一株变异型猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其灭活疫苗的免疫效力试验

本研究旨在分离猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）变异株,通过悬浮培养工艺制备成高效价的PEDV灭活疫苗。2017年从中国多个规模化猪场采集腹泻病死仔猪的小肠及其内容物200份,通过RT-PCR方法进行PEDV检测并测序,筛选一株PEDV变异株,将其在2 L反应器里悬浮培养的Vero细胞上进行病毒分离与传代培养,收获的病毒液鉴定后测定TCID₅₀,经甲醛灭活后加入氢氧化铝胶佐剂配制成PEDV灭活疫苗,对其物理性状、稳定性、黏度、无菌等进行检验,检验合格后免疫妊娠母猪及所产仔猪,对其安全性和免疫效力进行研究。结果显示,200份病料中有86份为PEDV阳性,将筛选的PEDV变异株病料在Vero细胞上传至第5代时出现细胞病变,传至第10代收获病毒液,经鉴定后确定为PEDV变异毒株,并命名为PEDV-GF10株。收获的病毒液浓缩后测得病毒滴度可达1×10^8.0 TCID₅₀/mL。疫苗检验合格后在母猪产前40和25 d时试验组后海穴肌内注射4 mL疫苗,空白组不免疫,结果显示试验组与空白组母猪的生产情况无明显差异,所产3日龄仔猪分别免疫不同剂量后体温无显著差异,表明该疫苗对母猪和仔猪均安全性良好。随机挑选试验组与空白组母猪所产3日龄仔猪各20头,分别口服4 mL PEDV-F10病毒培养物,空白组母猪所产仔猪在攻毒24 h后PEDV发病率为100%,抗体均为阴性;试验组母猪所产仔猪只有10%出现了轻微的腹泻症状,仔猪获得了高达90%保护率,且仔猪被动免疫后抗体能持续至35 d以上。以上结果表明,PEDV-GF10变异株通过悬浮细胞培养后病毒滴度显著提高,研制的PEDV-GF10株灭活疫苗安全有效,能够对中国的PEDV变异株达到有效防控,为国内PED防控提供了理论依据。     

猪流行性腹泻病毒全病毒灭活疫苗量效关系研究

本研究旨在探索猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)灭活疫苗不同抗原含量对仔猪感染的保护作用。测定不同浓缩倍数PEDV感染性病毒粒子数和病毒粒子总数,用不同浓缩倍数抗原分别制备灭活疫苗免疫小鼠,利用ELISA抗体检测方法、中和试验、ELISPOT方法测定体液免疫与细胞免疫产生情况,筛选合适抗原含量疫苗进行仔猪免疫并测定抗体,利用攻毒试验研究浓缩疫苗与保护之间的关系。结果显示,当抗原含量达8×10⁶ pfu·mL^-1以上时,灭活疫苗能有效刺激小鼠产生体液免疫及细胞免疫。以2 mL含8×10⁶ pfu·mL^-1抗原的灭活PEDV疫苗免疫仔猪可抵抗PEDV攻毒引起的腹泻及连续排毒,相较于总病毒粒子数,感染性病毒粒子数与抗体产生呈显著相关(r = 0.998 1),中和效价与仔猪保护呈显著相关性(r=0.974 7)。PEDV灭活疫苗可以提供良好的免疫保护,其中感染性病毒数量是提升抗体水平的关键因子,抗体滴度作为一项体液免疫的指标是判断免疫保护的重要参考。     

