抗体的最佳作用条件为稀释度1:8000,37℃孵育60min;最佳显色时间为10min。用所建方法对160只临床鸡只进行检测,同时与拭子PCR检测对比,一致性较好,表明该方法可有效用于临床检测。     

多重耐药胸膜肺炎放线杆菌GD2107株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】通过对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)GD2107株进行全基因组测序及生物信息学分析,丰富APP基因组数据库信息;构建基于ApxⅣ基因的系统进化树,分析该菌株的进化关系,为探索APP致病机制和临床防控猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia, PCP)提供参考。【方法】通过药敏试验测定分离菌株的耐药谱;采用全基因组测序技术(whole genome sequencing, WGS)对细菌DNA进行全基因组测序,分别利用Illumina NovaSeq、PacBio SequeI测序平台对全基因组测序结果进行基因功能注释及生物信息学分析(包括基因组基本信息、功能元件分析及亚系统分析等);基于ApxⅣ基因构建系统进化树。【结果】药敏试验结果显示,GD2107菌株对青霉素、头孢拉定(先锋Ⅵ)、卡那霉素等14种抗菌药均耐药。对GD2107株全基因组测序得到1条大小为2 271 987 bp的环状染色体(GC含量为41.21%)和2个大小分别为5 027和3 497 bp的环状质粒...     

Isolation and Molecular Characterization of Fowl Adenovirus and Avian Reovirus from Breeder Chickens in Japan in 2019–2021

Fowl adenoviruses (FAdVs) and avian reoviruses (ARVs) are ubiquitous in poultry farms and most of them are not pathogenic, yet often cause damage to chicks. A total of 104 chicken fecal samples were collected from 7 farms of breeder chickens (layers and broilers) in Japan from 2019 to 2021, and yielded 26 FAdV plus 14 ARV isolates. By sequencing, FAdV isolates were classified as FAdV-1, 5 and 8b. ARV isolates were classified as genotype II, IV and V. These results suggest that FAdVs and ARVs are resident in the breeder chicken farms in Japan.     

牛乳头瘤病毒基因1型广西GX01流行株全基因组克隆及序列分析

为了解牛乳头瘤病毒1型（bovine papillomavirus genotype 1,BPV-1）广西GX01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,同时了解该毒株引起宿主产生的病理组织学变化情况,本研究选取广西贺州市患病牛皮肤肿瘤样物制作石蜡切片后镜检观察,提取病料DNA,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR扩增以确定此病毒的基因型,根据GenBank中BPV参考株设计嵌套引物,对GX01株进行全基因组扩增、克隆测序及序列分析。病理组织学检查结果显示,可在病变部位发现表皮细胞增生、肿胀,角质过度及挖空细胞等乳头瘤病毒感染的特征性病变。序列分析结果表明,GX01株为BPV-1,其全基因组长为7 945 bp,包含E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、L2 8个开放阅读框,符合BPV-1型基因组的结构特征;GX01与BPV-1参考株全基因组核苷酸序列同源性为98.6%~99.6%,与BPV-2型参考株（M20219.1）、BPV-13型参考株（JQ798171.1）同源性分别为86.9%和87.2%。GX01株为广西地区首次经检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。本研究为广西地区乃至全国的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律、遗传变异、疫源追溯及科学防控提供了基础数据。     

1株副猪嗜血杆菌血清4型的分离鉴定及耐药性分析

【目的】阐明引起河南漯河某规模化猪场仔猪呼吸道症状的主要细菌性病原体及其生物学特性。【方法】无菌采集发病仔猪的口鼻拭子及病死猪的胸腔积液及肺脏、肝脏、脾脏等组织器官,进行病原的PCR检测,并通过细菌分离培养、形态学观察、卫星试验、16S rDNA基因PCR扩增、系统进化树构建、多重PCR鉴定分离菌的血清型、致病性试验和药敏试验等对分离菌株进行生物学特性分析。【结果】在含有V因子的BHI固体平板上生长出圆形、表面光滑湿润、无色透明的微小菌落,在不含V因子的培养基上不生长;分离菌株经革兰染色,镜下可见革兰阴性菌,多呈单个存在的球杆、长杆状;在金黄色葡萄球菌的培养物周围形成典型的“卫星菌落”;16S rDNA基因序列分析表明,分离菌株与副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)处于同一分支,相似性>97%,亚型鉴定结果判定分离菌为Hps血清4型;将分离的Hps腹腔注射感染小鼠,可导致感染小鼠多个器官不同程度出血,以肺脏最为明显;高剂量感染可导致小鼠死亡。药敏试验发现,该菌株对四环素、环丙沙星、复方新诺明具有较强抗性,合理用药后,取得了良好的治疗效果。【结论】试验成...     

