大麦条纹花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是我国进境植物检疫性有害生物。为提高大麦条纹花叶病毒检测的灵敏度和特异性,缩短检测周期,根据该病毒不同分离株外壳蛋白（coat protein, CP）基因的保守序列设计特异性的引物和探针,建立了BSMV的实时荧光RT-PCR检测方法。结果表明,本检测方法特异性强,对南方菜豆花叶病毒Southern bean mosaic virus（SBMV）、小麦线条花叶病毒Wheat streak mosaic virus（WSMV）、玉米褪绿斑驳病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、烟草环斑病毒Tobacco ringspot virus（TRSV）、菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和番茄环斑病毒Tomato ringspot virus（ToRSV）6种病毒均无交叉扩增;且检测方法灵敏度高,对RNA模板的最低检测限达到5×10-4 ng/μL,与双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）和普通RT-PCR相比,本方法的灵敏度分别提高了10倍和100倍。此外,我们利用该方法对12批进口大麦进行检测,发现6批大麦中检出大麦条纹花叶病毒,占比约50%。总之,本研究建立的荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强等优点,适合于BSMV的快速检测。     

大麦条纹花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

大麦条纹花叶病毒为禾本科作物上一种重要的病原,可造成严重的经济损失。该病毒的主要传播方式为种传,因此对种子进行检疫监管是控制病害传播的一种有效途径。本文依据病毒保守序列RNA2beta C蛋白设计引物,研发了一种实时荧光RT-PCR检测方法。经特异性与灵敏度评价,仅对大麦条纹花叶病毒有效,无法对小麦线条花叶病毒、甘蔗花叶病毒及玉米褪绿斑驳病毒的阳性样品进行鉴定;且扩增灵敏度与普通RT-PCR相当,处于0.02 ng/μL水平。该方法相较于已有的检测方法,操作更简便快速,不易污染,灵敏度高,特异性优。此外,本研究结合实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR两种检测方法,对未知谷物粉进行大麦条纹花叶病毒的检测鉴定,证实了新方法的可行性。     

玉米褪绿斑驳病毒3种PCR检测方法的建立与比较

 以带有玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)的玉米叶片为材料,研究建立了MCMV 的普通RT-PCR、TaqMan 实时荧光RT-PCR 和SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR 检测方法,并比较了3种方法的灵敏度。结果表明:TaqMan 实时荧光RT-PCR 的检测灵敏度最高,最低检出量可达1.61 fg,SYBR Green Ⅰ实时荧光RT-PCR 略逊之,普通RT-PCR 的检测灵敏度则相对较低,与前两者相差10~100倍。     

番茄褐色皱果病毒TaqMan 荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruit virus, ToBRFV)TaqMan荧光定量RT-PCR方法，本研究针对ToBRFV RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)基因序列设计了4组特异性引物和TaqMan探针，构建了标准曲线，并对该方法的特异性、灵敏度和实际样品的检测效率进行评估。结果显示，该方法特异性强，与番茄花叶病毒、番茄斑驳花叶病毒、烟草花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、辣椒轻斑驳病毒、烟草环斑病毒和凤果花叶病毒等9种病毒均无交叉反应。建立的标准曲线的R²为0.999,扩增效率为102.096%,检测灵敏度为10 fg/μL,与EPPO PM 7/146(1)推荐的CaTa28、CSP1325方法相当，是常规RT-PCR的100倍；采用该方法成功从60份番茄和辣椒叶片、种子样品中检出10份阳性样品。建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高，适用于实际样品中ToBRFV的快速精准检测。     

实时荧光RT-PCR方法检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据黄瓜绿斑驳花叶病毒不同分离物外壳蛋白基因(CP)的保守序列,设计合成引物和TaqMan荧光探针,建立了黄瓜绿斑驳花叶病毒的实时荧光RT-PCR(Real time RT-PCR)检测方法.该方法利用TaqMan探针水解产生的荧光信号实时监测目标基因的扩增,实现PCR扩增与检测同步进行.结果表明,实时荧光RT-PCR方法检测灵敏度比普通RT-PCR高约10倍,并且具有快速、简便、准确的优点,适合于CGMMV的快速、高效检测.     

