Asial型口蹄疫病毒VP2蛋白B细胞线性表位的鉴定

为了对Asial型口蹄疫病毒VP2蛋白进行抗原表位作图,设计了7个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个VP2蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达.用Asial型口蹄疫感染血清对7个融合蛋白进行免疫印迹分析,结果初步鉴定出VP2蛋白B细胞线性抗原表位位于氨基末端的第1-44氨基酸区域,并且证实O型、A型、C型口蹄疫标准血清和感染SAT2型口蹄疫康复期的牛血清也能识别融合蛋白F1(1-44 aa).在此基础上,针对F1(1-44 aa)短肽,设计了6个相互重叠5个氨基酸的短肽片段,进一步鉴定出了VP2蛋白B细胞线性表位位于氨基末端的第6-15氨基酸区域.     

小鼠抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,用纯化的鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV) VP3蛋白免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体(mAb),经间接ELISA方法筛选和有限稀释法进行3次亚克隆后获得一株抗鹅细小病毒VP3蛋白杂交瘤细胞株(4E5).经鉴定,该mAb为IgGl亚型,轻链为κ链.Western blot试验结果表...     

鹅细小病毒VP2和VP3蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及验证

为筛选与鹅细小病毒VP2和VP3蛋白相互作用的鹅胚成纤维细胞蛋白,构建VP2和VP3蛋白的诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3。从pGEX-4T-VP1质粒中PCR扩增VP2和VP3基因,克隆至pMD-18T载体中,经测序验证鉴定后定向克隆到酵母双杂交载体pGBKT7中。将2个重组诱饵载体经PCR、酶切和测序验证后分别转化酵母菌H2YGold中,检测其在酵母细胞中有无自激活和毒性作用。结果表明:成功构建了pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3诱饵载体,且其对报告基因无自激活作用,对酵母细胞无毒性。由此说明,诱饵载体pGBKT7-VP2和pGBKT7-VP3可用于酵母双杂交系统筛选与VP2和VP3蛋白相互作用的细胞结合蛋白。     

鹅细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为制备鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）,利用浓缩的GPV免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆后获得一株抗GPV单克隆抗体杂交瘤细胞株4B4。经鉴定,其McAb的重链为IgG1亚型,轻链为κ链。ELISA和Western blotting试验结果表明,获得的4B4株McAb可特异性的识别GPV和GPV-VP3蛋白,表明4B4株McAb识别的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守区域。为进一步鉴定GPV的表位和GPV诊断试剂的研究奠定了基础。     

鹅细小病毒主要结构蛋白VP3基因的克隆与序列分析

将GPV H2分离株接种于13日龄非免疫鸭胚，收集接毒后3－7日死亡鸭胚的尿囊液。纯化病毒，通过PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，经酶切鉴定后直接与pMD 18-T质粒载体连接，转化感受态大肠杆菌TG1。提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。结果表明；鹅细小病毒H1分离株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸，与国外已发表的鹅细小病毒B株核苷酸序列同源性为98．5％，氨基酸序列同源性为98．3％，表明这二个毒株亲缘关系相近。     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒的构建和表达

本实验采用质脂体转染方法将禽痘病毒转移载体质粒PSY681VP3LacZ转染被禽痘病毒FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞CEF，通过蓝白筛选和6轮蚀斑克隆纯化，获得了稳定的重组病毒。PCR鉴定，重组病毒基因组中含有VP3基因。Dot-ELISA实验证明，重组病毒表达了VP3，并具有抗原性。     

鹅细小病毒YBLJ株VP3基因的真核表达

为了研究鹅细小病毒(GPV)YBLJ株VP3基因的生物学特性,根据已克隆的GPV YBH株VP3基因序列(GenBank:JN836326),设计并合成一对特异性引物,经PCR扩增、克隆、转化、酶切与亚克隆,构建真核表达载体pcDNA-VP3,将鉴定正确的质粒转染至Vero细胞,经RT-PCR检测VP3基因转录水平,通过间接免疫荧光试验(IFA)观察VP3基因表达水平.结果显示,克隆的VP3基因全长约1 605 bp;构建了真核表达载体pcDNA-VP3,经RT-PCR对转染细胞总RNA扩增得到特异性目的片段,IFA检测显示VP3基因在Vero细胞中获得了稳定表达.本研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础.     

鹅细小病毒不同毒株VP3基因的序列分析比较

分别将GPV4个分离株通过PCR技术，从病毒基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段，并与PMD18-T质粒载体连接，转化到感受态大肠秆菌TG1中，提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列测定及分析。结果表明：VP3基因全长1605bp，编码534个氨基酸。不同毒株主要结构蛋白VP3基因同源性较高(95．64％—99．81％)。但强弱毒株间也存在一定差异。     

鹅细小病毒SS/10株VP3蛋白的原核表达及鉴定

根据GenBank收录的鹅细小病毒(GPV)基因序列,设计并合成了一对VP3基因扩增引物。采用PCR技术对SS/10株的VP3基因进行扩增,将目的基因和原核表达载体PET-32a分别经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后进行连接,获得重组质粒PET-32a-VP3,并将其转化表达菌BL21(DE3)pLysS。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了72ku左右的融合蛋白,大部分以包涵体的形式存在于菌体中。Wesern blot结果表明,该蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

鹅细小病毒主要免疫原性蛋白VP3基因遗传变异及其原核表达

根据鹅细小病毒(GPV)B株全基因序列,设计并合成了1对特异性引物,采用PCR技术对GPV GD-01株的VP3基因进行扩增,将目的基因克隆到pGEM(R)-T后测序,分析了GPV GD-01株VP3基因的遗传变异情况,并进行原核表达.结果表明,GPV GD-01株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸(DQ665790),与已发表的GPV、番鸭细小病毒(MDPV)的核苷酸、氨基酸同源性分别为96.15%、80.1%,97.78%、89.13%,说明GPV VP3基因具有较高的遗传稳定性.结合亲水性、表面极性、抗原位点分析比较GPV、MDPV VP3基因,为研究GPV和MDPV感染谱差异的分子机制提供了一定的理论基础.原核表达显示,VP3蛋白的最高表达量占整个菌体蛋白含量的29.9%,经表达条件优化可产生大量可溶性VP3表达蛋白.SDS-PAGE与Western-blot分析显示,表达的VP3蛋白的相对分子质量约60000,并能与鼠抗GPV阳性血清反应,证明具有一定的反应原性,为进一步研制基因工程疫苗及诊断制品奠定了基础.     

