猪链球菌2型sortase蛋白缺失株的构建及其毒力分析

为了研究对猪链球菌2型致病力的影响,试验构建srtA基因缺失株,体外观察突变株05ZYH33△srtA的基本生物学性状,并以猪为动物模型检测突变株05ZYH33ΔsrtA的毒力。结果表明:成功构建了srtA基因缺失株,突变株生物学性状无明显改变,毒力相对于亲本株有所下降。说明了srtA基因对菌株的生物学性状无明显影响,可能是猪链球菌2型潜在毒力因子。     

猪链球菌2型新毒力相关基因lin缺失菌株的构建

利用温度敏感型穿梭自杀质粒pSET4s,定点敲除猪链球菌2型野生型强毒株ZY458的lin基因,构建基因缺失突变菌株458△lin,利用家兔感染模型对ZY458及其突变菌株的生物学特性进行比较研究.家兔感染试验表明,接种ZY458菌株的家兔体质量下降,出现明显的临床症状,5只家兔4 d内全部死亡;而458△lin感染组家兔生长正常,未出现任何明显临床症状.结果表明,lin基因是猪链球菌2型新发现的一种毒力相关基因,在猪链球菌2型的致病过程中具有重要作用.     

单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究

为了研究srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2毒力的影响,本研究利用同源重组技术构建了LM90SB2 srtA 基因缺失株LM90SB2-ΔsrtA,比较分析了亲本株LM90SB2与缺失株LM90SB2-ΔsrtA对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC 4种细胞系的粘附、侵袭、胞内增值能力及LM90SB2和LM90SB2-ΔsrtA 感染小鼠后,小鼠的LD50及肝脏、脾脏、脑载菌量变化差异。结果显示,本研究成功构建了srtA 基因缺失株;与亲本株LM90SB2比较,缺失株LM90SB2-ΔsrtA 对RAW264.7和SIEC的粘附率、侵袭率及胞内细菌数量均下降,且差异具有显著统计学意义(p <0.05);小鼠 LD50降低了21.38倍,肝脏、脾脏载菌量降低,差异具有显著统计学意义(p <0.05)。本研究结果表明,srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2的毒力具有关键作用,参与粘附、侵袭BMEC,该研究结果为进一步阐明单增李斯特菌毒力因子的致病机制提供理论依据。     

无乳链球菌dnaJ基因缺失株的构建及其致病性研究

为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001(登录号:NC_018646)目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD_(50)为5.68×10~4 CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。     

鸭疫里默氏杆菌对鸭胚肝细胞粘附入侵能力的研究

为了分析鸭胚肝细胞用于鸭疫里默氏杆菌粘附入侵实验的可行性,本研究比较了鸭疫里默氏杆菌对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附和入侵能力。首先将构建的互补质粒pRES1-ompA通过双亲本接合转导的方法导入ompA基因缺失株Th4ΔompA中,构建得到缺失株的回复菌株cTh4ΔompA;然后比较了野生株Th4、缺失株Th4ΔompA及回复株cTh4ΔompA菌株对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附入侵能力。结果表明,与野生株Th4菌株相比,缺失株Th4ΔompA对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附能力分别降低了3.32倍和3.12倍,入侵能力分别降低了2.25倍和7.58倍,而cTh4ΔompA对鸭胚肝细胞和Vero细胞的粘附入侵能力均得到部分回复。本研究结果表明鸭胚肝细胞可用于鸭疫里默氏杆菌粘附入侵能力的分析。     

猪链球菌2型Ⅲ型溶血素的研究

为了探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的Ⅲ型溶血素是否具有溶血活性以及Ⅲ型溶血素在SS2致病过程中的作用,本研究利用同源重组基因敲除法成功构建了SS205ZY的Ⅲ型溶血素(slyrp)基因缺失突变菌株△slyrp及双基因缺失突变菌株△sly/△slyrp,并比较了野生菌株和基因缺失突变菌株的溶血能力以及对小鼠的致病力.结果表明,slyrp基因敲除后可导致SS2裂解红细胞的能力有所下降,而双基因缺失突变菌株△sly/△slyrp的溶血能力完全丧失;slyrp基因敲除后对小鼠的致病力没有影响.结果提示猪链球菌2型Ⅲ型溶血素具有一定的溶血能力,该Ⅲ型溶血素在SS2感染过程中,对溶血素(sly)起协同作用,不是SS2主要的毒力相关基因.     

