ADCY2基因表达对延边黄牛脂肪前体细胞成脂分化的影响

本试验旨在研究环腺苷酸（3',5'-cyclic adenosine monophosphote,cAMP）环化酶合成酶2（adenylyl cyclase 2,ADCY2）基因对延边黄牛脂肪前体细胞成脂分化的影响。选取3日龄的延边黄牛腹股沟皮下脂肪组织进行脂肪前体细胞的分离、培养和诱导分化;设计ADCY2基因的干扰片段（siADCY2-1、2、3）,构建pEX4过表达载体;分别收集正常诱导（对照组）、干扰和过表达0、5和10 d的脂肪细胞。用实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖激活物受体（PPARγ）、CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）和ADCY2在细胞分化过程中mRNA的转录水平,并用Western blotting法检测其蛋白的表达;用油红O染色检测脂滴含量的变化;用甘油三酯试剂盒检测甘油三酯含量。试验结果表明,在成脂分化过程中,与未分化相比,ADCY2基因在分化的第5和10天表达量均极显著上升（P<0.01）,而分化第10天与第5天相比水平极显著下降（P<0.01）;siADCY2-1干扰效率最高,过表达ADCY2基因使其mRNA水平升高;与对照组相比,过表达组细胞内ADCY2基因mRNA水平提高了约4 000 000倍,脂肪细胞内脂滴含量和甘油三酯的含量极显著提高（P<0.01）,成脂关键基因C/EBPα和PPARγ表达极显著上调（P<0.01）,而RNA干扰组细胞内ADCY2基因mRNA水平极显著降低（P<0.01）,脂肪细胞内脂滴含量和甘油三酯的含量极显著下降,成脂关键基因C/EBPα和PPARγ表达极显著下调（P<0.01）。因此,ADCY2基因过表达能显著增加成熟脂肪细胞的脂滴含量及甘油三酯含量,促进成脂关键基因C/EBPα和PPARγ的表达,说明ADCY2基因对脂肪细胞分化具有正向调控作用。     

延边黄牛UCP2、UCP3基因多态性及其与生长性状的关联分析

试验旨在探究延边黄牛解耦联蛋白2（uncoupling protein 2,UCP2）和解耦联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）基因多态性及其与生长性状的相关性。以120头24月龄的延边黄牛为试验对象,提取血液基因组DNA后构建混池,运用DNA测序法对UCP2、UCP3基因进行测序分析,应用高分辨率熔解曲线分型技术对延边黄牛UCP2、UCP3基因进行分型检测,并结合生长性状数据进行关联分析。结果显示,在24月龄延边黄牛群体中,UCP2基因53 412 568 bp处存在C>G突变（g.53412568 C>G）,产生2个等位基因：C和G,形成3种基因型：CG （0.358）、GG （0.125）和CC （0.516）;UCP3基因53 443 536 bp处存在C>T突变（g.53443536 C>T）,产生2个等位基因：C和T,形成3种基因型：CT （0.383）、CC （0.450）和TT （0.167）。关联分析显示,UCP2基因g.53412568 C>G位点CC基因型体重、腰角宽均显著高于GG基因型,CG基因型个体背高显著高于GG基因型（P<0.05）;UCP3基因g.53443536 C>T位点CC基因型胸围显著高于TT基因型（P<0.05）。以上结果表明,UCP2和UCP3基因在延边黄牛生长发育过程中起到一定作用,可为延边黄牛现代分子育种后续研究提供参考。     

延边黄牛DGATs基因克隆、生物信息学及组织表达分析

试验旨在克隆延边黄牛二酯酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase,DGATs）两种亚型（DGAT1和DGAT2）的CDS区核苷酸序列,并根据生物信息学对两种亚型的氨基酸序列进行分析,以及探讨其在延边黄牛各组织中的表达规律。采用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分别进行DGATs基因CDS区的扩增、克隆以及其在延边黄牛8个组织中mRNA表达量的检测,利用NCBI中BLAST将其与其他物种进行相似性分析,并构建系统进化树;通过在线工具对其编码蛋白的理化性质、一级结构及高级结构进行预测。结果显示,DGAT1和DGAT2基因CDS区序列长度分别为1 470和1 086 bp,分别编码489和361个氨基酸;二者均为稳定的疏水性蛋白。DGAT1存在25个潜在的磷酸化位点、1个N-糖基化位点和8个跨膜结构域;DGAT2存在28个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化位点和1个跨膜结构域。二者均不存在信号肽,即不属于分泌蛋白。DGAT1主要是通过α-螺旋和无规则卷曲连接,而DGAT2以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链连接为主。延边黄牛DGAT1和DGAT2基因分别在延边黄牛小肠和脂肪组织中表达量最高,且显著高于其他组织（P<0.05）。本试验结果对进一步研究延边黄牛DGATs基因以及探究其在脂肪沉积过程中的作用机制具有重要意义。     

