PCR 技术在黄淮白山羊瘤胃产甲烷菌检测中的应用1）

为了建立黄淮白山羊瘤胃甲烷菌快速检测的PCR方法,采集安徽本地黄淮白山羊瘤胃内容物,进行瘤胃甲烷菌的分离培养,利用瘤胃甲烷杆菌的保守基因甲基辅酶M还原酶基因（MCR）进行引物设计,并且优化PCR扩增条件。结果表明：所设计的引物具有特异性、专一性,优化的PCR扩增条件符合瘤胃甲烷杆菌扩增要求,扩增产物在140 bp的位置出现单一明亮条带。由此可见,利用PCR技术,可以快速、准确检测黄淮白山羊瘤胃甲烷杆菌。     

能量耦合存在于产甲烷菌甲基辅酶M还原酶MCR活化过程

产甲烷菌中甲基辅酶R还原酶(MCR)催化甲烷合成途径中的最后一步,也是甲烷合成途径中速率限制的一步。MCR的活化中心有一必须的辅酶F430。有活性的MCR酶的辅酶F430活性中心的镍处于+1价态。快速有效地活化MCR对于阐明MCR的催化机理和人为控制天然甲烷的合成起到相当重要的作用。然而MCR的活化相当困难,因为辅酶F430的Ni(Ⅰ)的氧化还原电势极低(-600 m V),很容易被氧化而失活。目前为止,人们还没有找到体外活化MCR的有效方法,但发现H_2和CO可以在体内活化MCR,虽然其活化机理还是一个迷。研究发现,在培养基中添加钨和硒可以提高H_2活化MCR速度8倍和H_2活化MCR的效率约65%;添加fumarate和CH3-SCo M使H_2能够在体外活化MCR(为体内MCR活化程度的30%～40%),让CO体外活化的MCR更稳定。这都说明H_2和CO活化MCR的过程中存在能量耦合反应,正是这种能量耦合反应使得氧化还原电势较高的H_2(-420 m V)和CO(-520 m V)能还原氧化还原电势较低的MCR的活性中心F430(-600 m V)。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

 根据胸膜肺炎放线杆菌S4 0 74菌株毒素I的序列 ,设计了 1对引物 ,从本室自己分离的菌株中扩增了猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I的结构基因 (apxICA) ,扩增的DNA片段大小为 36 4 0bp(4 6 87～ 832 6bp) ,将其克隆到pMD18 T载体中 ,酶切鉴定和序列测定后 ,进一步将其插入pET 2 8a中构建了原核表达载体 ,SDS PAGE和Westernblotting分析表明 ,该基因在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中获得了表达 ,而且表达的蛋白质具有免疫学活性。利用表达的蛋白作为     

兔巴氏杆菌与大肠杆菌混合感染病例诊断及药敏试验

为了诊断患病死亡兔,对死亡兔进行临床解剖,细菌分离培养,获得DX01、DX02、JX01、JX02等4株菌.按照常规生化鉴定法,对分离菌进行生理生化实验,结果:DX01、DX02对甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖均产酸产气,不发酵蔗糖,枸橼酸钠、尿素、V-P、硫化氢、明胶等反应均为阴性,靛基质、M-R、硝酸盐等反应均为阳性,与大肠杆菌标准株完全一致;JX01、JX02均发酵甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖,不发酵乳糖,靛基质、M-R、V-P、硫化氢、明胶等反应均为阴性,硝酸盐反应为阳性,与巴氏杆菌标准株基本一致,JX01、JX02进一步经过16SrDNA检测与测序分析,与巴氏杆菌同源性为100％.分离菌动物接种试验结果,试验组小白鼠在2日内均死亡.死亡小白鼠体内均分离出了原培养物.结论:DX01、DX02为大肠杆菌,JX01、JX02为大肠杆菌,患病死亡兔由大肠杆菌和巴氏杆菌混合感染引起的.按照琼脂扩散法做药敏实验,结果DX01、DX02只对卡那霉素、氧氟沙星、甲氧嘧啶敏感,对其他的药物不敏感;JX01、JX02对氧氟沙星、甲氧嘧啶、庆大霉素、呋喃唑酮、强力霉素、链霉素、复方新诺明、大观霉素等敏感,对头孢拉啶等中度敏感.治疗该病临床用药首选氧氟沙星、甲氧嘧啶.     

极端嗜热功能菌筛选及其促进堆肥腐熟效果研究

本研究采用富集培养方法从不同高温堆肥环境中分离筛选到9株极端嗜热菌,通过16S rDNA序列比对分析确定其分类地位,通过生长特性研究和酶活测定,优选出6株菌株复配成极端嗜热菌剂,采用模拟堆肥方法研究极端嗜热菌剂促进堆肥腐熟效果。结果表明:本研究分离得到的9株菌分别属于土芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)、栖热菌属(Thermus sp.)、副土芽孢杆菌属(Parageobacillus sp.)和红嗜热菌属(Rhodothermus sp.)。所分离菌株最适生长温度均在65～70℃;菌株NY-44、D和E的最适生长pH为9.5,属于嗜碱菌;菌株NY-44最适生长盐浓度为20 g·L~(-1),属于嗜盐菌。土芽孢杆菌和副土芽孢杆菌所产蛋白酶活性相对其他菌株较高,且最适反应温度均不低于80℃。在堆肥30 d时,接种极端嗜热菌剂的处理与未接种相比,种子发芽指数(GI)和胡富比(HA/FA)分别提高了35.9%和21.3%。研究结果表明,接种极端嗜热菌剂能加快堆肥腐熟进程,提高堆肥品质。     