猪流行性腹泻病毒分离鉴定及其灭活疫苗免疫保护效果研究

为筛选能用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗研发的流行毒株,收集PEDV阳性病料,以Vero细胞进行病毒分离试验,并对分离毒株进行外源病毒检测、病毒培养特性研究、仔猪毒力试验及免疫效力试验等。9份PEDV阳性病料共分离到3株病毒,分别命名为PEDV-SC12、PEDV-JS12、PEDV-JX12。其中PEDV-SC12株存在支原体污染;PEDV-JS12株与PEDV-JX12株均能被PEDV特异性阳性血清中和;PEDV-JS12株能在Vero细胞上增殖并产生细胞病变,但适应细胞45代以后病毒培养效价仍然偏低;PEDV-JX12滴度能维持在106.0 TCID50/mL以上。PEDV-JX12株毒力试验显示,该分离株能够通过人工感染复制出腹泻病例,并能从发病动物体内检测到感染的病毒。免疫攻毒保护试验显示,以PEDV-JX12株制备的灭活疫苗免疫母猪,对所产仔猪攻毒后免疫组6.25%(1/16)发病,对照组100%(8/8)发病。说明PEDV-JX12株能够适应细胞培养,免疫接种母猪能给仔猪提供有效保护,可以用于PEDV流行毒株的疫苗研发。     

猪流行性腹泻病病毒的分离鉴定

猪流行性腹泻病,是造成养猪业经济损失严重的传染病之一。本文是针对某养猪场的病死猪进行临床症状观察、病理剖检,通过病毒的分离培养及RT-PCR鉴定,确诊病死猪病原为猪流行性腹泻病毒应加强对猪流行性腹泻病的诊断及监控。     

猪流行性腹泻病毒SD株的分离与鉴定

利用Vero细胞自安徽合肥腹泻仔猪小肠内容物中分离到一株病毒,经胶体金、PCR方法和攻毒试验,确定为猪流行性腹泻病毒,命名为SD株。SD株在Vero细胞上传代,第8代(F8)开始出现稳定的细胞病变(CPE),F8代的毒价(TCID50)为10-6.25/0.1 m L,F8代细胞培养物接种未吃初乳仔猪,接种仔猪均出现典型腹泻症状,死亡仔猪3头(50%),未死亡猪生长严重发育不良,说明SD株具有较强的致病性。     

猪流行性腹泻病毒ShT株的分离及传代培养

从广东省某猪场疑为病毒性腹泻的发病猪采集腹泻粪便样品,以PCR方法扩增出猪流行性腹泻病毒N基因后,采用细胞培养法进行病毒分离.用套式PCR、胶体金试纸卡和血清中和试验对细胞分离物进行检验,证实其为一株猪流行性腹泻病毒,命名为ShT株.将猪流行性腹泻病毒ShT株在Vero细胞上进行传代培养,观察其培养特性.结果表明,PEDV ShT株能在Vero细胞稳定传代,第20代、25代、30代病毒液的TCID50/0.1 mL分别为10-7.0、10-7.13、10-7.33.     

猪流行性腹泻病毒SD201604株的分离鉴定及致病性研究

本研究旨在获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离株,并对其致病性进行研究。应用Vero细胞从山东某猪场腹泻病料中进行病毒分离,通过细胞病变、免疫荧光试验、电镜观察和RT-RCR进行鉴定,并对分离株的S基因序列进行分析;应用10^3.5 TCID₅₀/mL分离株口服接种3日龄仔猪并观察临床症状和病理变化;用不同滴度的分离株分别口服接种3日龄仔猪（3 mL/只）,统计各组仔猪的死亡率,确定最小致死量。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为PEDV SD201604株。该分离毒株能在Vero细胞上增殖,产生细胞病变,传代至F6代时病毒滴度可达10^3.5 TCID₅₀/mL,免疫荧光试验和RT-RCR检测均为PEDV阳性。电镜观察可见直径大小约为100 nm的病毒粒子,有明显的囊膜和纤突,具有PEDV病毒粒子典型的形态特征,确定分离株为PEDV。S基因序列分析显示,分离株为国内流行的PEDV变异株。动物回归试验结果显示,口服感染该分离株的5头3日龄仔猪全部出现典型的PED临床症状和病理变化,其中3头死亡。最小致死量试验结果表明,口服感染3 mL病毒含量为10^4.5 TCID₅₀/mL的分离株可使仔猪全部死亡。本试验结果可为PEDV的分离鉴定及生物学研究提供参考与借鉴。     

牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定与灭活疫苗免疫效果研究

由2例疑似牛传染性鼻气管炎（IBR）病例的荷斯坦奶牛分离到一株病毒,命名为IBRV—C1株。该病毒可被IBR标准阳性血清完全中和;接种MDBK细胞可出现IBR病毒典型细胞病变效应;选取IBR病毒gB蛋白基因序列设计引物进行PCR检测和基因测序,结果可扩增出特异性目的片段;动物回归试验显示,3头牛均可见体温升高、鼻流粘液、呼吸困难等典型的IBR临床症状。在此基础上制备了三批牛传染性鼻气管炎灭活疫苗,并进行了疫苗安全性和效力试验,结果表明三批疫苗对靶动物安全,免疫效果较好,免疫牛中和抗体效价几何平均值可达1：41以上,攻毒保护率达5／5。     

猪流行性腹泻病毒JS2017株的分离鉴定及S基因序列分析

为了解江苏省某规模化猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传变异情况,本试验采集腹泻仔猪小肠组织及肠道内容物,通过RT-PCR进行PEDV鉴定。将检测为阳性的病料组织经20μg/mL胰酶处理后,接种到Vero细胞中进行培养,将细胞培养物进行反复冻融后,收获病毒液,进行RT-PCR鉴定。采用分段重叠策略对其S基因进行全基因序列扩增,并在此基础上分析该毒株S基因的核苷酸同源性及遗传进化关系。结果显示,经RT-PCR鉴定,病料组织呈PEDV阳性,阳性病料接种Vero细胞盲传4代后,出现明显的细胞病变,表现为细胞合胞体病变,空泡化,最终裂解脱落。收获的病毒液经RT-PCR鉴定后,确认分离到1株PEDV,命名为JS2017株。核苷酸序列分析表明,JS2017株S基因序列与美国变异株OH1414、加拿大变异株ON-007、中国变异株PEDV-LYG和CH/PDS/2015位于同一进化分支,其核苷酸同源性高达99.0%以上;其中与中国变异株YC2014亲缘关系最近,核苷酸同源性为100.0%;与经典株CV777、DR13株同源性较低,亲缘关系较远。结果表明,本研究分离获得的JS2017毒株是一株PEDV地方流行变异毒株,与2014年中国江苏分离株(YC2014株)亲缘关系最密切,与当前猪流行性腹泻疫苗株亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒JX16株的分离鉴定及体外传代对其毒力的影响

2010年中国新出现了以新生仔猪高发病率、高死亡率为主要特征的变异株。为了明确山东地区猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）变异株特征,本试验利用Vero细胞对莒县某猪场的腹泻病料进行了病毒分离和体外传代培养。通过光学显微镜和细胞超薄切片观察、RT-PCR检测、间接免疫荧光试验、S基因序列进化分析、滴度测定和致病力试验进行病毒序列及特征分析,并探究接毒后细胞脱落时间的变化。光学显微镜观察发现,该病毒感染Vero细胞后能引起典型的合胞体病变;细胞超薄切片观察发现,病毒粒子多呈致密核芯,能引起宿主细胞线粒体肿胀,溶解;RT-PCR检测和间接免疫荧光试验结果证实其为PEDV,最终通过测序证实该毒株为变异毒株。体外传代培养至100代过程中,随着病毒代次升高,其对细胞适应性不断增强。接毒后细胞脱落时间由48 h逐渐缩短至17 h,病毒滴度由6代时的10^5.3TCID₅₀/mL逐渐升高至100代的10^7.5TCID₅₀/mL。致病力试验结果显示,病毒毒力随代次升高逐渐下降,40代时对仔猪已无致病力。本试验结果为PEDV突变株致病基因的确定及疫苗的研发奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立

为检测猪血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体水平,以纯化的PEDV作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV血清IgG抗体的诊断方法:当血清OD_(450nm)值0.31时,判定阳性;当OD_(450nm)值小于0.26时,判定阴性;当OD_(450nm)值介于两者之间判定可疑。结果表明,试验建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中猪流行腹泻病毒抗体、监测猪流行腹泻病的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。     

