口蹄疫病毒P1-2A和3C蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为研制口蹄疫病毒(FMDV)的新型重组腺病毒疫苗,本研究通过RT-PCR扩增FMDV GD株3C、P1、P1-2A、L-P1和L-2A基因,分别构建重组腺病毒穿梭质粒,并在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183E.coli中同源重组获得腺病毒重组质粒pAd-3C、pAd-P1、pAd-P1-2A、pAd-L-P1、pAd-L-2A,经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得含有目的基因的重组腺病毒。将具有感染能力的复制缺陷型重组腺病毒rAd-3C分别与rAd-P1、rAd-P1-2A、rAd-L-P1、rAd-L-2A共感染Vero细胞,裂解细胞收集细胞上清液并进行小鼠免疫试验。经ELISA检测表明,重组腺病毒rAd-3C分别与rAd-P1-2A、rAd-L-2A共感染Vero细胞上清液能够诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有0型口蹄疫病毒P1—2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体。首先将P12A、3C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle—CMV上,再将重组穿梭质柱用Pinel线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv—P12×5c和pAdcmv—p12×3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中。重组腺病毒质粒经Pacl线性化后转染HEK295细胞,转染1w内细胞出现典型病变。取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24～48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行PCR和RT—PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达。取第4、6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在。本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP1基因siRNA重组腺病毒的构建及其介导的RNAi抑制口蹄疫病毒复制的研究

本研究选择O型FMDV VP1基因上保守序列作为可能的干扰位点,合成了siRNA,将siRNA克隆到pSIREN-Shuttle中,获得siRNA重组表达载体pShuttle-VP1。用限制性内切酶PI-Sce I和I-Ceu I双酶切siRNA重组表达载体和腺病毒质粒载体pAdeno-X,利用体外连接法获得了重组质粒。经过PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,证明成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-VP1。利用脂质体转染法,将Pac I线性化的重组腺病毒质粒pAdeno-VP1转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAdeno-VP1。经过PCR鉴定正确后大量增殖,增殖的重组腺病毒经过浓缩、纯化得到了高滴度的病毒。用终点稀释法测定病毒滴度为2.5×109PFU/mL。将rAdeno-VP1感染IBRS-2细胞后,12 h后再加入100TCID50的FMDV O/HKN/2003。结果显示,重组腺病毒能够抑制FMDV的复制。     

表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。     

猪O型口蹄疫病毒P1/3C基因共表达重组腺病毒的构建与鉴定

通过PCR和RT-PCR扩增出目的基因,将FMDV P1和3C基因通过IRES串联,构建出重组腺病毒穿梭质粒,在BJ5173细菌中同源重组获得同源重组腺病毒质粒,转化XL1-Gold超级感受态细胞以扩大培养,PacⅠ酶切后转染AD-293细胞,纯化获得了重组腺病毒。该重组腺病毒于AD-293细胞连续传代培养,初步浓缩后TCID50为1010.71/mL。应用O型口蹄疫病毒阳性血清进行间接荧光抗体试验,病毒感染的AD-293细胞可见清晰荧光,证明该重组腺病毒对目的基因进行了成功的表达,为FMDVP1/3C基因共表达腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因，继而构建出真核表达载体pVAX—VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上，筛选出VPl表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子，获得转移载体。再经酶切，连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞，转染3次后，细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定，证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2／FMDV。经验证，该重组毒可稳定遗传，其毒价为10^3.5TCID50／mL。     

口蹄疫病毒多基因腺病毒穿梭质粒的构建

采用分步扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因P1—2A、3C蛋白酶基因和3D聚合酶基因按正确的读码框依次连接克隆入pGEM-T载体。然后，将切取的目的基因亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle—CMV。构建成功的2个重组穿梭质粒经测序鉴定，含有完整的目的基因表达盒。穿梭质粒可与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组，以产生重组腺病毒载体。     

猪O型口蹄疫基因工程疫苗候选株的构建及其免疫原性分析

近年来,O型口蹄疫病毒已演化出多种谱系.目前应用的疫苗已不能有效保护多谱系口蹄疫的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难.为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,构建了含VP3(58位)和VP1(43、48、137、139、140、141和142位)氨基酸改造的全长克隆.线性化的全长cDNA和T7RNA聚合酶质粒共转染BHK细胞后获得拯救病毒.RT-PCR和乳鼠致病性试验表明拯救病毒遗传稳定,具有与亲本病毒相似的致病性.用拯救的基因工程病毒灭活疫苗免疫猪28 d后分别用中国谱系、泛亚谱系和缅甸98谱系猪源毒的流行毒攻击,结果均获得了完全保护(16/16).O/HN/93灭活疫苗免疫猪能完全保护泛亚谱系和缅甸98谱系猪源病毒的攻击(16/16),但不能完全保护(12/16)中国谱系猪源病毒的攻击.结果表明基因工程病毒制备的灭活疫苗提高了对中国型猪源谱系病毒的免疫保护,拓展了抗原谱,是具有良好开发前景的疫苗候选株.     