potA基因缺失对猪链球菌2型生物学特性及致病性影响的研究

为了探究potA基因对猪链球菌2型(SS2)生物学特性和致病性的影响,本研究利用同源重组系统构建potA基因缺失突变株(△potA),并经PCR和western blot鉴定.采用显微镜观察、生长曲线测定和平板计数等方法比较△potA和野生SC-19菌株的细胞形态和生长速率.结果显示,相比于SC-19菌株,△potA菌...     

鸭疫里默氏杆菌类似crp基因的鉴定及其突变株对雏鸭免疫效果的评价

旨在鉴定鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)中的crp基因,并探究该基因与菌株毒力的关系,了解crp基因突变株的免疫保护效力,为开发新型R.anatipestifer减毒活疫苗奠定基础。采用P-BLAST在R.anatipestifer蛋白质组中搜寻与沙门菌crp基因相似的蛋白基因,发现R.anatipestifer CH-1株的B739-0373基因与沙门菌crp基因相似度为45%;将B739-0373基因克隆到表达载体上,并回补到沙门菌Δcrp突变株中,利用麦芽糖-麦康凯培养基颜色反应对其糖代谢功能进行鉴定,结果发现该基因可完全回补沙门菌自身crp的缺失,推测R.anatipestifer CH-1株的B739-0373基因具有类似沙门菌crp基因的功能;利用同源重组和自杀质粒,构建R.anatipestifer CH-1Δcrp突变株,比较野生及突变株的生长情况和毒力(包括黏附率、侵染率、LD_(50)、在雏鸭肝脑中的定殖能力),结果表明,crp基因的缺失使菌株生长变得缓慢,黏附力(P0.01)和侵染力(P0.001)显著下降,对雏鸭的半数致死量(LD_(50))显著提高,在雏鸭肝脏、脑中定殖能力也显著下降(P0.01);在CH-1Δcrp突变株免疫雏鸭后7,14,21 d,检测雏鸭血清中IgG水平,并以R.anatipestifer野生株对免疫后的雏鸭进行肌注攻毒,观察其临床症状和免疫保护率,发现Δcrp突变株能刺激雏鸭产生高水平的IgG抗体(P0.01),对雏鸭的免疫保护率为100%。综上表明, B739-0373基因鉴定为R.anatipestifer CH-1株的类似crp基因,可全局调控该菌株的生长和毒力;安全剂量的CH-1Δcrp突变株可诱导雏鸭产生较强的免疫保护效力,可作为新型减毒活疫苗的候选菌株。     

鱼源鲁氏耶尔森菌mobBC基因无痕缺失株的构建及其毒性研究

为探究鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)的四型分泌系统(T4SS)中mobBC基因的作用,本研究构建了强毒力Y.ruckeri SC09菌株mobBC基因的无痕缺失株并研究了其生理变化和毒性影响。将mobBC基因上、下游同源臂克隆入自杀载体pLP12并转化供体菌β2163,得到pLP12-mobBC/β2163,进一步通过接合转移,将pLP12-mobBC导入受体菌株SC09中。利用抗性筛选和vmi480反向筛选获得无痕缺失株Y.ruckeriΔmobBC,并进行PCR测序鉴定。同时构建回补株Y.ruckeriΔmobBC+p Mob BC。通过电子显微镜观察缺失株形态变化,同时绘制野生型菌株、缺失株和回补株的生长曲线;将缺失株和野生型菌株感染模式小鼠,初步研究mobBC毒性;将野生型菌株、缺失株和回补株感染虹鳟鱼,进一步研究其对水生动物的体内毒性;对虹鳟鱼主要感染组织进行细菌计数并分析菌株在感染组织的分布差异;观察感染缺失株和野生型菌株的虹鳟鱼组织病理学和免疫组织化学差异,进一步分析毒性影响。结果显示,本实验构建了无痕缺失株Y.ruckeriΔmobBC,并回补了mobBC基因。缺失株与野生株超微结构对比变化不显著,但缺失株的生长性能弱于野生株和回补株,且表现出较弱的体内毒性和较轻的组织感染力。这提示mobBC基因可能是Y.ruckeri重要的毒力基因,该基因的缺失能够有效降低Y.ruckeri的增殖力和对宿主的感染力。本文首次研究了水产病原菌Y.ruckeri SC09的mobBC基因的毒性作用,为该病原菌的毒力研究增加了新的基础。     