延边黄牛FGF14基因多态性及其对生长性状的影响

本研究旨在探索延边黄牛成纤维细胞生长因子14（fibroblast growth factor 14,FGF14）第3外显子多态性及其对生长性状的影响。应用DNA直接测序法对延边黄牛FGF14基因第3外显子进行测序分析,利用高分辨率熔解曲线HRM分型技术对FGF14基因进行分型检测,探究FGF14基因不同基因型与16和24月龄延边黄牛生长性状的关联性,并进行遗传统计学分析。结果显示,在FGF14基因的631 947 bp处检测到1处A>G突变,有2个等位基因：A和G,存在3种基因型：AA、AG和GG。χ²检验结果表明,FGF14基因的基因型频率和等位基因频率在16和24月龄延边黄牛群体中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05）。多态信息含量（PIC）分析表明,FGF14基因在这2个群体中均处于中度多态（0.25 < PIC < 0.5）。与生长性状关联分析结果显示,FGF14基因不同基因型对16月龄延边黄牛背高和尻长均具有显著影响（P<0.05）,对24月龄延边黄牛体高、体重、十字部高均具有显著影响（P<0.05）。综上所述,推测FGF14基因对延边黄牛生长发育有一定影响,为后续延边黄牛肉质性状的现代分子育种选育工作提供参考。     

延边黄牛ACTA1基因的SNPs检测及其与肉质性状的关联分析

试验旨在研究延边黄牛ACTA1基因的遗传变异,分析其多态性对肉质性状的影响。采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法探讨ACTA1基因多态性及其与肉质性状的关联性。结果发现,延边黄牛ACTA1基因存在2个突变位点:A193G突变,导致氨基酸Arg → Gly的错义突变;A298G突变,导致氨基酸Lys →Arg的错义突变。χ²检验显示,A193G和A298G位点于检测群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。关联分析显示,延边黄牛ACTA1基因2个突变位点的不同基因型与肌肉中肉豆蔻酸、油酸含量、眼肌面积、大理石花纹等级呈显著相关（P<0.05）。初步认为ACTA1基因对延边黄牛肉质性状有显著影响,可作为延边黄牛新品种早期选择的候选基因。     

Polymorphism of ACTA1 Gene and Its Association with Meat Quality Traits in Yanbian Yellow Cattle

This study was aimed to research the gentic variations of ACTA1 gene in Yanbian Yellow cattle, and analyze the influence of genetic polymorphisms on meat quality traits. PCR-RFLP and PCR-SSCP technique were used to analyze the association between the polymorphisms of ACTA1 gene and meat quality traits. The results showed that there were two SNPs, A193G which with replacement of Arg by Gly amino acid, A298G which with replacement of Lys by Arg amino acid. χ² test showed A193G and A298G were in Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05). The association analysis indicated that the genotypes of different mutations in ACTA1 gene were found to be significantly related to myristic acid, oleic acid, loin muscle area, marbling score (P<0.05). ACTA1 gene had potential effects on meat quality traits of Yanbian Yellow cattle, and could be used for candidate gene in early selection of new varieties of Yanbian Yellow cattle.     

miR-17-3p靶向KCTD15调控延边黄牛前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-17-3p是否可以通过靶向KCTD15调节延边黄牛前体脂肪细胞的分化。本研究使用生物信息学软件鉴定miR-17-3p的同源性,预测miR-17-3p的靶基因;通过在延边黄牛的前体脂肪细胞中转染miR-17-3p mimic或miR-17-3p inhibitor及阴性对照实现细胞内miR-17-3p过表达或抑制表达;采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-17-3p与KCTD15的靶标关系;使用qRT-PCR和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测miR-17-3p对KCTD15基因以及脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα表达水平的影响。结果表明,生物信息学软件预测KCTD15可作为miR-17-3p的靶基因,且miR-17-3p在哺乳动物中具有较高的同源性;转染miR-17-3p mimic后脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα的mRNA和蛋白表达量显著或极显著高于转染NC-mimic的对照组(P<0.05或P<0.01);抑制miR-17-3p的表达后,PPARγ和C/EBPα的表达量则显著或极显著低于对照组(P<0.05或P<0.01);双荧光素酶报告基因验证分析显示,过表达miR-17-3p极显著抑制了含有KCTD15 3′UTR片段的载体的荧光活性(P<0.01);过表达miR-17-3p也会显著或极显著抑制候选靶基因KCTD15 mRNA和蛋白质的表达量(P<0.05或P<0.01);而抑制miR-17-3p的表达则会显著提高靶基因KCTD15的mRNA和蛋白质的表达量(P<0.05)。这些结果说明,miR-17-3p可能通过抑制KCTD15的表达促进延边黄牛前体脂肪细胞分化。     

