鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养与鉴定

[目的]本试验旨在建立一套稳定的鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化和培养技术,为深入研究鸡舍空气污染物对鸡肺泡功能影响提供体外研究模型.[方法]采用Ⅰ型胶原酶对16日龄鸡胚的肺组织进行消化,经过差速离心和差速贴壁法分离细胞,采用鸡免疫球蛋白G(IgG)免疫吸附法纯化细胞,再利用免疫荧光检测和碱性磷酸酶进行细胞鉴定.[结果]培...     

发情期家兔输卵管上皮细胞和基质细胞的分离培养与鉴定

【目的】探讨输卵管上皮细胞和基质细胞的体外分离培养方法及在激素刺激下基质细胞对上皮细胞的作用。【方法】通过差速贴壁法体外分离纯化兔输卵管上皮细胞和基质细胞;免疫组织化学染色和免疫荧光染色方法鉴定上皮细胞和基质细胞的类型和纯度;并在无胎牛血清的DMEM/F12培养液和含体积分数15%胎牛血清的DMEM/F12培养液中,分别添加不同浓度的雌激素(17β-E2)和孕激素(P4),比较上皮细胞和基质细胞的增殖情况及其对上皮细胞/基质细胞共培养的影响。【结果】体外成功地分离到兔输卵管上皮细胞和基质细胞;兔输卵管上皮细胞经鼠抗人细胞角蛋白单克降抗体(anti-CK18)免疫组织化学染色后呈阳性,细胞质呈棕色,免疫荧光染色检测其纯度在98%以上;兔输卵管基质细胞经鼠抗人波形蛋白单克降抗体(anti-Vimentin)免疫组织化学染色后呈阳性,细胞质呈棕色,免疫荧光染色检测其纯度在95%以上。17β-E2和P4均能促进兔输卵管上皮细胞和基质细胞的增殖,使其数量明显增加。基质细胞与上皮细胞共培养,上皮细胞增殖较快。【结论】差速贴壁法能够获得纯度较高的输卵管上皮细胞和基质细胞,在17β-E2和P4共同作用下,少量基质细胞能促进上皮细胞生长。     

山羊胎儿肺泡上皮的电镜观察

对山羊胎儿肺泡上皮进行透射电镜观察 ,结果表明 :腺状期 (第 6～ 12周 ) ,终蕾上皮细胞胞质内线粒体、粗面内质网及核糖体随着胎龄增加而逐渐增多 ,胞核向细胞顶端移行 ;小管期 (第 13～ 14周 ) ,终蕾上皮由单层柱状上皮逐渐演变为立方形的原始肺泡上皮 ,胞质内线粒体、粗面内质网及核糖体较发达 ;囊状期 (第 15周 ) ,肺泡上皮细胞开始分化为 型细胞和 型细胞 ,嗜锇小体首次出现 ,气血屏障开始建立 ;肺泡期 (第 16～ 2 2周 ) ,以肺泡的形成和分化为主 , 型细胞的超微结构特征为嗜锇小体出现 ,核糖体显著增多 ,粗面内质网池扩张 ,线粒体膨大 ,出现多泡体。     

Histopathology in Swines Exposed to

用质量分数为10%的狗舌草饲料喂猪144 d,病理组织学特征变化为,肝脏出现巨肝细胞;肾脏近曲小管上皮细胞肿大,胞浆内陷;大脑神经细胞出现卫星化和噬神经现象,小脑浦肯野氏细胞肿胀,尼氏小体不清;心肌纤维颗粒变性,有的核变圆,淡染。透射电镜检查可见肝细胞核常染色质数量增加,异染色质边集,胞质内充满嵴溶解的线粒体,内质网及高尔基体消失;Ⅰ型肺泡上皮细胞核膜破裂;Ⅱ型肺泡上皮细胞游离端微绒毛增多,嗜锇性板层小体减少。     

鸡肠上皮原代细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡肠上皮原代细胞分离培养方法,进一步研究人源志贺菌对鸡的致病性和为相关侵袭特性提供体外模型,分别取不同日龄鸡胚,用0.1 g/mLⅠ型中性蛋白酶和300 U/mLⅪ型胶原酶联合分离纯化鸡肠上皮原代细胞,筛选其最佳培养方法,并对培养细胞进行鉴定;然后采用0.125％胰酶和0.01％ EDTA联合消化进行鸡肠上皮原代细胞传代.结果显示,应用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型胶原酶消化15日龄鸡胚肠组织可获得满意的肠上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好.培养出圆形或多角形单层生长呈“铺路石样”的细胞,培养的细胞在12 h内贴壁,24 ～48 h明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,生长状况不良.经透射电镜观察鉴定为肠上皮细胞.且传代后细胞贴壁生长良好.建立的鸡肠上皮原代细胞分离培养方法可获得纯度较高的鸡肠上皮原代细胞,制备的细胞可以连续传代3次.     