禽腺病毒4型云南株分离鉴定及Hexon基因序列分析

【目的】分析云南省家禽及野鸟禽腺病毒4型(Fowl adenovirus-4,FAdV-4)流行情况、Hexon基因差异性及致病性,为研究FAdV-4流行及Hexon基因对病毒毒力的影响提供参考。【方法】2020年1月―2021年6月在云南省昆明市、曲靖市、楚雄州、大理州、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区采集疑似感染FAdV-4家禽肝脏组织样品158份,候鸟迁徙地采集野鸟新鲜粪便310份,采用PCR技术检测FAdV-4核酸,对获得的代表性阳性样品进行病原分离鉴定,并对分离毒株进行致病性及Hexon基因序列分析。【结果】家禽肝脏组织样品中检出FAdV-4核酸阳性样品19份,阳性率为12.03%(19/158);黑颈鹤粪便样品中检出核酸阳性样品1份,阳性率为0.3%(1/310)。从FAdV-4核酸阳性样品中分离到7株FAdV-4,致病性研究结果显示,FAdV-4云南分离株均能致鸡胚发育不良,引起4周龄肉鸡发生心包积液-肝炎综合征,鸡胚半数致死量(ELD₅₀)为10^―6.17~10^―4.32/mL。7株分离株均聚类于FAdV-C亚群,Hexon蛋白与国内FAdV-4高致病性毒株具有相同的¹⁸⁸R、¹⁹³R、¹⁹⁵Q特征。分离株感染SPF鸡后,临床症状明显,具有高致病性且高致死率,肝细胞病变明显。【结论】研究初步掌握了云南FAdV-4的流行情况,首次在黑颈鹤粪便中检测到FAdV-4病原核酸,分离获得7株FAdV-4,部分毒株Hexon蛋白存在氨基酸突变。     

绿原酸对FAdV-4的抑制作用及其对鸡胚肝脏炎性因子和信号分子表达的影响

试验旨在研究绿原酸对禽腺病毒4型(FAdV-4)的抑制作用及其对鸡胚肝脏炎性因子和信号分子表达的影响。将9日龄SPF鸡胚随机分为7组:对照组、5个不同浓度的绿原酸组和FAdV-4感染组。绿原酸组经尿囊腔注射不同浓度的绿原酸,48 h后与FAdV-4感染组均经尿囊腔接种0.2 mL ELD₅₀为1.36×10⁷拷贝的FAdV-4病毒,对照组注射等体积的生理盐水。用MTT法检测绿原酸的安全浓度(IC₅₀),计算每枚鸡胚接种绿原酸的含量;接种病毒后72 h后,剖检并无菌收集鸡胚肝脏进行病理观察,实时荧光定量PCR法检测病毒载量,ELISA法测定肝脏细胞因子白介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及信号分子磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、核转录因子-κB(NF-κB)和NF-κBp65含量。MTT法测定结果表明,绿原酸对鸡胚成纤维细胞的IC₅₀为28.6 μg/mL,每枚鸡胚接种0.2 mL的绿原酸含量分别为858、429、214.5(≈215)、107.25(≈107)和53.125(≈53) μg。FAdV-4病毒接种72 h后,FAdV-4感染组鸡胚肝脏边缘钝圆、肿大,变脆,呈土黄色或黄色,甚至出现坏死;随着绿原酸浓度增加,绿原酸组鸡胚肝脏肿胀渐不明显,坏死灶和出血瘀点减少;肝脏内病毒明显增殖,载量为7.8 log₂拷贝/mg,107 μg绿原酸即可显著抑制FAdV-4在鸡胚肝脏中的增殖(P<0.05)。炎性细胞因子检测结果表明,与对照组相比,FAdV-4可极显著增加鸡胚肝脏中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量(P<0.01);53 μg绿原酸组IL-1β和TNF-α含量极显著增加(P<0.01),107 μg绿原酸组IL-6和TNF-α的含量均显著增加(P<0.05)。与FAdV-4感染组相比,107 μg绿原酸组IL-1β和TNF-α的含量均极显著降低(P<0.01),215和429 μg绿原酸组IL-6的含量显著降低(P<0.05),858 μg绿原酸组IL-6的含量极显著降低(P<0.01)。细胞信号分子检测结果表明,与对照组相比,FAdV-4可极显著增加PI3K、NF-κB和NF-κBp65的含量(P<0.01);53 μg绿原酸组PI3K、NF-κB和NF-κBp65的含量均显著增加(P<0.05)。与FAdV-4感染组相比,53 μg绿原酸PI3K和NF-κBp65的含量均显著降低(P<0.05);215 μg绿原酸组NF-κB的含量显著降低(P<0.05),NF-κBp65的含量极显著降低(P<0.01);当绿原酸达429 μg时,PI3K、NF-κB和NF-κBp65的含量均极显著降低(P<0.01)。本试验结果表明,绿原酸能够抑制FAdV-4的增殖,且剂量依赖性地抑制炎性因子和信号分子的表达,说明绿原酸可用于鸡抗病毒和炎性相关疾病的防控。