猪流行性腹泻病毒研究进展

猪流行性腹泻病毒是引起猪腹泻的重要病原体之一,广泛流行于世界各地,造成了重大的经济损失。文章阐述了猪流行性腹泻病毒的分子生物学特点,概括了病毒的检测方法,并对近年来流行病学及疫苗的研发情况进行了综述,以期对猪流行性腹泻病毒研究提供帮助。     

Research Progress on Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Porcine epidemic diarrhea (PED) caused by porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is a contagious acute gastrointestinal infection, which has brought great economic losses to the pig industry in recent years.The article reviewed advances in molecular biology, methods of detection, genetic variation and vaccine development to provide references for further study in preventing porcine epidemic diarrhea.     

Research Advances on Porcine Epidemic Diarrhea and New Vaccine

Porcine epidemic diarrhea (PED) is one of the important diseases that endanger the healthy development of the pig industry.It has acute and highly infectious characteristics,causing severe economic losses to the pig industry.Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) infection could destroy the animal's digestive system,cause the appetite of sick pigs to decline,vomit,and severe diarrhea.And the piglets cured by drugs will also have a serious impact on production due to factors such as poor growth and development,which will bring huge problems to the farmers.The outbreak of PEDV highly pathogenic mutant strains in China in 2010 led to a significant increase in the incidence and mortality of PED,which severely affected pig production in China.The outbreak of PED has drawn close attention from the pig industry.Scholars in related research fields have conducted more in-depth research on the pathogenic mechanism of PEDV and the new PED vaccine.Five new types of PED vaccines,including subunit vaccine,virus live vector vaccine,bacterial live vector vaccine,transgenic plant vaccine and nucleic acid vaccine,have been developed successively,and new breakthroughs and progress have been made.Compared with the traditional PED inactivated vaccine and PED attenuated vaccine,the new PED genetically engineered vaccine has the advantages of good safety,simple preparation,and good immune effect.This article focuses on the pathogenesis of PEDV and the research progress of five new PED vaccines,so as to deepen our understanding of new PEDV and PED vaccines,in order to provide references for prevention and control measures of PEDV infection.     

猪流行性腹泻病毒的实验室检测方法和生产防控措施

近年来,猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)呈现出全球性的流行及暴发,发病率及病死率逐年升高,经济损失巨大,严重阻碍了养猪业的健康可持续发展。文章综述了国内外研究者近年来在猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的实验室检测方法以及生产防控措施等方面的研究进展,以期为研究者提供参考。     

猪流行性腹泻及新型疫苗研究进展

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是危害养猪业健康发展的重要疾病之一,具有急性、高度传染性的特征,给养猪业造成了严重的经济损失。猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染会破坏动物机体的消化系统,造成患病猪食欲下降、呕吐以及严重腹泻等,且药物治愈后的仔猪也会因为生长发育不良等因素严重影响生产,给养殖户带来巨大的困扰。2010年PEDV高致病变异毒株在中国暴发流行,导致PED的发病率和死亡率大幅升高,严重影响中国养猪生产。此次PED的暴发流行引起了养猪行业的密切关注,相关研究领域的学者对PEDV致病机制和PED新型疫苗进行了更加深入的研究,亚单位疫苗、病毒活载体疫苗、细菌活载体疫苗、转基因植物疫苗和核酸疫苗5种PED新型疫苗相继被开发,并取得全新的突破和进展。与传统的PED灭活苗和PED弱毒疫苗相比,PED新型基因工程疫苗具有安全性好、制备简单、免疫效果好等优点。文章着重对PEDV发病机理和5种PED新型疫苗的研究进展展开综述,从而加深对PEDV和PED新型疫苗的了解,以期为PEDV感染的预防和控制措施提供参考。     

Identification and Molecular Characteristics Analysis of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variants

