Detection of miR-122 expression in serum by Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR and its clinical significance

AIM: To detect the serum level of miR-122 expression by the technique of Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR for identifying its clinical significance. METHODS: The stem-loop RT primer, PCR primer and Taqman probe of miR-122 and U6 snRNA were designed. The expression of miR-122 in the serum samples of 27 cases of preoperative hepatocellular carcinoma (HCC), 15 cases of hepatitis B, 15 cases of hepatitis C, 15 cases of healthy control (HC), 11 cases of postoperative hepatocellular carcinoma (PHCC) and 10 cases of recurrence after postoperative hepatocellular carcinoma was detected by Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR. U6 snRNA was used as the internal control. RESULTS: The results showed that the method of Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR could detect the amplification signal of serum miR-122. The expression level of serum miR-122 in the patients with HCC, hepatitis B, hepatitis C and recurrence was higher than that in HC and the patients with PHCC. Meanwhile, the serum level of miR-122 in the patients with hepatitis C was higher than that in the patients with HCC, hepatitis B and recurrence. However, no difference of miR-122 expression level among HCC, hepatitis B and recurrent patients was observed. The miR-122 level was lower in PHCC patients than that in HCC and recurrent patients. In hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) and/or hepatitis B virus e antigen (HBeAg) positive patients, the miR-122 level was higher than that in the negative ones. The miR-122 level in hepatitis C antibody (HCV-Ab) positive patients was raised compared with the negative ones. The serum level of alanine aminotransferase (ALT) was positively correlated with the serum level of miR-122 (r=0.34, P<0.05). The miR-122 expression level in the patients with serum AFP≥400 μg/L was higher than that in the patients with serum AFP<400 μg/L. CONCLUSION: The method of Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR can detect the serum level of miR-122 expression. Serum miR-122 might be used as a new biomarker of liver diseases, especially in the early diagnosis of primary hepatocellular carcinoma, the curative effect of surgical operation and the prognosis.     

新疆杏品种SFB基因的克隆及实时定量表达

以新疆杏27个品种花粉为材料,进行转录水平SFB基因的克隆与测序;选取冬杏、苏陆克、库尔勒托拥3个杏品种,对其进行花粉离体培养,分析SFB基因在不同时期的表达特性。结果表明,在27个品种中扩增出4种大小不同的条带,引物组合1在26个品种中扩增出条带,其中品种贝新纳尔,赛买提的片段大小为447 bp;大优佳的片段大小为446 bp,其余品种的大小为434 bp。引物组合2在品种托乎提中扩增出大小为660 bp大小的条带。序列比对显示27个品种的SFB基因为20种基因序列,与其他物种SFB基因序列比对显示20种基因序列均为新SFB基因序列,在GenBank上的登录号为:HQ148064-HQ148083;SFB基因在3个杏品种花粉离体培养不同培养时期均有表达,其表达丰度的变化趋势一致,呈先增后减的趋势,均在培养24 h时表达丰度最高,但是每个品种的表达峰值不同。     

The feature of TCR-zeta chain expression in patients with CML by real-time quantitative PCR

AIM: To establish a real-time PCR technique for detection and quantification of TCR ζ chain expression and to investigate TCR ζ chain expression level in patients with chronic myeloid leukemia (CML). METHODS: Real-time PCR with SYBR GreenⅠ technology was used for detecting TCR ζ chain expression level in peripheral blood mononuclear cells from 30 patients with CML and 30 normal individuals. β2 -microglobulin gene (β2M) was used as an endogenous reference. Relative changes in TCR ζ chain expression level were used by the 2- △△Ct method between patients with CML and normal individuals. RESULTS: The SYBR GreenⅠ real-time technique for quantitative detection of TCR ζ chain expression levels was established successfully. The expression level of TCR ζ chain in 18 patients with CML was reduced. However, the TCR ζ chain expressed increased in 12 patients with CML. CONCLUSION: The TCR ζ chain expression level is divided into down expression (60%) and over expression (40%) groups, and the down expression of TCR ζ chain might related to cellular immunodeficiency in most of CML patients.     

山核桃实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证

[目的]筛选出山核桃中的最佳内参基因.[方法]以山核桃的根、茎、叶、柱头、果皮、胚、不同处理下的叶片及嫁接后的砧木和接穗为试验材料,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder4种软件对10个管家基因家族(ARF、ACT1、ACT7、MPS、UBC9、CYP、60SRP、EF-1α、...     