猪狗舌草中毒的病理学研究

用质量分数为１０％的狗舌草饲料喂猪１４４ｄ,病理组织学特征变化为,肝脏出现巨肝细胞;肾脏近曲小管上皮细胞肿大,胞浆内陷;大脑神经细胞出现卫星化和噬神经现象,小脑浦肯野氏细胞肿胀,尼氏小体不清;心肌纤维颗粒变性,有的核变圆,淡染。透射电镜检查可见肝细胞核常染色质数量增加,异染色质边集,胞质内充满嵴溶解的线粒体,内质网及高尔基体消失;Ⅰ型肺泡上皮细胞核膜破裂;Ⅱ型肺泡上皮细胞游离端微绒毛增多,嗜锇性板层小体减少。     

仔猪小肠黏膜上皮细胞体外分离培养及鉴定

 【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18（ETEC F18）引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1 的CDS区第307位点处的突变（G→A）,建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系（GG、GA和AA）。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上皮细胞分离效率对比表明,后一种消化方式更为有效。进而取出生12 h内未吃初乳的大白仔猪,剖腹剪取其小肠段,使用联酶混合液灌注消化分离得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。电镜和CK18免疫荧光染色结果均显示,小肠黏膜上皮细胞纯度达90%以上。经纯化处理,最后获得了FUT1基因型为GG和GA的两种小肠黏膜上皮细胞。仔猪原代小肠黏膜上皮细胞培养周期显示,7代前细胞生长状况良好,形态为典型的上皮细胞样,单层细胞呈铺路石排列,培养至第9代,细胞出现生长停滞、胞体空泡化等现象。【结论】最终获得了FUT1基因型为GG和GA的仔猪原代小肠黏膜上皮细胞。建立了仔猪小肠黏膜上皮细胞分离及培养方法,为后续的细胞建系工作奠定了良好的基础。     

大鼠睾丸支持细胞的分离纯化与鉴定

采用Ⅴ型胶原酶单次振荡消化法和低渗处理,及差速贴壁和免疫组化染色法,对大鼠睾丸支持细胞进行分离、纯化和鉴定。结果表明,该分离纯化方法对睾丸支持细胞损伤较小,获得的细胞活性较高,原代细胞存活率为85%,且无较大细胞团,接种后增殖迅速,并在第8天达到最高峰;细胞产率为6.5×105/g;绝大多数细胞呈F as-L阳性,细胞纯度可达95%;细胞核仁清楚,核仁周围可见着色较深的卫星核小体。     

鸡小肠上皮细胞表面大豆凝集素受体的标记

以0日龄海蓝褐蛋鸡为材料,用胶原酶结合组织块培养的方法分离培养了鸡小肠上皮细胞,通过抗角蛋白单克隆抗体对分离的细胞进行纯度鉴定,并用荧光标记大豆凝集素对已鉴定的细胞大豆凝集素结合位点进行了标记.结果表明:试验获得了鸡小肠上皮细胞原代培养物纯度＞90%,可用于后续试验,荧光标记表明细胞表面存在大量的大豆凝集素受体.     

出眠初期甲鱼肺泡、胃、肝细胞结构的电镜观察

通过扫描和透射电镜观察，描述了出眠初期甲鱼的肺、胃、肝细胞的超微结构特征。肺呈泡囊状结构，由肺泡隔将肺内部隔开成海绵状结构，肺泡内表面覆盖一层呼吸上皮，由单层上皮细胞和毛细血管网构成。上皮细胞有两种类型：Ⅰ型上皮细胞胞质向四周延伸成极度扁平状；Ⅱ型上皮细胞近核细胞质里分布有一定数目的多层体，多层体体积较大，由Ⅰ型上皮细胞延伸的胞质薄层、融合的基底膜和毛细血管内皮细胞胞质薄层共同构成血－气屏障。胃粘膜表面有许多胃小凹，粘膜上皮细胞内有许多电子密度深的分泌颗粒，粘膜腔面被一层粘液所覆盖。肝细胞有两种不同类型，即Ｌ细胞和Ｄ细胞，Ｌ细胞胞核呈圆形，细胞质多，近核周围有一些线粒体；Ｄ细胞的核形状不规则，细胞核紧抱一巨大的脂滴，细胞质较少，细胞器不发达。     

