猪Toll样受体2基因的克隆和序列分析

本研究从猪肠系膜淋巴细胞中，克隆了猪Toll样受体2基因（pTLR2）。基因序列分析表明，克隆的pTLR2基因ORF为2358bp，编码785个氨基酸，合15．01％的亮氨酸，合有一段21个氨基酸的信号肽序列；与GenBank中登录的pTLR2序列（NM213761）的同源性为99．2％；与牛、马、绵羊和人的同源性较高，与家鼠、中国仓鼠相比次之．而与鱼类的最低。蛋白分子结构预测表明，该分子由胞外区（588个氨基酸）、跨膜区（23个氨基酸）和胞内区（174个氨基酸）组成，其胞外结构域由多个串联重复的LRR基序（XLXXLXLXX）组成，而胞内区合有与人白细胞介素1受体（IL-1R）高度同源的区域即TOLL／IL-1受体同源区（TIR），说明pTLR2分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用，这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。     

鸭TLR2基因的克隆、序列分析及其结构预测

参考鸡Toll样受体2(TLR2)基因序列设计6对特异引物,采用PC R方法从鸭基因组中扩增得到鸭TLR2基因全序列。结果表明:克隆的鸭TLR2基因编码区全长2 382 bp,由1个开放阅读框组成,编码793个氨基酸,其中亮氨酸为14.2%,含有24个氨基酸的信号肽序列,属于I型跨膜受体,具有富含亮氨酸的重复序列(LR R)和Toll/IL-1R(TIR)同源区结构域;与鸡、人、猪、鼠和牛TLR2基因的同源性依次为80.0%、63.5%、61.4%、60.0%和58.4%,表明该基因是一个比较保守的基因。     

猪Toll样受体5基因cDNA克隆、蛋白质序列分析及其意义

为了解猪Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和进化关系,本研究从肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪Toll样受体5基因的cDNA序列。序列全长2641bp,其中2571bp的开放阅读框编码856个氨基酸残基的猪TLR5,含17.4%的亮氨酸,并有一段19个氨基酸的信号肽序列;同源性分析结果显示,TLR5在进化过程中具有高度保守性,与人、牛、山羊、绵羊、小鼠和大鼠的氨基酸序列同源性分别为77.5%、79.6%、78.3%、81.0%、69.2%和68.9%。蛋白分子结构预测结果表明,该分子由胞外区(642个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(191个氨基酸)组成,胞外区具有LRR结构域,胞内区具有TIR结构域,表现出典型的TLR家族结构特征。表明猪TLR5分子具有病原分子模式识别和信号传导的作用,这为其结构与功能的进一步研究奠定了基础。     

猪Toll样受体3、7和8基因的克隆与序列分析

为了对猪Toll样受体(TLR)3、7和8基因进行克隆与序列分析,本实验从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中,利用RT-PCR方法分片段扩增猪TLR3、7、8基因,并克隆于pMD18-T载体中。根据测序结果分析,猪TLR3、7和8基因的ORF分别为2718bp、3153bp和3087bp,并分别编码906、1051和1029个氨基酸。同源性分析结果显示,它们与GenBank中登录的猪TLR的相应序列同源性达99%以上;与牛、马、羊和人的同源性较高,与鼠的同源性次之,与鸡的同源性最低,其蛋白分子结构预测表明猪TLR3、7、8均为跨膜蛋白。     

猪MyD88基因的克隆及其结构预测分析

应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从猪的脾脏淋巴细胞中克隆了猪MyD88基因(pMyD88)。基因序列分析表明,克隆的pMyD88基因含一个完整的开放阅读框(ORF),大小为882 bp,共编码293个氨基酸,分子质量33.28 ku,A+T=41.38%,G+C=58.62%。DNA Star软件分析发现,与GenBank上登载的猪AB292176核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.5%和100%,与其他物种的核苷酸序列同源性均在80%以上,说明MyD88基因在各物种间相对保守,在遗传系统发生上亲缘关系密切。对猪MyD88蛋白分子的结构预测发现,α-螺旋占41.3%,伸展结构占14.33%,无规则卷曲占44.37%;存在N端的死亡区和C端的Toll区两个结构域,表明MyD88是Toll受体的关键接头分子。     

猪Toll样受体7 cDNA的克隆及序列分析

本研究应用RT—PCR和RACE技术从肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪Toll样受体7（Toll—likere—ceptor7,TLR7）的cDNA序列。分析结果表明,克隆到的序列全长3834bp（GenBank登录号：EF469730）,其3150bp的开放阅读框编码1050个氨基酸残基的猪Toll样受体7蛋白。推导的氨基酸序列分析显示,在猪TLR7的胞外区,具有LRR-RI结构域,胞内具有TIR结构域,表现出典型的TLR家族结构特征,同源性分析结果显示,TLR7在进化过程中具有高度保守性,与牛、狗、人、猫和小鼠的氨基酸序列同源性分别为90．8％、87．4％、84．9％、86．7％和78．2％。     