To ascertain a diarrhea case in a pig farm in Shandong province,the pathological changes of dead piglets were observed and nested RT-PCR test was carried out on 7 diarrhea samples for porcine epidemic diarrhea virus (PEDV).Pathological examination revealed that intestine was detected as enlargement,hyperemia and edema.After histological examination,the typical microscopic lesions of intestine were disappearance of epithelial cells,villus shrinkage and shortening.The result of nested RT-PCR showed that all of the 7 samples could amplify a specific target band of PEDV.Molecular characteristics of two field strains showed that they had an amino acid homology of 92.3% to 92.4% with vaccine CV777 and 96.6% to 98.6% with other previous field strains which sequences were downloaded from GenBank.Phylogenetic tree analysis further revealed that all of PEDV strains could be mainly divided into two clusters of G1 and G2. G2 consisted of the field strains of our study and other field strains from USA,China and so on,which had the same sequence characteristics of two insertions and one deletion,while G1 consisted of all vaccines of CV777 and several older field strains from China and Korea.These results indicated that our field strains were the dominant strains in recent epidemic diarrhea occurrence.Moreover,its molecular characteristics might be a characterization of differentiating the field and vaccine strains.     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立

试验根据GenBank上发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳(N)蛋白基因序列,设计合成了一对寡聚核苷酸引物,扩增大小为245 bp的目的片段,建立起PEDV N基因的RT-PCR检测方法。试验结果表明,该方法具有很强特异性和很高的敏感性,可作为猪流行性腹泻临床快速诊断的一种方法。     

猪流行性腹泻病毒变异株的鉴定和分子特征分析

为查明山东省某猪场流行性腹泻的病因,本研究对该猪场病死仔猪进行病理学检查,并对采集的7份仔猪腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)的套式RT-PCR检测。病理学检查发现病猪的肠道肿胀、变薄、出血,肠绒毛皱缩、变短、边缘粗糙。套式RT-PCR结果显示,7份样品均为PEDV阳性;对其中两份PEDV阳性病料进行S基因扩增,分析其遗传变异,结果显示这两株PEDV野毒株的S基因与参考疫苗株CV777的同源性为92.3%~92.4%,与其他野毒株的同源性为96.6%~98.6%。PEDV的遗传进化树结果显示,PEDV分为两个进化分支G1和G2,G1包括CV777等疫苗株及中国和韩国早期的部分毒株,G2则是PEDV变异株为主的分支,包括本试验分离的野毒株及近年来美国、中国等国的野毒株,这些毒株都存在两个插入突变和1个缺失突变。结果表明,变异株已成为PEDV的流行优势毒株,且这些变异位点有可能成为鉴定PEDV变异株的分子特征。     

猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的制备及攻毒保护研究

为研究现用猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777疫苗毒株对流行毒株的免疫保护效果,以RTPCR进行PEDV CV777疫苗株、JS12流行株S基因克隆测序,进行PEDV S基因核酸序列分析与氨基酸序列分析。分别以转瓶工艺与细胞悬浮培养工艺培养Vero E6细胞,制备PEDV CV777株转瓶灭活苗与悬浮灭活苗。分别以PEDV转瓶灭活苗、悬浮灭活苗、PEDV流行株组织灭活苗(JS12株)产前30d免疫经产母猪;母猪产仔后14d进行仔猪攻毒保护试验。核酸序列分析显示,PEDV CV777株S基因与流行毒株的相似性在96.4%~99.7%之间,氨基酸序列相似性在96.7%~99.5%之间。转瓶工艺制备PEDV抗原效价为107.0 TCID50/mL,悬浮培养制备PEDV抗原效价为108.5 TCID50/mL。攻毒保护试验显示,悬浮灭活苗免疫母猪后,仔猪有2/10发病,保护率为8/10,转瓶灭活苗组发病率为8/10,保护率仅为2/10;组织灭活苗组9/10发病;对照组10头全部发病。该试验证明,提高PEDV CV777株的抗原含量,能够有效提高疫苗对PEDV流行毒株的保护效果。