银翘散对感染甲1型流感病毒金刚烷胺耐药株小鼠的抗病毒研究

以经过耐药表型和基因型鉴定的甲1型流感病毒金刚烷胺耐药株感染BALB/c小鼠,观察其生存状态并测定肺指数,以苏木素—伊红染色(HE染色)法观察肺组织病理改变;将鼠肺悬液以空斑试验定量检测感染性病毒滴度。研究结果表明,银翘散可以减轻甲1型流感耐药株感染小鼠引起的全身症状,降低肺指数;减少鼠肺病变范围及肺泡渗出物;降低鼠肺病毒滴度。说明银翘散有体内抑制甲1型流感病毒金刚烷胺耐药株复制的作用。     

猪狗舌草中毒的病理学研究

用质量分数为１０％的狗舌草饲料喂猪１４４ｄ,病理组织学特征变化为,肝脏出现巨肝细胞,肾脏近曲小管上皮细胞肿大,胞浆内陷;大脑神经细胞出现卫星化和噬神经现象,小脑清肯野氏细胞肿胀,尼氏小体不清,心肌纤维颗粒变性,有的核变圆,淡染。透射电镜检查可见肝细胞核常染色质数量增加,异染色质边集,胞质内充满嵴溶解的线粒体,内质网及高尔基体消失;Ⅰ型肺泡上皮细胞核膜破裂;Ⅱ型肺泡上皮细胞游离端微棋毛增多,嗜锇性板     

新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

[目的]建立一种高效、实用的新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞原代培养方案,为肾脏损伤引起的疾病研究奠定基础.[方法]取5～8个月大的出栏细毛羊肾脏皮质,剪成1～2 mm3大小组块,分别采用传统组织块法和改良组织块法,在含15;～ 20;新生小牛血清的DMEM的培养基中进行原代培养,无需研磨或使用酶和化学试剂,根据上皮细胞自身的生长特性,首次结合刮除法,相差消化法和差速贴壁法,分离纯化上皮细胞,再选用0.037 mm孔径网筛过滤除去肾小球上皮细胞,分离纯化培养肾小管上皮细胞,细胞免疫组化进行鉴定.[结果]改良方法与传统方法相比,细胞贴壁早,生长快,处理时间短,减少了污染机率,提高了细胞培养效率,分离培养的肾小管上皮细胞,纯度达90;以上,细胞呈多角形,鹅卵石状,折光性强,连接紧密,可传至第9代,免疫细胞化学(CK - 18)染色鉴定为阳性.[结论]改良的组织块培养与传统的组织块培养以及常用的酶消化培养相比,经济、简单、不易污染,分离培养的肾小管上皮细胞,活性高,纯度高,是一种高效、实用的细毛羊肾小管上皮细胞培养方法.     

秦川牛胎儿骨骼肌卫星细胞的分离培养

【目的】探索胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、鉴定及基因转染的方法。【方法】分别采用Ⅰ型胶原酶消化、Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化及链霉蛋白酶消化法对胎牛骨骼肌卫星细胞进行培养,比较了3种不同分离方法所得细胞数及其存活率的差异;利用差速贴壁法和Percoll密度梯度离心相结合的方法纯化骨骼肌卫星细胞,对纯化后的细胞进行myostatin基因RT-PCR以及结蛋白(Desmin)免疫细胞化学染色鉴定,最后通过电转染法对纯化的骨骼肌卫星细胞进行EGFP基因转染研究。【结果】3种消化培养方法中,以链霉蛋白酶消化法分离得到的胎牛骨骼肌卫星细胞数显著高于其它2种方法(P0.05),但细胞存活率较低(P0.05);而采用Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化法可以得到相对较高的细胞数及存活率。利用差速贴壁和Percoll密度梯度离心相结合的方法可以得到纯化的骨骼肌卫星细胞;电转染法适用于骨骼肌卫星细胞的基因转染。【结论】建立了胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、纯化、鉴定及基因转染的方法,为通过转基因方法改良秦川牛产肉性能研究奠定了基础。     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为了建立一种高效的子宫细胞分离培养方法,用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养家兔子宫细胞,分别以上皮细胞角蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等为抗原的免疫荧光对分离培养的细胞进行鉴定,并采用流式细胞仪分析细胞纯度。结果表明,家兔子宫内膜上皮细胞培养24 h后大部分贴壁,培养3 d左右形成单层细胞集落,呈角蛋白阳性,细胞圆形或椭圆形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达96%以上;子宫内膜基质细胞培养0.5 h后即有贴壁,培养2 d后呈单层细胞集落状生长,呈波形蛋白阳性,细胞多边形或梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达95%以上;平滑肌细胞培养24 h后大部分贴壁,6~7 d融合成片,呈α-平滑肌肌动蛋白阳性,细胞大都长梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达98%以上。说明该方法能够成功分离并得到高产量、高纯度、高增殖能力的子宫内膜细胞及平滑肌细胞。     