转基因柑橘外源基因拷贝数的实时荧光定量PCR检测

为分析转基因柑橘中外源基因整合拷贝数,基于实时荧光定量PCR法,建立通用、准确、简便的转基因柑橘外源基因拷贝数检测体系,利用该体系成功检测了150个转基因柑橘单株系外源基因整合拷贝数。结果表明,转基因柑橘中外源基因整合最低拷贝数为1,最高达5个,其中1、2和 ≥ 3拷贝的单株数分别占总数的40.0%、18.0%和42.0%;采用Southern blot技术进行检测,结果基本一致,极少数单株经实时荧光定量PCR分析的拷贝数比Southern blot检测的数值高。说明本研究建立的实时荧光定量PCR方法检测转基因柑橘外源基因整合拷贝数更加准确可靠。拷贝数为1 ~ 2的转基因株系可作为将来开展转基因目标性状研究及转基因生物安全性评价有利用价值的试验材料。     

部分葡萄品种的病毒病鉴定及健康状况评价

应用血清学的酶联免疫吸附法(ELISA),对采自四川省内4个葡萄主产区内的34个葡萄品种,共计199份枝条样本进行了葡萄病毒病的检测和分析。在被测试的26个鲜食葡萄品种中,18个品种被1种或多种危险性的目标病毒所感染,品种感染率为69.2%;而在8个酿酒葡萄品种中,仅1个品种感染了危险性病毒,感染率为12.5%。在5个受测目标病毒和类型中,GLRaV-3的发生和危害最为普遍,其单个采样点的样本感染率为25.5%￣56.3%,其次为GVA0￣25.5%,GVB0￣12.5%和GLRaV-20￣4.5%,GFLV在本次试验中未被检测到。在每个取样点,感病品种一般所有单株都被同一种病毒感染,因此葡萄繁殖材料的引入是危险性病毒进入新产区的主要途径;而在生产实践中,高接换种方式会成倍增加葡萄病毒传播侵染的风险性。     

百合疫病病原鉴定及其PCR检测

 对从百合疫病病株上分离得到的病原菌进行了形态特征观察、致病性测定及核糖体DNA-ITS序列分析。结果表明,该菌为疫霉属真菌,与GenBank中烟草疫霉ITS序列的同源性为98% ~ 99%。结合病原菌PCR检测结果,进一步证实其为烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）。这是烟草疫霉菌侵染云南切花百合的首次报道。     

利用PCR技术同时鉴定番茄抗根结线虫和抗斑萎病毒基因

 利用同一PCR反应体系，对分别与番茄抗根结线虫的 基因和抗斑萎病毒(1w V)的Sw一5基因紧密连锁的SCAR标记进行了同时扩增筛选，扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合，其中与基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记，抗感试材均产生750 bp的特异片段，纯合和杂合抗病基因型试材存在 I酶切位点，酶切后分别产生了570 bp、160 bp和750 bp、570 bp、160 bp的不同特异性片段，而感病基因型试材无 I酶切位点；与Sw一5基因紧密连锁的SCAR2标记为显性标记，只有抗病试材扩增出400 bD的特异性片段。经反复验证，结果稳定准确可靠，可用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。     

辣椒疫霉菌RT-PCR检测技术的建立及应用

根据辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）与致病疫霉菌（Phytophthora infestans）及其他8种常见土传病害病原菌Actin基因序列差异,设计并筛选出辣椒疫霉菌的特异性引物YM2F/YM2R,建立辣椒疫霉菌的实时荧光定量PCR检测体系,并利用该体系定量检测人工模拟带菌样品及田间发病土壤样品中的辣椒疫霉菌。试验结果表明,利用该引物建立的实时荧光定量PCR检测体系线性关系良好,灵敏度为1 × 10-1 pg ? μL-1,是普通PCR的100倍。该体系无需病原菌的分离培养即可对土壤中的辣椒疫霉菌进行快速、特异且定量检测。对田间土壤样品的检测结果表明,在一定范围内病害发生、流行程度与病原菌密度成正比,从而为该病的流行监测和早期防控提供科学依据。     

平菇细菌性褐斑病病原菌RT-PCR检测方法的建立及其应用

 平菇细菌性褐斑病是一种严重危害平菇生产的病害,早期监测和防治是关键。采用平菇细菌性褐斑病病原菌托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii）毒素基因的特异性引物（Pt-1A）/（Pt-1D1）,通过扩增条件优化,建立了该菌的实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction）检测及富集方法,并利用该方法完成了该菌在平菇表层的动态监测。试验结果表明,实时荧光定量PCR对托拉斯假单胞杆菌的检测范围为10² ~ 10⁹ cfu ? mL^-1,在经过选择性培养基富集后,检测灵敏度进一步提高了100倍。利用选择性培养基富集及荧光定量PCR检测方法,可在病害症状未显现之前检测到病原菌,为平菇细菌性褐斑病的流行监测和早期防治奠定了技术支持。     