鹅细小病毒非结构蛋白和结构蛋白B细胞线性抗原表位的鉴定

鹅细小病毒是小鹅瘟的病原体,其基因组含有2个主要开放阅读框（ORF）,分别编码非结构蛋白（NS）和结构蛋白（VP）。为了对这2种蛋白进行抗原表位作图,设计了34个覆盖非结构蛋白NS和结构蛋白VP的50-60个氨基酸残基的重叠短肽,并进行了融合表达。用攻毒10周龄鹅血清对这34个融合蛋白进行蛋白质印迹分析,结果鉴定出NS蛋白线性抗原表位位于C末端的453-627氨基酸区域;VP蛋白线性抗原表位位于35—198、423—491、531—595、616—669和678—732氨基酸区域。     

Prokaryotic Expression and Immunogenicity of Dominant Epitope Region of Goose Parvovirus Structural Protein VP3

[Objective] The paper was to develop a subunit vaccine candidate for prevention and control of goose parvovirus infection. [Method]Based on the prokaryotic expression system, the antigenic epitopes and locations of the structural protein VP3 were predicted by software analysis,and the region displaying a large portion of antigenic epitopes was amplified by PCR. The target VP3 DNA fragment was inserted into pET-30 a-VP3 vector, was transformed into Escherichia coli BL21 competent cells for protein expression and animal test. The SPF chickens were immunized with the recombinant protein and the antisera were collected for neutralization test by using a goose embryo fibroblast. [Result] The recombinant plasmid was constructed, and the target region of VP3 protein was expressed efficiently in a soluble form. The neutralizing titers of antisera could reach up to-2.608. [Conclusion] The target region displaying a large portion of antigenic epitopes of the structural protein VP3 could be expressed efficiently in soluble form, and the expressed protein could induce neutralizing antibodies in SFP chicken.     

三株鹅细小病毒VP3基因的克隆和序列研究

为深入研究鹅细小病毒VP3基因的功能,利用PCR方法克隆了3株GPV分离株的VP3基因,并将其与pMD18-T载体连接,转化到感受态大肠秆菌Top10中,经PCR鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析.结果表明:3株GPV VP3基因全长均为1 605 bp,编码534个氨基酸.不同毒株主要结构蛋白VP3基因与鹅细小病毒B株核苷酸序列同源性为93.8％～98.5％,但强弱毒株间也存在一定差异.     

鹅细小病毒VP1-VP3非重叠区基因的克隆与序列分析

通过克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)分离株VP1-V3非重叠区基因,并对其进行序列分析,为鹅细小病毒感染与疫苗免疫的鉴别诊断奠定理论基础.进行鹅胚病毒增殖,收集尿囊液,提取基因组,参考发表的B株序列,设计合成一对引物,经PCR扩增,克隆VP1-VP3基因,筛选阳性克隆,对其进行序列测定及同源性分析.结果表明,克隆的基因片段为901 bp,VP1-VP3基因共594 bp,编码198个氨基酸;弱毒株之间亲缘关系很近,核苷酸同源性99.5％～100％,氨基酸同源性98.5％～100％;强毒株与B株亲缘关系较近,核苷酸同源性96.6％,氨基酸同源性97.5％;弱毒株与强毒株亲缘关系较远,核苷酸同源性92％～93％,氨基酸同源性96％～97.5％;弱毒株与B株亲缘关系最远,核苷酸同源性92.5％～93％,氨基酸同源性93.9％～95.5％.说明强毒株与弱毒株之间核苷酸序列存在差异.     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析

试验利用PCR技术从自行分离的GPV基因组DNA中扩增出病毒衣壳蛋白VP3完整基因片段,并与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH 5α感受态细胞,提取重组质粒经PCR和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明,VP3基因全长1605 bp,编码534个氨基酸;分子生物学分析表明所分离到的病毒为强毒株。     

鹅细小病毒VP3亚单位疫苗的制备及其免疫效果

为了研究鹅细小病毒(GPV) VP3亚单位疫苗的免疫效果,从ZJ-04分离株基因组DNA扩增VP1和VP3基因并克隆到pMD18-T载体,测定其核苷酸序列;将VP3基因亚克隆至质粒载体pET-32a(+),重组质粒pET-VP3用于转化E.coli BL-21(DE3)感受态细胞获得重组菌BL-VP3;以VP3重组蛋白和BL-VP3重组菌制备油乳剂疫苗免疫接种种鹅,用琼脂扩散试验检测血清GPV抗体,观察母源抗体对雏鹅GPV感染的免疫保护效果.结果表明,ZJ-04株VP1基因大小为2 199 bp,编码732个氨基酸,与Gen-Bank收录的GPV毒株的核苷酸序列同源性为95.3％～99.2％,氨基酸序列同源性为97.7％～99.3％;SDS-PAGE、Western blot检测结果表明,重组VP3分子质量约80 ku,能与GPV抗体发生特异性反应;VP3包涵体和BL-VP3重组菌均能诱导种鹅产生GPV抗体,新生雏鹅可获得良好的免疫保护.