猪链球菌2型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析

猪链球菌溶血素(SLY)是较早确定的猪链球菌毒力因子之一,具有细胞毒性,在猪链球菌致病过程中发挥重要作用。利用同源重组技术成功构建了猪链球菌2型(SS2)sly基因缺失的突变株SS2-Δsly,缺失株的体外溶血活性消失,对小鼠脑血管内皮细胞的细胞毒性显著低于亲本菌株(P<0.01),但不影响猪链球菌2型在巨噬细胞中的存活。该菌株可以用于研究SS2溶血素在感染细胞中的作用机制。     

胸膜肺炎放线杆菌flp基因缺失菌株的构建及生物学特性

flp(fimbrial low-molecular-weight protein)操纵子由13¹5个基因组成,在细菌中广泛存在,主要编码一种类菌毛(Flp菌毛)的束状纤维蛋白,与细菌在宿主中的黏附和定植有关。本试验利用同源重组技术获得了无抗性标记的猪胸膜肺炎放线杆菌血清Ⅰ型4074菌株的flp基因缺失菌株,通过对基因缺失菌株进行一系列的生物学特性研究,探索胸膜肺炎放线杆菌的flp基因功能。结果表明,flp基因的缺失不会对胸膜肺炎放线杆菌在体外的生长和其溶血活性产生明显影响,但能导致猪胸膜肺炎放线杆菌4074菌株丧失形成菌毛的能力;以小鼠为模型的动物试验结果显示,基因缺失菌株的致病力较亲本菌株有所降低。     

猪链球菌2型溶血素基因缺失菌株的构建及生物学特性的研究

溶血素(SLY)在猪链球菌2型(SS2)侵入和裂解细胞的过程中发挥重要作用,被认为是SS2的一种重要的毒力相关因子。为了探讨SLY在2005年中国四川资阳分离强毒株SS205ZY致病过程中的作用,作者利用同源重组基因敲除法成功构建了SS205ZY的sly基因敲除突变菌株(Δsly)。并比较了菌株的溶血能力以及对小鼠的致病力。结果表明sly基因敲除后可导致猪链球菌裂解红细胞的能力显著下降,对小鼠的致病力也有一定程度的减弱,但仍表现较高的致病力。本研究结果提示SLY是猪链球菌裂解细胞的重要毒力相关因子,但造成SS205ZY的高致病性很显然与多种毒力相关因子的协同作用有关。     

猪链球菌2型新毒力相关基因lin缺失菌株的构建

利用温度敏感型穿梭自杀质粒pSET4s,定点敲除猪链球菌2型野生型强毒株ZY458的lin基因,构建基因缺失突变菌株458△lin,利用家兔感染模型对ZY458及其突变菌株的生物学特性进行比较研究.家兔感染试验表明,接种ZY458菌株的家兔体质量下降,出现明显的临床症状,5只家兔4 d内全部死亡;而458△lin感染组家兔生长正常,未出现任何明显临床症状.结果表明,lin基因是猪链球菌2型新发现的一种毒力相关基因,在猪链球菌2型的致病过程中具有重要作用.     

鸡致病性大肠杆菌fimC基因缺失菌株的构建及生物学特性鉴定

本研究目的是研究fimC基因的功能。基于致病性大肠杆菌（APEC）Ⅰ型菌毛fimC基因的已知序列,通过PCR扩增了缺失169 bp的fimC基因片段,将其克隆到自杀载体pCVD442中,通过接合性转导将重组自杀性质粒pCVD442∷△fimC从大肠杆菌SM10λpir转到O2（Nal^R）中。根据同源重组原理构建了fimC基因缺失突变菌株O2（△fimC）。结合PCR扩增、测序结果及透射电镜观察,证明正确构建了fimC基因缺失突变株O2（△fimC）。体外生长及生化反应试验中,O2（△fimC）与亲本株存在一定差异。药敏试验中,两者无明显区别。鸡气管黏膜黏附试验及雏鸡的致病性试验表明：突变株在鸡气管黏膜上的黏附能力是亲本株的1/50,对雏鸡的致病性亦明显下降。鸡致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimC基因缺失突变株的构建为深入探讨fimC基因在鸡大肠杆菌致病过程中所起的作用、Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制及fimC基因缺失突变株其他生物学特性的研究奠定了物质基础。     

ORF2基因缺失的PCV2的构建与部分生物学特性

设计了1对特异性引物,从疑似PMWS（断乳仔猪多系统衰竭综合征）的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后形成重组质粒pMD18-T Simple-PCV2（命名为P-S-PCV2）。用ORF2特异的限制性内切酶EcoRⅠ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF2基因缺失突变的重组质粒（命名为P-S-PCV2-B）。用SacⅡ酶对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化的基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应的基因缺失病毒粒子（命名为PCV2-B）。用PCV2-B缺失突变株进行了细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究,结果显示,PCV2-B转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长。PCV2-B接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV-B突变病毒的感染。PCV2-B免疫仔猪后抗体没有升高;CD3＋和CD4＋整体水平下降,第2周与对照组差异显著;CD8＋与对照组差异不显著。结果表明,ORF2基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,免疫原性减弱,细胞免疫被部分激活。     