水貂TOll样受体5编码区基因的克隆及序列分析

为了解水貂Toll样受体5(TLR5)蛋白的结构特征和遗传演化关系,采用RT-PCR方法从水貂肺脏组织总RNA中扩增出TLR5基因的片段,经拼接获得全长编码区序列。序列全长2 577 bp,编码858个氨基酸,含172%的亮氨酸,并有一段20个氨基酸的信号肽序列。蛋白预测结果表明,该分子具有亲水性,由胞外区(具有LRR结构域)、跨膜区和胞内区(具有TIR结构域)组成,表现出典型的TLR家族结构特征;同源性分析结果显示,与蒙眼貂同源性最高,达97%以上,与海象、大熊猫和北极熊同源性80%以上,与其他物种同源性大都在70%以上。水貂TLR5基因序列的成功克隆为进一步研究其在水貂机体免疫应答中的作用奠定了基础。     

猪大肠杆菌水肿毒素SLT-IIeA基因的克隆和序列分析

研究以本地猪水肿病大肠杆分离物ED1株为材料 ,利用 PCR克隆了含猪水肿病大肠杆菌 (VTEC) slt-IIe A基因 987bp的片段 ,并测定了含该克隆片段的 Bam HI、Hind 酶切片段的核苷酸序列。结果表明 ,slt-IIe A基因的编码区全长 960 bp,编码 3 1 9个氨基酸的蛋白质 ,序列与国外报导的 S1 1 79株进行比较发现其核苷酸同源性为 98.9%。经推导的氨基酸序列的同源性为 99.7%。这为进一步研究 slt-IIe A的生物学特性、水肿病的分子诊断及其防制打下基础     

禽流感病毒A/chicken/Mudanjiang/0823/2000(H9N2)株NP及M1基因的克隆及序列分析

参照已发表的A型禽流感核蛋白(NP)、基质蛋白(M1)基因序列及其基因组特性,设计合成了一条通用反转录引物和两对特异性引物,采用RT-PCR法,成功克隆了禽流感病毒国内分离株A/chicken/Mudanjiang/0823/2000(H9N2)株的NP、M1基因.序列测定结果为NP基因cDNA全长1497bp,编码498个氨基酸.M1基因cDNA全长759bp,编码252个氨基酸.将其序列与数株A型流感病毒(H9N2)NP及M1基因序列进行比较,NP基因同源性为90.51%～98.46%,氨基酸序列同源性为95.38%～98.59%.M1基因同源性为90.78%～97.36%,氨基酸序列同源性为95.63%～99.60%.     

鸭Toll样受体3基因克隆及序列分析

为研究鸭Toll样受体3(TLR3)的结构及功能,根据GenBank中已公布的番鸭TLR3(JQ910167.1)基因设计引物,采用RT-PCR从北京鸭外周血单个核细胞中克隆出北京鸭TLR3,命名为duTLR3。利用生物信息学技术预测其结构及功能,研究表明,duTLR3基因开放阅读框为2 688bp,编码895个氨基酸,富含17.0%亮氨酸;该分子属于Ⅰ型跨膜受体,由胞外区(1-695aa)、跨膜区(696-718aa)和胞内区(719-895aa)3部分组成,N端含有一个信号肽序列,胞外富含18个亮氨酸重复序列(LRR),胞内含有Toll/IL-1R同源区结构域。核苷酸序列同源性分析显示,duTLR3与金定鸭TLR3亲缘关系最接近达到99.6%;与番鸭、鹅、原鸡、斑胸草雀的亲缘关系次之,并同属于禽类分支上;与番鸭、鹅、原鸡、斑胸草雀、人、猕猴、狒狒、小鼠、大鼠、猪、牛、羊、猫亲缘关系渐远;与草鱼和鲤鱼亲缘关系最远。北京鸭体内组织分布结果显示,duTLR3为组成性表达。本研究成功克隆了北京鸭TLR3基因,预测分析并证实了duTLR3具有典型的TLR家族结构特征,为后期探究TLR3如何识别病毒的RNA及引起下游信号级联反应奠定了基础。     