基于TaqMan MGB探针的花生矮化病毒检测研究

花生矮化病毒(Peanut stunt virus,PSV)是我国进境检疫性有害生物。本研究根据该病毒不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计了特异性引物与TaqMan MGB荧光探针,建立了PSV的实时荧光RT-PCR检测方法。方法特异性研究表明,针对PSV的2个不同株系PSV-E和PSV-W,均能够得到典型扩增曲线,Ct值分别为20.10和21.22;而对于黄瓜花叶病毒、番茄不孕病毒、马铃薯Y病毒、菜豆荚斑驳病毒以及烟草环斑病毒等其他毒株则没有典型扩增曲线,也无Ct值。灵敏度比较发现,该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度提高100倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对PSV的检测。     

实时荧光RT-PCR检测辣椒轻斑驳病毒的初步研究

本研究选取辣椒轻斑驳病毒PMMoV、烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV和马铃薯Y病毒PVY作为试验材料,根据PMMoV衣壳蛋白(CP)RNA的序列特异性位点,设计出Taqman荧光探针及其引物,采用实时荧光RT-PCR技术对PMMoV进行快速检测,同时与ELISA方法进行了灵敏度比较,结果表明：该方法具有较高的灵敏度及较强的特异性,PMMoV检测结果为阳性,TMV、CMV和PVY均无荧光信号,为阴性,灵敏度是传统的ELISA方法的100倍,而且大大缩短了检测时间。该方法快速、准确、灵敏、简便、安全,具有实际应用价值,适用于植物病毒病害的快速检测。     

云南省玉溪市玉米致死性坏死病毒原的分子鉴定

玉米致死性坏死病是由玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)和一种或多种马铃薯Y病毒科病毒复合侵染引起的。2014年1月在对云南省玉溪市玉米病毒病害的调查中发现了一些表现严重花叶、矮化叶片甚至整个植株坏死症状的玉米。对采集样品进行RT-PCR检测,所有样品中都同时检测到了MCMV和甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV),在一个样品中同时检测到了MCMV、SCMV和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus)。     

美国进口大豆中菜豆荚斑驳病毒和玉米褪绿斑驳病毒的检疫鉴定

菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)和玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)是我国进境植物检疫性有害生物。2018年6月秦皇岛海关通过反转录PCR(RT-PCR)和双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)方法,从一批美国进口大豆以及杂质中检出BPMV和MCMV;同时利用实时荧光PCR(Real time RT-PCR)和序列比对分析方法进行验证。这是河北口岸首次在进境大豆中截获BPMV和MCMV。     

福建永安市辣椒丛枝病植原体的分子检测及鉴定

永安地区发病辣椒植株表现小叶、黄化、丛枝、簇芽等症状。利用植原体16SrDNA基因的通用引物R16mF2/R16mR2和R16F2n/R16R2,对发病辣椒植株总DNA进行巢式PCR检测,获得约1.2kb的特异性DNA片段。经测序并在GenBank数据库进行比对分析,共获得4条植原体特定的16SrDNA基因序列(CHY-C4-1、CHYY1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1)。将测得的4条序列与已报道的植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,结果显示获得的4条植原体序列均聚类到16SrI组,其中CHY-Y1-1、CHY-Y7-1、CHY-G1-1与16SrI-B亚组植原体聚类到同一支,而CHY-C4-1与已报道的16SrI组内的6个亚组均未聚类到一支,因此建议将CHY-C4-1命名为新的亚组。利用iPhyClassifier在线分析软件对获得的4条植原体序列进行虚拟RFLP分析,结果与进化树获得的结果一致。     

一个抗玉米矮花叶病新基因位点的发现和细胞学定位

 在抗性遗传研究的基础上,根据等位性分析并通过细胞遗传学研究推断,黄早4所带有的一个抗病基因位于第6染色体长臂上,在Mdm1和T6~9b的易位断点之间,靠近着丝点,相距Mdm1大约在1.9~4.5个交换单位,与易位断点相距33.8个交换单位。该抗病基因不同于已正式命名的位于第6染色体短臂上的抗病显性基因Mdm1,为新的基因位点,该基因对当前流行并造成危害的玉米矮花叶病B株系表现为隐性遗传,建议命名为mdm1(t)。     