延边黄牛脂蛋白脂肪酶基因多态性及其与肉质性状的关联分析

为探究延边黄牛脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase,LPL）基因遗传多态性及其对肉质性状的影响,本试验以80头健康的30月龄延边黄牛背最长肌作为试验材料,运用PCR直接测序法和高分辨率熔解曲线技术（HRM）对LPL基因的SNP位点进行检测,分析了试验群体的遗传效应,并与延边黄牛的肉质性状数据进行关联分析。PCR直接测序结果表明,延边黄牛LPL基因存在2个多态性位点（g.6215 A>G和g.18341 C>T）,其中g.6215 A>G位点表现为2种基因型：AA与AG,优势等位基因为A;g.18341 C>T位点表现为2种基因型：CC和CT,C为优势等位基因;对文献中2个位点的检测结果表明,g.355427 T>A位点表现为2种基因型：AA与AT,A为优势等位基因;c.322 G>A位点的HRM分型结果显示并未分型。这些多态性位点全部呈中度多态（0.25<PIC<0.5）,并处于Hardy-Weinberg平衡状态。HRM分型结果显示,这3个SNPs位点与延边黄牛肉质性状存在显著相关：g.6215 A>G位点与延边黄牛胴体重及脂肪、蛋白、水分含量有显著关联,表现为AG基因型个体胴体重、脂肪含量显著高于AA基因型个体（P<0.05）,AA基因型个体蛋白及水分含量显著高于AG基因型个体（P<0.05）;g.18341 C>T位点与延边黄牛宰前活重、胴体重及背膘厚有显著关联,表现为CT基因型个体这些性状均显著高于CC基因型个体（P<0.05）;g.355427 T>A位点AT基因型个体宰前活重、背膘厚和脂肪含量均高于AA基因型个体（P<0.05）。综上,LPL基因g.6215 A>G、g.18341 C>T和g.355427 T>A位点对延边黄牛的肉质有显著影响,LPL基因可以作为延边黄牛品种选育改良工作的优势候选基因和有效分子标记。     

The Correlation Analysis Between the SNPs of MC4R Gene and Meat Quality Traits in Yanbian Yellow Cattle

In order to explore the effects of the key gene of regulating cattle fat deposition on meat quality traits, screening candidate gene which affect beef fattening traits. This study employed 157 cattles (24 months old) with similar weight as research object, analyzed the correlation between SNPs of MC4R gene and meat quality traits in Yanbian Yellow cattle by PCR direct sequencing method. The results indicated that the mutation site of C→G had been found in MC4R gene 1 069 bp, which resulted in L (leucine) translated into V (valine). Protein secondary structure lost α-spiral and β-fold at the 166, 243 and 280 amino acid position, which resulted in the changes of spatial position of β-turns in tertiary structure. This site showed different degrees correlation with backfat thickness, lrightness, yellowness of Yanbian Yellow cattle. The backfat thickness and yellowness (3 d) of GG genotype were significantly higher than CC and CG genotypes (P <0.05). The lrightness of CC and CG genotypes were significantly higher than CC genotype (P <0.05). These results declared that the site had remarkably correlatived with Yanbian Yellow cattle relevant economic traits, and the mutation site could be used as a potential molecular marker.     

延边黄牛黑皮质素受体-4基因多态性及其与肉质性状的相关性分析

试验旨在探索调控肉牛脂肪沉积的关键基因对肉质性状的影响,筛选影响肉牛育肥性状的候选基因。本研究以157头24月龄、体重相近的延边黄牛为研究对象,利用PCR扩增直接测序的方法,分析了延边黄牛黑皮质素受体-4（melanocortin-4 receptor,MC4R）基因的SNPs及其与肉质性状的相关性。结果发现,延边黄牛MC4R基因在1 069 bp处存在C→G突变,导致L （亮氨酸）转变为V （缬氨酸）,引起蛋白质二级结构在166、243、280位氨基酸处出现α螺旋、β折叠丢失,导致三级结构中β转角的空间位置改变。经关联分析表明,该位点与延边黄牛背膘厚、亮度、黄度都存在不同程度的相关,其中GG基因型背膘厚与屠宰后黄度（3 d）显著高于CC和CG基因型（P＜0.05）;GG、CG基因型屠宰后亮度显著高于CC基因型（P＜0.05）。说明该位点与延边黄牛肉质性状存在显著相关,该突变位点可作为潜在的分子标记。     