水牛TLR4 cDNA全长的克隆及其生物信息学分析

本研究利用RT-PCR方法分段克隆水牛TLR4 cDNA后拼接成全长,并克隆于pMD20-T载体中,同时运用生物信息学软件对其核苷酸序列及编码蛋白质的结构进行分析和预测。结果表明,克隆的TLR4 cDNA ORF全长2526 bp,共编码841个氨基酸,N端具有由25个氨基酸组成的信号肽,该蛋白预测的分子质量为95.98 ku,等电点为6.37;水牛TLR4与GenBank中登录的水牛TLR4(DQ857349)核苷酸序列同源性达99.01%,与黄牛、绵羊、野猪、马、人和黑猩猩的同源性超过80%,与小鼠和狗的同源性次之,分别为72.17%和61.30%,与鸡的最低,仅为53.94%;该蛋白是由胞外区(1-634位氨基酸)、跨膜区(635-657位氨基酸)和胞内区(658-841位氨基酸)3部分构成的跨膜蛋白,胞外区含有12个LRR串联重复结构域、胞内区具有TIR结构域。本试验成功克隆了水牛TLR4 cDNA全长,并获得了核苷酸及其蛋白质的生物信息学分析数据,为进一步研究其功能奠定了基础。     

水貂PRLR基因的克隆及生物信息学分析

本研究旨在从水貂卵巢组织中克隆催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)基因编码区全长序列,并进行生物学信息分析,为研究其结构和功能奠定基础。根据GenBank中登录的犬PRLR基因的mRNA预测序列(登录号:XM_025436332.1)设计1对引物,采集性成熟的健康水貂卵巢组织样本,提取RNA并反转录合成cDNA,以cDNA为模板PCR扩增PRLR基因,将其插入pEASY-Blunt Simple Vector中,筛选阳性克隆测序后进行生物信息学分析。结果显示,水貂PRLR基因编码区序列全长为1 878bp,编码了625个氨基酸,水貂PRLR基因核苷酸序列与海獭同源性最高,为97.7%。系统进化树分析也显示其和海獭亲缘关系最近。对水貂卵巢PRLR基因编码蛋白进行生物信息学分析表明,PRLR蛋白含有1个信号肽,1个细胞外区域,1个跨膜区和1个膜内区;水貂PRLR蛋白为单次跨膜蛋白,其N端的D1部分含有2对保守的二硫键(Cys36—Cys46和Cys75—Cys86),D2部分含有保守的WS-基序(WS-E-WS)。水貂PRLR蛋白具有和其他PRLR蛋白相似的膜外和膜内结构。本试验结果为进一步研究和揭示水貂PRLR蛋白的结构及功能奠定了基础。     

猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ受体基因的克隆与序列分析

为研究猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ的生物学功能,本研究应用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞总RNA中克隆出猪FcγR Ⅲ的cDNA序列,并对其进行了分析。结果表明,克隆到的序列长820 bp,包含有1个771 bp完整开放阅读框(ORF),与GenBank中登录的猪FcγR Ⅲ序列(AF237453)的核苷酸同源性为99.9％;与人、牛、马、绵羊、猕猴、狗、猫、小鼠氨基酸同源性分别为61.6%、62.9%、55.3%、62.2%、63.0%、59.0%、61.8%和53.2%;蛋白质分子结构预测结果表明,该分子由信号肽（20个氨基酸）、胞外区(185个氨基酸)、跨膜区(23个氨基酸)和胞内区(28个氨基酸)组成,在胞外区存在2个Ig样结构域。猪肺巨噬细胞FcγR Ⅲ基因的成功克隆,为进一步研究其结构与功能奠定基础。     

桑树matK基因的生物信息学分析

利用生物信息学软件对桑树matK基因进行分析,对matK氨基酸序列的理化性质、疏水性/亲水性、信号肽、跨膜结构域、二级结构及同源建模、亚细胞定位、聚类分析、结合区进行预测分析,同时构建桑树等13种生物的同源树。结果表明：matK氨基酸序列由20种、505个氨基酸组成,无信号肽,为亲水性非跨膜蛋白,二级结构以α螺旋为主,无法进行同源建模,存在6种GO功能和9个结合区,亚细胞定位证实matK氨基酸序列只存在于真核生物叶绿体中,桑树等13个物种matK氨基酸序列具有高度的同源性。     

生物信息学软件预测猪氨基肽酶N功能与结构

[目的]研究猪δ冠状病毒(PDCoV)入侵宿主细胞的感染机制,对其特异性受体猪氨基肽酶N基因编码蛋白功能与结构进行分析.[方法]通过多种生物信息学软件对pAPN蛋白的理化特性、亲疏水性、信号肽、跨膜区、糖基化位点、抗原表位、功能结构域及结构特征等进行预测分析.[结果]pAPN基因总长为2892 bp,编码963个氨基酸...     