表达猪流感病毒血凝素基因的重组腺病毒的构建及免疫原性分析

通过细菌内同源重组的方法成功构建了表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素的重组腺病毒。首先将血凝素基因亚克隆到穿梭载体质粒pAdeno Vator-CMV5-IRES-GFP上，与腺病毒基因组质粒pAdeno Vator△E1／E3共转化大肠杆菌BJ5183菌株，经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd—HA—GFP。将该重组质粒转染293细胞以包装重组腺病毒。根据报告基因GFP的表达及Western-blot分析，证明获得了可正确表达猪流感病毒血凝素的重组腺病毒rAd—HA—GFP。重组腺病毒经一次性腹腔注射接种昆明鼠，2周后可检测到血凝抑制抗体，并且抗体至少可以持续12周，证实重组腺病毒介导表达的血凝素蛋白具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体。     

共表达O型FMDV衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达。应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行western blot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割。重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性。上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路。     

表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性

利用RT-PCR、同源重组等技术构建了含有猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因上3个片段的重组腺病毒质粒pAd-S98～638,pAd-S1～638,pAd-S49838～1384,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬宽纯化分别获得了重组腺病毒rAd-s498～638,rAd-S1～638,rAd-S498～1384.重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代效价稳定,TCID50分别为每毫升10-6.29、10-5.75、10-6.5.应用猪流行性腹泻病毒阳性血清进行间接免疫荧光抗体试验,在3个腺病毒感染的HEK-293A细胞的胞质见有清晰荧光.将3个重组腺病毒分别免疫小鼠,结果均诱导产生较强的体液免疫应答.结果表明这3个重组腺病毒对S基因的3个片段均可成功表达,并具有较好的免疫原性,为PEDV重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础.     

表达狂犬病病毒糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒的构建

利用大肠杆菌内质粒间同源重组的方法,将狂犬病病毒G基因插入腺病毒基因组的E1基因区,构建了带有狂犬病病毒G基因的重组腺病毒质粒。重组质粒经Pme酶切,线性化后转染293细胞,成功获得了均一的复制缺陷型重组腺病毒。荧光显微镜下能观察到重组腺病毒GFP报告基因的表达。用PCR方法证实了重组腺病毒基因组中含有G基因,RT-PCR方法可检测到G基因的转录产物mRNA,Westernblotting方法能检测到重组腺病毒在29细胞中表达的G蛋白。此重组腺病毒在293细胞连续传代10次,PCR方法都能扩增出G基因目的条带。试验结果表明,狂犬病病毒G基因已成功重组到腺病毒基因组中,不但能稳定表达,而且能在重组腺病毒基因组中稳定存在。     

携带猪呼吸道冠状病毒S基因片段的重组腺病毒的构建及鉴定

利用RT-PCR技术扩增猪呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory coronavirus,PRCV)AR310毒株的S基因主要抗原位点片段,构建了重组腺病毒中间载体pDNR-1r-S1和表达质粒pInt.AV1.SpaT-S1。采用Cre-LoxP同源重组腺病毒系统和共转染技术构建了携带PRCV S基因片段的复制缺陷型重组腺病毒,经目的基因PCR检测和序列测定,结果表明:PRCV S基因片段已正确地插入到腺病毒基因组中;Western blot和间接免疫荧光实验证明目的片段在HEK293细胞中成功地获得了表达;子代重组腺病毒Ad5-PRCVS1的滴度为7×107 TCID50/mL。携带PRCV S基因片段重组腺病毒的构建为PRCV和TGEV重组腺病毒新型疫苗的研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因重组腺病毒的构建及特性研究

将克隆的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）全长S基因插入pAdTrack—CMV穿梭质粒中，形成的转移质粒pAdTrack—CMV／S线性化后，用pAdEasy^TM系统电转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠埃希氏菌BJ5183，经同源重组，构建了含有全S基因的重组腺病毒载体，经酶切充分暴露反向末端重复序列后，与脂质体混合转染AD-293细胞，成功获得了AD-S复制缺陷型腺病毒，经检测证实，AD-S稳定性好，安全性高。转录水平检测证实，S基因得到了转录；荧光检测发现，外源蛋白已得到表达。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组腺病毒的构建

为构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要免疫原S1蛋白的重组腺病毒,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以IBVCK/CH/LHLJ/04V株S1基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组法构建了一株稳定表达IBVS1蛋白(90ku)的重组腺病毒,命名为rAdV-S1。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及western blot检测证实S1蛋白在重组腺病毒中获得表达。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该重组病毒的毒价为108.25TCID50/mL,并且两者在生长动力学方面无显著差异。本研究为动物试验和该重组腺病毒免疫特性的研究奠定基础。