延边黄牛PLIN基因多态性及其与胴体和肉质性状的相关性分析

为探究延边黄牛脂滴包被蛋白（perilipin,PLIN）基因遗传多态性及其对胴体和肉质性状的影响,试验选取70头30月龄健康延边黄牛公牛,采集颈静脉血液及其12~13肋间背最长肌以提取延边黄牛DNA样本,并测定胴体与肉质性状,采用直接测序方法检测PLIN基因SNP位点,结合延边黄牛胴体、肉质数据与PLIN基因遗传多态性进行关联分析。结果显示,在延边黄牛PLIN基因外显子3 103与156 bp处存在2个突变位点：g.103 C→T和g.156 T→C,均为错义突变。g.103 C→T位点存在CC、CT两种基因型,CC基因型为优势基因型（0.81）,C基因为优势等位基因（0.90）,表现为CT基因型个体脂肪含量、宰前重、胴体重、背膘厚均显著高于CC基因型个体（P<0.05）;g.156 T→C位点存在TC、TT两种基因型,TT基因型为优势基因型（0.83）,T基因为优势等位基因（0.92）,表现为TC基因型个体的宰前重、胴体重及背膘厚均显著高于TT基因型个体（P<0.05）。卡方检验结果表明,延边黄牛在PLIN基因外显子3的2个SNPs位点均达到Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）,杂合度较低,属于低度多态（PIC<0.25）。综上,PLIN基因g.103 C→T和g.156 T→C位点对延边黄牛部分胴体与肉质性状存在一定影响,该位点可作为延边黄牛胴体、肉质性状的潜在标记,PLIN基因可以作为延边黄牛品种选育的候选基因和潜在分子标记。     

延边黄牛α-肌动蛋白1基因的多态性及其与生长性状的相关分析

试验旨在寻找肌内脂肪含量差异极显著的两组个体延边黄牛背最长肌组织差异表达基因,并分析其遗传多态性对生长性状的影响。应用引物退火技术获得了在肌内脂肪含量差异极显著的两组个体背最长肌组织差异表达α-肌动蛋白1(actin alpha 1,ACTA1)基因及其全长cDNA序列,该基因主要在心脏和背最长肌中表达。序列比对结果发现,在5'端非编码区193 bp处存在1个突变。采用PCR-RFLP方法对100头延边黄牛群体进行检测,发现AA、AG、GG 3种基因型,基因型频率分别为0.24、0.50、0.26;A、G等位基因频率分别为0.37、0.63。对该突变位点的多态性与生长性状的关联性进行分析,结果发现,在体长、体重和平均日增重上,GG基因型个体显著高于AA和AG基因型个体(P＜0.05);在胸围上,GG基因型个体显著高于AG基因型个体,但与AA基因型个体差异不显著(P＞0.05);在体高上,不同基因型之间差异不显著(P＞0.05)。初步认为GG基因型是提高延边黄牛体质量和体尺指标性状的有利基因型,提示ACTA1基因有可能作为延边黄牛生长性状的候选基因。     

延边黄牛SCD1基因多态性及其与经济性状的关联分析

本研究旨在探索延边黄牛硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoy-CoA desaturase 1,SCD1）基因多态性及其与经济性状的相关性。以157头36月龄健康无病、体重相近的延边黄牛为研究对象,颈静脉采血提取基因组DNA,根据GenBank中牛SCD1基因序列（登录号：AC_000181.1）,利用Oligo 6.0软件设计特异性引物,应用PCR扩增SCD1全长基因后直接测序,分析其多态位点,并应用生物信息学软件分析其蛋白结构;屠宰前测定活体重、胴体重、屠宰率、背膘厚等胴体性状,屠宰后采集背最长肌,测定眼肌面积、蒸煮损失、滴水损失、嫩度、系水力、pH、脂肪酸含量等肉质性状,并通过一般线性模型分析方法对延边黄牛SCD1基因SNPs与肉质性状的相关性进行了分析。结果发现,延边黄牛SCD1基因846 bp处存在A→G突变（g846 A→G）、1 022 bp处存在C→T突变（g1022 C→T）,其中g1022 C→T突变导致丙氨酸（A）突变为缬氨酸（V）,但未引起三级结构改变。关联分析结果表明,g846 A→G多态位点与延边黄牛宰前活重、胴体重、滴水损失及硬脂酸、亚油酸含量存在显著相关（P<0.05）;g1022 C→T多态位点与延边黄牛宰前活重、胴体重及硬脂酸含量存在显著相关（P<0.05）,说明上述2个位点与延边黄牛相关肉质性状存在显著相关,该突变位点可作为潜在的分子标记。     