草莓镶脉病毒的PCR检测及特异片段的序列分析

用CTAB法从感病的草莓叶片中提取总DNA,以其为模板经PCR扩增获得与预期片段大小一致长约600bp的扩增产物,同时优化PCR反应程序,获得单一特异条带;通过总DNA浓度梯度稀释,进行PCR扩增,结果表明能检测到2.5μg叶组织中病毒的存在。回收PCR特异扩增产物,与pMD18-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。扩增片段序列与已报道SVBVCP基因序列(序列号:Nc_001725)的核苷酸同源性为89.2%,氨基酸同源性为96.3%。该特异片段序列在GenBank中的登记号为AY862389。     

红掌根腐病病原鉴定及其PCR 检测方法

 利用真菌通用引物ITS1 和ITS4 扩增红掌根腐病菌转录间隔区并进行序列测定,通过序列 比较,设计了1 对红掌根腐病菌的特异引物SF1/SR2,对30 个红掌根腐病病原菌、8 种其它真菌和2 种 细菌基因组DNA 进行PCR 扩增。结果表明,只有红掌根腐病菌获得572 bp 的特异带。使用引物SF1/SR2 对华丽腐霉进行PCR 扩增,其检测灵敏度在DNA 水平上可达1 pg。运用设计的引物从红掌根腐病菌基 因组DNA 以及人工接种和自然发病的红掌植株中扩增到572 bp 的特异片段,实现了对红掌根腐病菌的快 速可靠的检测。     

番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

以番茄细菌性斑点病病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)的致病相关基因HrpZ为靶序列,设计了特异性引物Pst3F/Pst3R,能从Pst基因组DNA中特异性扩增出大小为161 bp的目的片段。建立的Pst实时荧光定量PCR检测技术体系的检测灵敏度比普通PCR高1 000倍。利用实时荧光定量PCR检测体系,检测模拟带菌种子中Pst的带菌量,检测下限为4.21 cfu·g^-1;检测人工接种叶片组织中Pst的带菌量,检测到1级发病叶片带菌量为4.15×102 cfu·g^-1。对田间采集的63个番茄细菌性斑点病明显症状和疑似症状样本,分别进行了实时荧光定量PCR、普通PCR和病原菌分离检测,检测到54个样本中含有Pst,3种方法检测结果一致。结果表明,建立的Pst实时荧光定量PCR检测体系具有特异性强、灵敏度高的特点,可以快速准确地定量检测番茄种子和发病组织中Pst的含量,为番茄细菌性斑点病的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段。     

朱顶红实时荧光定量PCR中不同组织器官内参基因的筛选

以朱顶红（Hippeastrum vittatum）不同组织器官为试验材料,通过实时荧光定量PCR技术检测肌动蛋白基因（ACT）、亲环蛋白基因（CYP）、转录延伸因子基因（EF-1α）、甘油醛–3–磷酸脱氢酶基因（GAPDH、GAPDH2）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）这7个常用的看家基因的表达水平,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1α和GAPDH2的表达水平较高,而且相对稳定;其次为TUB、TUA和GAPDH。geNorm和NormFinder软件分析结果显示,在不同组织器官中CYP和GAPDH2的表达稳定性最高,其次是EF-1α;进一步分析表明,CYP的表达稳定性虽然较高,但是其表达丰度较低,故不适合作为内参基因。BestKeeper分析表明,EF-1α和GAPDH2在不同组织器官中的表达稳定性较好。综合分析表明,EF-1α和GAPDH2在所有样品中表达量较高,稳定性较好。以筛选出来的EF-1α、GAPDH2以及EF-1α + GAPDH2作为内参基因检测朱顶红花器官调控基因PI的表达水平,结果表明,以上述两个基因及其组合为内参基因得到的PI表达模式相同,而且在花器官中的表达高于茎盘和根,基本符合PI调控花模型的机理。因此,EF-1α、GAPDH2或EF-1α + GAPDH2可作为朱顶红的内参基因进行相关基因的表达调控研究。     