温泉中降解纤维素嗜热细菌的分离与鉴定

采用纯培养的方法,从美国内达华州温泉和中国福建永泰温泉分离得到27株嗜热细菌,从中筛选得到产纤维素酶的嗜热细菌并进行了16S rDNA鉴定。结果表明,LY7和LY8是产纤维素酶的嗜热细菌,菌株LY7与脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)的同源性达到99%,菌株LY8与土芽孢杆菌属(Geobacillus)的同源性达到99%,生长温度范围在40~70°C之间,最适温度65°C。酶学性质分析表明,LY8的内切酶酶活高达145 IU/mL。     

4株芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性分析

从水产饲料中分离得到4株菌株,分别命名为A2、A3、A4、A5。通过16S r DNA基因序列分析,结合电镜结构观察、生长特征分析、产酶试验以及抑菌试验发现,菌株细胞形态为杆状,革兰氏染色呈阳性;A2、A4、A5菌株最适生长温度为45℃,A3菌株最适生长温度为50℃;4个菌株均产蛋白酶,A2菌株产蛋白酶能力最强;A2、A3菌株产淀粉酶,A4、A5菌株基本不产淀粉酶;4株菌株对大肠杆菌都没有抑菌作用,A2和A5菌株对共培养的沙门氏菌分别有31.2%和22.9%的抑菌效果。序列分析表明,A2菌株属于嗜热枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),A3、A4、A5菌株属于嗜热地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。通过对4株芽孢杆菌进行初步分析研究,可为后续试验以及微生态饲料添加剂的开发及应用奠定基础。     

脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp. A15木聚糖酶基因xynA15的克隆表达及性质研究

从云南保山市的一眼温泉中分离到一株嗜热嗜酸菌,脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.A15。通过同源克隆和TAIL-PCR方法,从该菌株中克隆得到一个木聚糖酶基因,xynA15,全长990 bp,编码329个氨基酸和一个终止密码子。将xynA15基因克隆到原核表达载体pET-22b(＋)上,并转化至BL21(DE3),经过IPTG诱导,其表达产物具有木聚糖酶的活性。对其酶学性质研究发现,XynA15的最适温度为50℃,最适pH值为70,不仅在较广的温度范围（35℃~60℃）内具有较高的酶活,而且在50℃具有较好的热稳定性。     

嗜热角蛋白降解菌的分离筛选及降解特性

为获得高效降解羽毛角蛋白的嗜热微生物，提高微生物降解角蛋白的效率，利用以羽毛角蛋白为唯一碳氮源的培养基从堆肥样品中分离降解菌，并对其菌种分类、粗酶液的酶学性质及降解角蛋白机理进行研究。通过选择培养基共筛选到5株高温降解菌，其中，菌株K-7降解性能和生物安全性能最佳。结合菌株形态特征、生理生化特征及16S rDNA系统进化树分析，鉴定该菌株为副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)。在含角蛋白底物培养基中，K-7的发酵上清液可检测到较强的角蛋白酶活，但未检测到明显的二硫键还原酶活；同时，在降解过程中，产生了大量的亚硫酸盐和巯基化合物，表明亚硫酸盐裂解是角蛋白二硫键断裂的主要方式。酶学特性结果显示，粗酶液的最适反应温度为50～70℃,最适反应pH值为7.0～8.0,粗酶液在80℃以下时热稳定较好，SDS、PMSF和EDTA等化学试剂对酶活有较强的抑制作用，而DTT、β-巯基乙醇对酶活性有显著的增强作用。研究结果扩展了副地衣芽孢杆菌的应用领域，丰富了嗜热角蛋白降解菌的菌种资源库。     

一株深海热液口超嗜热古菌的分类鉴定及高温酶活性研究

对一株分离自深海热液口古菌HJ21进行了分类鉴定及高温酶活性的研究.该菌株是极端嗜热的厌氧球菌,直径为1.0～1.2 靘.菌株最适生长温度88 ℃;菌株生长pH为5.0～9.0,最适pH为6.5～7.0;菌株生长NaCl质量浓度为10～50 g·L-1,最适为20 g·L-1.根据其形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列分析结果,确定HJ21菌株为热球菌属(Thermococcus).该菌株能产生高热稳定的高温α-淀粉酶、普鲁兰酶、α-葡萄糖苷酶和蛋白酶,这些酶的最适作用温度分别为95、95、100和100 ℃,α-淀粉酶、普鲁兰酶和α-葡萄糖苷酶在90 ℃的半衰期分别为5、5和2 h;蛋白酶在100 ℃保温2.5 h后仍具有84%的酶活性.