基于RNA-Seq数据分析环格列酮和胰岛素诱导延边黄牛前脂肪细胞分化的差异表达基因

试验旨在探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptors,PPARγ）激动因子（环格列酮）和胰岛素对延边黄牛前脂肪细胞脂质代谢的影响及可能的调控机制。试验分为对照组（CON,5% FBS）、胰岛素处理组（I组,5% FBS+10 mg/L胰岛素）、环格列酮处理组（C组,5% FBS+10 mg/L环格列酮）、胰岛素+环格列酮处理组（IC组,5% FBS+10 mg/L胰岛素+10 mg/L环格列酮）。各组处理144 h,通过RNA-Seq技术对其进行转录本测序,差异表达基因进行GO功能注释和KEGG富集分析。差异表达基因分析结果显示,与对照组相比,IC组差异表达基因数量为1 764个,比I和C组分别多276和569个,3个试验组间共有371个差异基因;IC组上调基因数量为974个,分别比I和C组多140和249个,IC组下调基因为790个,I和C组下调基因分别为654和470个。差异基因的GO分析表明,各处理组的差异基因参与了细胞过程、代谢过程以及生物过程的调节;在分子功能上,主要是分子功能调节剂、转运活性、转录调节活性等;在细胞成分上,大多数差异基因被富集到细胞器、细胞膜及胞外区等。KEGG通路分析发现,差异表达基因主要富集在FoxO、PPAR、TGF-β、p53等信号通路。综上所述,胰岛素和环格列酮单独处理与二者共同处理对延边黄牛前脂肪细胞分化的调控机制有所差别,其中二者共同处理对分化的促进作用更加明显。本研究结果为研究环格列酮与胰岛素在调节脂肪生成中的功能和分子机制提供了依据。     

延边牛PLIN2基因CDS区克隆、生物信息学分析及其表达规律研究

本研究旨在克隆延边牛脂肪分化相关蛋白PLIN2基因完整CDS区,通过生物信息学分析PLIN2基因CDS区序列和蛋白质基本特性,探讨其在延边牛不同组织及前体脂肪细胞成脂过程中的表达规律。选取18月龄去势的延边牛为研究对象,利用RT-PCR和基因克隆获得延边牛PLIN2基因,与其他物种进行同源性比对及系统进化树构建,利用生物信息学方法预测PLIN2编码蛋白质的理化性质、潜在磷酸化位点及糖基化位点、二硫键分析、信号肽、亚细胞定位、蛋白高级结构,利用实时荧光定量PCR检测PLIN2基因在延边牛不同组织中的表达水平。结果显示,延边牛PLIN2基因CDS长1 353 bp,编码450个氨基酸;同源性比对发现延边牛PLIN2基因与黄牛、水牛、绵羊、山羊、野猪、人、小鼠和野鸡的同源性分别为100%、98.7%、96.7%、97.1%、85.5%、86.3%、47.3%和49.1%;系统进化树表明,延边牛与黄牛、水牛的亲缘关系最近,与野鸡的亲缘关系最远。PLIN2蛋白为不稳定蛋白,具有一定亲水性,存在61个潜在的磷酸化位点、16个O-糖基化潜在位点、12个N-糖基化潜在位点,存在2个二硫键,不存在信号肽,主要分布于细胞核中,细胞质和线粒体中有少量分布。PLIN2蛋白高级结构预测该蛋白是由α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角组成,为混合型蛋白,通过无规则卷曲连接,以α-螺旋为主。实时荧光定量PCR结果显示,PLIN2基因在延边牛小肠组织中表达量最高,其次为背最长肌和肾脏组织。本研究结果可为进一步研究PLIN2基因的功能提供借鉴。     

延边黄牛卵母细胞与体细胞克隆胚胎内脂滴变化规律的研究

用苏丹Ⅳ和苏丹黑B 2种染色方法,对体外培养的延边黄牛各发育阶段卵母细胞和体细胞克隆胚胎内脂滴变化进行研究,并对2种染色方法进行了比较。结果表明,随着细胞发育阶段的不同,脂滴的含量也随之变化,从未经成熟培养的卵母细胞到8细胞期胚胎内脂滴不断增多,脂滴直径不断增大;而从8细胞期到囊胚期胚胎内脂滴不断减少,脂滴直径也不断减小。也显示苏丹IV染色效果较好,可作为测定活体细胞中脂滴的检测方法。