金针菇假定蛋白E3泛素连接酶基因的鉴定与表达分析

以金针菇基因组与转录组数据为基础,通过本地BLAST方法鉴定金针菇假定蛋白E3泛素连接酶基因,命名为GENE5116,并对其结构、编码蛋白的基本性质与表达模式进行了分析,以期了解其在金针菇子实体生长发育过程中的作用。结果表明:该基因有9个外显子,8个内含子,基因总长为1998 bp,共编码438个氨基酸残基,相对分子质量为48987.36,等电点8.83;系统进化分析结果表明该基因与真菌E3泛素连接酶具有高度同源性,与陶兰柱担菌(Cylindrobasidium torrendii)亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果表明该基因在菌柄的表达量最高且菌柄上部基因表达量显著高于下部,在菌丝的表达量最低,所以推测该基因可能与子实体菌柄伸长有关。     

葡萄SnRK2家族基因的鉴定与表达分析

以‘宝石无核’(Ruby Seedless)葡萄试管苗为材料,采用RT-PCR技术,克隆得到8个葡萄Sn RK2家族基因。序列分析发现,该家族基因蛋白结构在N端相对保守,而在C端极其特异;聚类结果表明葡萄Sn RK2基因家族可以分为3个亚家族;对这8个基因所编码的蛋白质进行分析发现,其富含酸性氨基酸,且均为亲水蛋白;基因组结构分析发现Vv Sn RK2.2和Vv Sn RK2.8含有10个外显子,其他6个均含9个外显子;对蛋白二级结构分析发现8个基因编码的蛋白主要以α–螺旋、β–转角和不规则卷曲为主;亚细胞定位预测,8个基因主要定位于细胞质中。顺式作用元件分析表明,除Vv Sn RK2.1、Vv Sn RK2.2、Vv Sn RK2.6外,其他基因顺式作用元件包含ABRE、DRE/CRT、LRTE中的一个或多个。定量PCR分析表明,Vv Sn RK2的表达存在组织差异性,Vv Sn RK2.7在根中表达水平最高,是叶片的3.8倍,Vv Sn RK2.8在茎中表达水平最高,是叶片的5.0倍。0~–4℃处理后,表达水平下调幅度最小的为Vv Sn RK2.2,Vv Sn RK2.7下调幅度较大,Vv Sn RK2.8的表达水平为0;30℃处理后Vv Sn RK2.2和Vv Sn RK2.5上调表达,分别为对照的3.8倍和3.6倍;Vv Sn RK2.1和Vv Sn RK2.2与盐胁迫调节紧密相关,Vv Sn RK2.5与干旱胁迫调节密切相关。     

甘蓝耐热性鉴定方法

比较了在不同高温条件下 6个甘蓝育种材料的热害表现 ,对其进行了幼苗的电解质渗透率测定、人工气候箱高温胁迫鉴定以及夏季日光温室高温鉴定 ,结果表明 ,电解质渗透率测定、夏季日光温室高温鉴定基本能反映甘蓝耐热性差异 ,但难以区分耐热和较耐热品种的差异。而以甘蓝叶片发黄萎蔫为热害指标的人工气候箱高温胁迫鉴定方法可以明显地反映出甘蓝的耐热性差异 ,并确定在 36 .5℃恒温下对甘蓝幼苗进行 6d(天 )的处理是甘蓝耐热性选择的适宜压力     

番茄砧木材料的筛选与青枯病抗性鉴定

通过广泛收集番茄品种资源,在番茄青枯病区进行自然筛选,采用系统育种方法获得多份6代以上稳定的相对抗青枯病的自交系材料。将其中8份材料进行青枯病菌接种试验,筛选出5份高抗番茄青枯病材料。将筛选出的5份材料在青枯病重灾区作重复对比试验,并与3个不同的接穗品种进行嫁接试验,进一步确定其高抗青枯病特性以及较强的嫁接亲和性与共生性。多项试验证明,筛选的5份材料完全可以作为番茄砧木材料或品种进一步研究利用或推广使用。     

利用苹果花粉粒形态进行倍性鉴定

以苹果１０个二倍体和５个三倍体品种为试材,对不同倍性品种产生的花粉粒形状和大小进行了比较。结果表明：（１）倍性间不同形状花粉粒分布明显不同,二倍体品种三角形花粉粒数目多,而三倍体品种三角形花粉粒数目少;三倍体品种圆形及方形花粉粒数目均大幅增多;计算三角形花粉粒数目与圆形花粉粒及方形花粉粒数目之和的比值发现,倍性品种间差异较大,该比值１．２可作为鉴定倍性的临界值。（２）三倍体同一形状花粉粒大小比较分散,二倍体则相对集中,三角形花粉粒中等大小花粉粒数目与大花粉粒及小花粉粒数目之和的比值在倍性间存在明显差异,该比值２．５０可作为判别二倍体与三倍体的临界值。利用这两个指标对诱变植株产生的花粉粒形状和大小进行了比较,对孢原组织细胞的倍性水平进行了估计。