猪链球菌2型新型毒力调控因子RfeA的研究

猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病原菌,在33个血清型中,2型(SS2)毒力最强、分布最广,但其具体的致病机理尚不完全清楚。前期的比较基因组学研究表明,RTX family exoprotein A gene(rfe A)只存在于强毒菌株中,基因生物信息学分析发现rfe A与epf-like位于同一操纵子上,且与传统毒力因子ef邻近,PCR方法检测表明rfe A在猪链球菌2型中分布广泛。为了研究rfe A的致病机制,利用同源重组构建了rfe A的基因缺失株Δrfe A和互补株CΔrfe A,并通过斑马鱼模型对缺失株、互补株和野生株的毒力进行评估,发现缺失株毒力增强,表明rfe A可能是SS2的一个新调控因子,或者可能影响其他调控因子。     

兔支气管败血波氏杆菌PRN基因缺失突变株的构建及特性研究

利用自杀性质粒构建兔支气管败血波氏杆菌百日咳黏附素(PRN)缺失突变株以研究PRN在支气管败血波氏杆菌(Bb)致病机理中的作用,同时为支气管败血波氏杆菌病减毒活疫苗的研究提供理论依据.PCR扩增出PRN1(PRN上游基因)和PRN2(PRN下游基因)2个目的基因片段,运用基因重组技术将庆大霉素抗性基因(GM)连接到PRN1和PRN2之间,将连接好的基因片段克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性载体pMEG375-PRN1-GM-PRN2,将其转化到宿主菌SM-10中,通过宿主菌SM-10与受体菌Bb固相滤膜交配,自杀性载体转移到受体菌,根据同源重组原理,抗性筛选得到基因缺失突变株,命名为Bb(△PRN).对突变株Bb(△PRN)与野生株WT进行了遗传稳定性、生长特性、溶血特性、细胞黏附特性、毒力、免疫保护性等比较研究.结果表明:Bb(△PRN)具有遗传稳定性;与野生株相比,突变株生长速度较慢,毒力有所下降,溶血活性及对Hep-2细胞的黏附能力没有明显变化;小鼠免疫原性试验结果显示,突变株免疫小鼠后可以产生强有力的免疫力,能够抵抗野生株的攻击.Bb(△PRN)突变株构建成功并具有良好的免疫原性,为支气管败血波氏杆菌病减毒活疫苗的研究奠定了基础.     

Disruption of srtA gene in Streptococcus suis results in decreased interactions with endothelial cells and extracellular matrix proteins

Streptococcus suis, a major pathogen of swine, is an emerging zoonotic agent which causes meningitis and septic shock. In this study, we investigated the ability of S. suis mutant strain (SRTDeltaA) lacking the sortase A gene (srtA) to interact with host cells and extracellular matrix (ECM) proteins, as well as its virulence in a mouse infection model. We demonstrated that mutant SRTDeltaA had reduced capacity to adhere to and invade porcine brain microvascular endothelial cells compared to the wild-type strain. In addition, mutant SRTDeltaA also showed significantly less adherence to plasma fibronectin, cellular fibronectin and collagen type I. However, disruption of srtA had little effect on the virulence of S. suis in a mouse intraperitoneal model of infection. These results indicate that surface proteins anchored by sortase A are required for a normal level of bacterial binding. However, other factors may also be important for S. suis virulence and interaction with host tissues.     

副猪嗜血杆菌qseB、qseC双基因缺失株的构建及生物学特性

QseBC双组分系统(QseBC two-component regulatory systern)与细菌中的群体感应相关,是肠杆菌科和巴斯德氏菌科中的全局性毒力调控因子,但在副猪嗜血杆菌(Glaesserella parasuis)中的作用还不清楚.本研究利用自然转化法构建SC1401的双基因缺失株(△qseBC)....     