猪链球菌14型的分离鉴定及生物学特性研究

为了检测确定2019年5月河南某规模化猪场一栋保育仔猪发病猪群的病原,本研究从送检的发病猪关节液中分离获得1株细菌。通过细菌纯化培养、革兰氏染色、形态学观察及猪链球菌gdh基因PCR扩增,确定该分离菌株为猪链球菌。用猪链球菌分型引物对该菌株进行PCR扩增分型鉴定及软件比对分析,结果表明该分离菌株为猪链球菌14型,与猪链球菌JS14株（GenBank登录号：CP002465.1）同源性为100%。毒力基因检测结果表明,该菌株的同时携带有epf、mrp、sly、fbps、orf2毒力基因,属于高致病性菌株。小鼠致病性试验结果也证明该菌株是一株高致病性猪链球菌。药物敏感性试验结果显示,该菌株对β内酰胺类和喹诺酮类药物敏感,对氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类和磺胺类高度耐药,表现出多重耐药现象。对该菌株进行5大类24种耐药基因检测,该菌株同时携带有bla_TEM、aadA1、strA、strB、aacC2、aphA1、tet（B）、gyrA、parC、sul2耐药基因。该研究为后续进一步开展猪链球菌14型流行特点和致病机制研究奠定了基础,为猪链球菌14型临床防控提供了理论依据,同时具有重要的公共卫生意义。     

马疱疹病毒1型gp2基因缺失株的构建及生长特性分析

构建针对马疱疹病毒1型(equine herpesvirus-1,EHV-1)XJ2015株的转移载体pUC-gp2-LR和pUC-gp2-LR-EGFP;将EHV-1 XJ2015基因组与pUC-gp 2-LR-EGFP共转染至RK-13细胞,利用EGFP基因筛选获得EHV-1 XJ2015-gp2-/EGFP+毒株...     

猪链球菌2型感染动物模型研究进展

猪链球菌2型(SS2)是以败血症、脑膜炎、关节炎为主要特征的人兽共患病。该病不但对养猪业造成严重经济损失，也会给公共卫生和食品安全带来威胁，但由于其毒力因子和感染机制还不十分清楚，尚不能有效控制。不同动物模型的建立为研究病原的体内动态分布、感染机制、毒力因子及免疫应答等提供了依据。作者就国内外对SS2的造模方法及结果进行了介绍，并将不同动物模型的优缺点进行了比较，旨在掌握SS2动物模型研究的动态，为建立更有效的动物模型奠定基础。     

猪链球菌2型表面蛋白sp融合基因的构建与高效表达

利用PCR方法从猪链球菌2型四川资阳分离株449-1扩增出sp基因,克隆到pMD18-T载体中,构建出克隆载体pMD18T-sp。以SalⅠ和BamHⅠ从pMD18T-sp中切下目的sp基因片段并克隆到质粒pMAL-p2X中,构建重组表达质粒pMALp2X-sp,转化宿主菌TB1中进行诱导表达。分析表明sp基因序列比GenBank报道序列AY864331少了270 bp;SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组菌株表达出了136 Ku左右的目的蛋白MBP-Sao,目的蛋白为可溶表达,约占菌体蛋白总量的12.3%。表达的蛋白可用Amylose树脂纯化。将纯化的融合蛋白MBP-Sao免疫家兔,所得抗血清经ELISA检测,结果显示融合蛋白MBP-Sao包板抗体效价达1:16 000,且与猪链球菌2型和9型呈阳性反应,而与沙门氏杆菌及巴氏杆菌呈阴性反应。本试验对猪链球菌2型表面蛋白Sao的高效表达及其免疫原性进行了初步研究,为进一步研究猪链球菌2型表面蛋白Sao的结构和功能奠定了基础。     

猪链球菌2型分选酶srtC5基因敲除突变菌株的构建及其特性分析

构建猪链球菌2型（Streptococcus suis serotypc 2）强毒株ZY458分选酶srtC5基因敲除突变体并分析其特性。首先通过重叠延伸PCR技术扩增AsrtC5片段,该片段携带srtC5编码基因及其上下游部分序列,但是中间缺失212bp序列。随后构建重组自杀载体pSET4s：：△srtC5,并将其电转化导入ZY458菌株,通过同源重组获得△srtC5突变体。通过体外的细胞黏附试验和体内的家兔攻毒试验证明△srtC5突变体比较野毒株,其细胞黏附能力和对家兔的致病性都显著降低。     

猪链球菌2型HA0609的分离及致病性研究

从江苏省某屠宰场猪的扁桃体中分离到1株细菌,通过培养特性、菌体形态、菌落形态、染色特性、生化试验以及荚膜多糖(cps)基因的PCR检测,确定为猪链球菌2型,命名为HA0609。本试验针对猪链球菌7种主要毒力因子——谷氨酸脱氢酶(gdh)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)、次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(impdh)及毒力相关序列orf2,进行PCR检测。与已知强毒株比较,该菌株2种主要毒力因子sly和epf均为阴性。动物试验显示HA0609对猪、兔和Balb/c鼠均无致病性。     