猪GRP78基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究

本研究旨在克隆猪葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）基因，并进行生物信息学分析，探讨其在猪不同组织中的表达情况。根据GenBank上公布的猪GRP78基因序列（登录号：XM_001927795.6）设计引物，PCR扩增及测序获得猪GRP78基因CDS序列，使用在线软件分析GRP78的理化性质、跨膜结构、信号肽、疏水性、保守结构域、二级结构和三级结构，并进行同源性比对及系统进化树构建，利用实时荧光定量PCR方法检测猪GRP78基因在各组织中的表达情况。结果显示，猪GRP78基因CDS区长1 965 bp，可编码654个氨基酸。生物信息学分析表明，GRP78理论分子质量为72.3 ku，等电点（pI）为5.06，半衰期为30 h，其水溶液在280 nm处的消光系数为30 495，肽链N端为蛋氨酸（Met），不稳定系数为32.39，属于稳定蛋白。脂肪系数为85.40，总平均疏水指数为-0.496，无跨膜结构，存在信号肽序列，说明该蛋白属于分泌型蛋白；GRP78蛋白只包含1个超家族保守结构域：HSP70结构域。蛋白二级结构分析显示，GRP78蛋白中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别为40.06%、20.49%、8.10%和31.35%。同源性比对结果显示，猪GRP78基因与人（登录号：NM_005347.4）、小鼠（登录号：NM_001163434.1）、大鼠（登录号：NM_013083.2）、山羊（登录号：XM_005687138.3）、牛（登录号：NM_001075148.1）核苷酸序列的同源性分别为93%、91%、90%、95%、95%，氨基酸序列的同源性分别为99%、98%、98%、99%、99%，各个物种之间GRP78基因保守性较高。实时荧光定量PCR结果显示，GRP78基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、卵巢、输卵管、乳腺、小脑、大脑、垂体等组织中均有表达，在心脏、脾脏、肺脏中相对高表达。本研究结果为今后深入研究GRP78基因的生物学功能提供了基础材料。     

猪DNM2基因克隆、序列分析与组织表达谱研究

本研究旨在对猪发动蛋白2（dynamin-2,DNM2）基因进行克隆和生物信息学分析,并探讨DNM2基因在猪不同组织中的表达情况。利用RT-PCR结合RACE方法克隆猪DNM2基因cDNA部分序列,与猪表达序列标签进行拼接,获得猪DNM2基因cDNA全长,并对其进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR检测DNM2基因在猪不同组织中的表达情况。结果表明,猪DNM2基因的开放阅读框（open reading fram,ORF）为2 616 bp,共编码871个氨基酸。DNM2相对分子质量为98 071.30,等电点（pI）为7.04;无信号肽和跨膜结构域,即该蛋白不属于分泌蛋白;DNM2蛋白的二级结构预测发现,构成α-螺旋、β转角、无规则卷曲、延展链的氨基酸数量分别为361、53、335和122个。多重分析结果显示,猪DNM2基因与牛、人、小鼠、大鼠的序列同源性分别为92.6%、91.8%、88.6%和89.3%;进化树分析表明,DNM2基因在物种间具有较高的保守性,不同物种间DNM2基因序列的差异符合物种间的进化性。实时荧光定量PCR结果显示,DNM2基因在脾脏中表达量较高,在乳腺、腿肌、输卵管、卵巢和子宫中表达量均较低。本研究结果为今后深入研究DNM2基因的生物学功能奠定了基础。     

Cloning,Sequence Analysis and Tissue Expression of Porcine DNM2 Gene

This study was aimed to clone porcine dynamin-2(DNM2) gene and analyze the gene structure using bioinformatics methods, the DNM2 gene mRNA level in different tissues was also investigated. We got the DNM2 gene cDNA sequence through stitching the expressed sequence tags (EST) and partial cloned sequence of DNM2 gene using RT-PCR and RACE methods. The mRNA level of porcine DNM2 gene in different tissues were detected with Real-time quantitative PCR. The results showed that DNM2 gene included an 2 616 bp whole length open reading frame (encoding 871 amino acids). DNM2 had a relative molecular mass of 98 071.30 and an isoelectric point (pI) of 7.04,and there was no signal peptide and transmembrane domain, therefore, it did not belong to the secretory protein. The DNM2 second structure contained α-helix (361 amino acids), β-sheet (53 amino acids), random coil (335 amino acids) and extended chain (122 amino acids). The sequence multi-aligned results showed that porcine DNM2 gene shared 92.6%, 91.8%, 88.6% and 89.3% of similar nucleotide sequence with that of cattle, human, mouse and rat, respectively. The phylogenetic analysis showed that DNM2 gene was highly conserved among species. Real-time quantitative PCR results indicated that the expression level of DNM2 gene was relatively higher in spleen while that was relatively lower in breast, leg muscle, fallopian tube, ovary and uterus. This research could provide the basis for the further study of the biological function of DNM2 gene.     

牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列（登录号：AF130119.1）设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（61.78%）,无规则卷曲次之（20.78%）。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。