The two-component regulatory system CiaRH contributes to the virulence of Streptococcus suis 2

Two-component regulatory systems (TCSs) are widely distributed among bacteria and enable the organisms to make coordinated changes in gene expression in response to a variety of environmental stimuli. In this work, we constructed a mutant strain of the TCS CiaRH and measured its virulence in vitro and in vivo. Compared with the wild type strain, the mutant strain exhibited a significant decrease in adherence to epithelial cells Hep-2 and PIEC. Furthermore, the deletion of CiaRH not only enhanced the bactericidal activity of RAW264.7 macrophage against Streptococcus suis 2, but also increased blood clearance of S. suis 2 in vivo. More importantly, the mutant was attenuated in vivo in CD1 mice and pigs, with reduced mortality, morbidity and impaired bacterial growth observed in specific organs. These results suggest that the CiaRH is required for S. suis 2 virulence.     

鸭疫里默氏杆菌50S L27转座子插入突变株的生物学特性分析

为了鉴定鸭疫里默氏杆菌中与卡那霉素抗性相关的基因,本研究采用构建Yb2株转座子随机突变库结合卡那霉素抗性平板来筛选相关抗性基因.先以Yb2株为受体菌,携带质粒pEP4351的大肠杆菌BW19851(pEP4351)为供体菌,构建转座子Tn4351随机突变库.用含红霉素和卡那菌素的TSA进行筛选,得到卡那霉素耐药性降低的...     

猪伪狂犬病病毒双基因缺失突变株(HB-98株)安全性、稳定性和免疫原性测定

对以伪狂犬病病毒鄂A株为亲本毒株构建的TK和gG双基因缺失突变株（PrV HB-98株）的增殖能力、安全性、毒力稳定性和免疫原性进行了测定。结果表明，PrV HB-98株在BHK-21细胞上的增殖滴度为10^7.0 TCID50／0．1mL以上，与亲本毒株相当，但高于Bartha株；与PrV鄂A株相比，病毒量为10^7.0TCID50的PrV HB-98株不引起BALB／c小鼠的死亡，毒力也低于Bartha株；将PrV HB-98株在PK-15细胞连续培养25代和在猪体内上连续继代5次，各代次突变株TK基因和LacZ基因能被稳定扩增，未出现毒力回复现象．表明该毒株具有良好的遗传稳定性；以10^5.0、10^6.0、10^7.0TCID50等3个不同剂量的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，母猪均能正常产仔．仔猪也未出现任何临床症状，证明该毒株有较好的安全性。另外，以10^5.0TCID50的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，分别于接种后28d和20d，用10^7.0TCID50 PrV鄂A强毒进行攻击．结果免疫猪都能抵抗强毒的攻击．获得保护，表明该毒株具有很强的免疫原性。综合上述结果表明，PrV HB-98株可以作为候选毒株．用于伪狂犬病基因工程疫苗的研制。     

鸭疫里默氏杆菌MFS外排泵rant基因缺失株的构建及其介导的耐药性

旨在构建鸭疫里默氏杆菌rant基因缺失株及回复株,明确MFS外排泵Rant对鸭疫里默氏杆菌耐药性的影响。本研究以鸭疫里默氏杆菌RA-LZ01株为研究对象,通过自杀质粒pRE112介导的同源重组,以红霉素抗性标记进行正向筛选,获得基因缺失株Δrant,并以大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌穿梭质粒pCPRA作为载体,构建回复株cΔrant。采用微量肉汤稀释法测定11类临床常用抗生素对野生株、缺失株及回复株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）,并测定3株菌的生长曲线,评价菌株对雏鸭的致病能力。结果表明,与野生株和回复株相比,四环素类抗生素对缺失株的MIC值明显下降,其他类抗生素的MIC值无变化;缺失株的生长速率明显下降;rant基因的缺失显著降低鸭疫里默氏杆菌的毒力。结果提示,鸭疫里默氏杆菌rant基因介导四环素类抗生素的外排,并可明显影响鸭疫里默氏杆菌的生长和毒力。     

布鲁氏菌vceA基因缺失株的构建及生物学特性研究

试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。