山羊骨骼肌卫星细胞系分离、培养及其成肌诱导分化研究

采用外科手术方法从山羊四肢肌肉或背最长肌获取3mm×3mm肌肉束,置于1mg.mL-1 IV胶原酶中,室温消化30min,分散肌丝,在体视显微镜下分离肌丝;再用0.25%胰酶-EDTA于37℃下消化10min,以释放出骨骼肌卫星细胞(SSC)和其他细胞。连续5代在增殖培养体系(80%DMEM/F12+10%胎牛血清+10%马血清)中采用差速贴壁方法,收集接种后20min的贴壁细胞,对纯化的SSC采用免疫荧光方法检测SSC特异标志蛋白Pax-7,结果表明:(92.5±3.4)%细胞表达Pax-7,(93.0±1.8)%细胞表达MyoD,说明90%以上细胞为SSC。将纯化的SSC细胞分别在诱导培养体系Ⅰ(93%DMEM/F12+1%胎牛血清+1%马血清+1%non-AA)和II(99%Opti-MEM+1%non-AA)中进行诱导培养,通过细胞形态学观察和成肌细胞早期标志蛋白Desmin、MyHC免疫荧光检测诱导效果,结果表明:采用体系Ⅱ能在各种细胞密度(大于1×105个.cm-2)下诱导山羊SSC向成肌方向分化,而采用体系Ⅰ(低血清培养基)且仅当能诱导高密度山羊SSC向成肌方向分化。采用改进的SSC分离方法能够获得较高纯度的卫星细胞,比较诱导体系Ⅰ、Ⅱ认为,诱导培养体系Ⅱ适合于山羊SSC成肌诱导分化,为进一步研究SSC成肌分化机制提供素材。     

小鼠乳腺上皮细胞的体外培养

采用I型、II型胶原酶和胰蛋白酶混合（1：1：1）消化乳腺组织,并用差速贴壁法纯化培养乳腺上皮细胞,倒置显微镜下观察细胞的形态,并用角蛋白18免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定。结果表明：改良型混合酶消化法能获得较多的细胞团,且12h后细胞团绝大多数已贴在细胞瓶壁,72h后细胞团完全铺开呈单层融合,细胞呈典型的铺路石样。免疫荧光鉴定结果显示,角蛋白18呈阳性反应。因此,应用改良型混合酶消化法能在短时间内获得大量较纯的乳腺上皮细胞。     

水牛肺泡巨噬细胞的分离、培养及鉴定

为了深入研究水牛巨噬细胞（Macrophage,Mφ）的生物学特性,探索一种简便的水牛肺泡巨噬细胞（Alveolarmacrophage,AM）分离、培养方法,采用肺气管冷PBS灌洗法分离获得水牛肺泡细胞,并进行鉴定和功能检测。结果表明,采用肺气管冷PBS灌洗法可获得大量贴壁细胞,经光学显微镜和电子显微镜观察,其形态具备巨噬细胞的典型特征;酸性磷酸酶和非特异性酯酶阳性率分别为（89.4±3.5）%和（83.6±3.4）%;细胞表面抗原MHCⅡ阳性率为（96.6±1.3）%;鸡红细胞吞噬率为（23.6±4.2）%,墨汁吞噬率为（92.3±0.6）%。可见,肺气管冷PBS灌洗法是一种获取水牛肺泡巨噬细胞的可行方法。     

大鼠胰岛的分离、纯化与评价方法改良

【目的】简化胰岛的分离纯化方法,建立完善的胰岛评价体系。【方法】采用Ⅴ型胶原酶分离出Spra-gue-Dawley大鼠胰岛,并采用改良的3层Dextran不连续密度梯度离心法纯化胰岛。纯化的胰岛通过双硫腙(Dithi-zone,DTZ)染色进行计数及纯度检测,丫啶橙(AO)-碘化丙啶(PI)双染色法确定分离细胞的存活率,体外葡萄糖刺激释放胰岛素试验检测胰岛的分泌活性。采用Adobe Photoshop程序改进了常规的胰岛计数方法,并进行胰岛标准计数。【结果】平均每只成年Sprague Dawley大鼠的胰腺,可获得(3 840±24)当量数(IEQ)纯化胰岛,纯度可达到90%,细胞平均存活率达92%。【结论】采用改良的3层Dextran不连续密度梯度离心法及基于Adobe Photoshop程序的标准计数方法,可分别用于大鼠胰岛分离纯化和计数。     

负压下血管灌流固定兔肺组织的SEM观察

负压下经血管灌流固定的兔肺组织在扫描电镜下可观察到肺泡Ⅰ型细胞表面有少量微绒毛,肺泡Ⅱ型细胞的周围与Ⅰ型细胞之间形成环状的凹陷。Ⅱ型细胞表面具有散在的微绒毛肺泡壁的毛细血管形成网状隆起,并可见到大小不同的肺泡孔。