四种中国检疫性玉米病毒的研究进展

玉米是我国重要的粮食作物、饲料和工业原材料。随着我国粮食贸易量增加,病原物入侵的风险也随之加大。该文对4种主要的检疫性玉米病毒——玉米褪绿斑驳病毒 Maize chlorotic mottle machlomovirus、玉米矮花叶病毒 Maize dwarf mosaic potyvirus、小麦线条花叶病毒 Wheat streakmosaic tritimovirus和玉米褪绿矮缩病毒 Maize chlorotic dwarf waikavirus的生物学特性及其危害与分布情况进行归纳总结,同时对这些病毒致病与寄主抗病的相关机制以及检测方法的研究进展进行介绍,并针对检疫性玉米病毒的防控,在快速检测体系的建立与抗病毒种质的创制方面提出展望。     

利用小RNA高通量测序技术检测玉米病毒

正玉米是我国重要的粮食作物,种植范围日趋增大,病害的发生对玉米造成极大为害,病毒病对玉米稳产高产已构成严重威胁。近年来,安徽、山东和辽宁玉米主要种植区病毒病危害较重。为了检测发病玉米的病毒种类,本研究利用小RNA高通量测序技术鉴定玉米病毒,明确种类,以期为制定抗病毒策略提供理论依据。据不完全统计,世界上有40多种玉米病毒病(http://en.wikipedia.org),在我国发生并报道的有5种,分别为玉米粗缩病、玉米矮花叶病、玉米条纹矮缩病、玉米红叶病和玉     

我国12省市玉米矮花叶病病原鉴定及病毒致病性测定

 利用甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)单克隆抗体细胞株2B5腹水和SCMV、玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)和约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus,JGMV)的特异性引物对我国浙江、江苏、上海、山东、河南、河北、北京、山西、陕西、甘肃、四川、云南12省市15个地点的176株玉米矮花叶病病样分别进行了间接ELISA和免疫捕获反转录PCR (IC-RT-PCR)检测,结果表明这些病样均含有SCMV,而无MDMV、SrMV或JGMV存在,表明上述12省市的玉米矮花叶病病原为SCMV。进一步对甘肃(GS)、四川(SC)、云南(YN)3个SCMV分离物的近全长CP基因进行了序列测定,并测定了浙江分离物(ZJ)和甘肃分离物(GS)在13个玉米品种上的致病性。     

Occurrence of maize lethal necrosis in Ecuador: a disease without boundaries?

Maize plants displaying severe mosaic, chlorosis and, in some cases, necrosis were observed in two provinces of Ecuador. Shotgun sequencing of cDNA obtained from double-stranded RNA extracted from symptomatic samples revealed the presence of Sugarcane mosaic virus (SCMV) and Maize chlorotic mottle virus (MCMV), two components of maize lethal necrosis. In 2015, a survey conducted in Los Ríos, Manabí and Guayas, major maize production areas in the country, showed that the two viruses were present in a significant number of plants. Mixed infections were detected and associated with severe symptoms. MCMV was also detected in two hybrid seed lots, a significant finding for the epidemiology of the disease in Ecuador. The report of maize lethal necrosis, today the most significant virus disease of maize, in Ecuador is of great concern for producers in the South American continent because of the potential of an epidemic as that observed in east Africa in recent years.     

玉米矮花叶病毒对不同抗性玉米自交系侵染及其运转的研究

 本文以抗病自交系黄野四-3、感病自交系8112和Mo17、耐病自交系478为材料,采用直接组织斑免疫测定法(IDDTB)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)结合生物学症状研究了玉米矮花叶病毒对玉米的侵染及其运转规律,试验表明玉米抗玉米矮花叶病毒主要是抗系统传导,其次抗病毒增殖和细胞间扩展,但不抗侵入。