猪链球菌2型05ZYH33菌株具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性蛋白的鉴定及功能研究

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株是否具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)及同工酶,本研究通过同源蛋白比对,发现05ZYH33菌株表面蛋白SSU050630 C端Ss GH20结构域与肺炎链球菌(S.pneumoniae)的NAG Str H的GH20-1结构域具有60%的同源性;经基因克隆、蛋白表达及纯化后的酶活性分析表明Ss GH20具有NAG活性,且其活力为371 U/mg蛋白;其最适反应温度为50℃、最适p H为5.5;其Km值为0.69。通过构建SS2 ssu050630基因缺失株及全菌酶活性测定,显示SS2 05ZYH33菌株具有NAG活性,而ssu050630基因缺失后的菌株则失去了NAG活性,表明SSU050630是SS2 05ZYH33菌株唯一具有NAG活性的蛋白。本研究为进一步探究Ss GH20在SS2致病中的作用及SS2逃避宿主免疫反应的机制奠定了基础。     

一株猪链球菌的分离与鉴定

从疑似发生猪链球菌病患猪的肺脏和淋巴结中分离到1株细菌。该细菌经形态学观察、培养特性、溶血试验、生化试验和动物试验鉴定为偏向厌氧型链球菌。该菌株对小白鼠存在致病性。药敏试验表明：分离菌株对阿莫西林和先锋V高度敏感,对菌必治、呋喃妥因、磺胺类药中敏,对青霉素、链霉素、卡那霉素和恩诺沙星等药物不敏感。     

猪链球菌精氨酸脱亚氨酸酶序列分析及其PCR检测

对9株猪链球菌2型重庆分离株的精氨酸脱亚氨酸酶基因进行克隆测序,结果表明该基因长度为1231bp,与Genbank发表的该基因序列相比,核苷酸同源性高于99%,推导的氨基酸同源性高于96%。根据精氨酸脱亚氨酸酶基因的测序结果建立扩增片段长度为237bp的PCR检测方法,35株猪链球菌致病株中,30株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,有5株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;14株正常猪扁桃体分离株中,11株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性,3株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性;猪链球菌1型、7型、9型、13型、1/2型各一株,均能扩增出精氨酸脱亚氨酸酶基因的片段。     

血清2型猪链球菌河南分离株毒力基因的鉴定及其cps2j全基因序列分析

为了解血清2型猪链球菌(S.suis2)河南分离株的毒力基因型及cps2j全基因突变情况,本研究扩增S.suis2毒力基因gdh、cps2j、mrp、ef 、sly、orf2和fbps,并对s.suis2的cps2j进行全基因序列测定和同源性分析.结果表明,gdh、cps2j、mrp、ef、sly、orf2和fbps基因在8个S.suis2分离株中的检出率分别为100％(8/8)、100％(8/8)、62.5％(5/8)、75％(6/8)、87.5％(7/8)、100％(8/8)和100％(8/8);其中cps2j全基因核苷酸及推导的氨基酸序列与来源不同的S.suis2分离株同源性分别达98％和97％以上,以该基因构建的系统发育树表明8株S.suis2河南分离株与国内外不同参考株同源性高,亲缘关系密切.     

猪种布氏杆菌WboA基因缺失株对绵羊的免疫剂量及免疫程序研究

为优化猪种布氏杆菌WboA基因缺失株(B.suisΔWboA)对绵羊的免疫条件,本研究采用1岁左右的成年雌性绵羊对B.suisΔWboA的免疫剂量及免程序进行了比较研究。实验分5个组进行,其中A、B、C 3个试验组分别以2倍剂量重复接种、4倍剂量重复接种和单剂量1次接种B.suisΔWboA,D组单剂量1次接种猪种布氏杆菌S2疫苗株(B.suis S2),E组为空白对照组。各组羊首免后7 d、21 d和35 d分别采血,测定血清抗体水平;在首免后35 d,分别采用布氏杆菌强毒菌M28株(B.melitensis M28),经腹股沟皮下注射攻毒。攻毒后28 d,分别取试验羊的脾脏分离攻毒菌株。所有试验羊,在实施攻毒前,其精神、食欲均正常。血清抗体测定结果表明,在二免7 d、21 d后,A组和B组试验羊的抗体水平明显高于C组,而且均超过D组试验羊的抗体水平。攻毒后的细菌分离结果表明,攻毒后28 d,A组和B组试验羊的脾脏细菌分离数量明显低于C组试验羊,并且均低于D组试验羊的细菌分离水平。实验结果表明,B.suisΔWboA的免疫剂量由单倍改为2倍或4倍,免疫程序由单剂量1次改为2倍或4倍剂量2次,可以明显提高免疫效果,并达到与亲本疫苗菌株B.suis S2的免疫水平。