微小毛霉（Mucor.pusillus）△6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达

目的：微小毛霉（Mucor.pusillus）△6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达。方法：以一株产γ-亚麻酸的微小毛霉为材料,通过PCR方法克隆得到的△6-脂肪酸脱饱和酶基因,构建重组的酵母表达载体pYMpD6D,将重组载体通过醋酸锂方法导入酿酒酵母中,并利用酵母表达系统证实该基因能导致酵母合成γ-亚麻酸。结果：通过GC分析,γ-亚麻酸占总脂肪酸量的6.53％,微小毛霉△6-脂肪酸脱饱和酶基因在酵母中得到了正确的表达。本实验为进一步研究△6-脂肪酸脱饱和酶基因家族和进一步利用该基因来改良作物奠定了一定的基础。     

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤氏酵母SMD1168中表达的研究

引物根据Δ~6-脂肪酸脱氢酶(D6D)基因以及酵母蛋白表达载体p GAPZαA的多克隆位点进行引物设计,并在上游插入ECo RⅠ位点、下游插入XhoⅠ位点,从深黄被孢霉中克隆D6D基因,构建p MD18-T-D6D载体与p GAPZαA-D6D载体。将重组质粒线性化,并将其电转导入到毕赤氏酵母(Pichia pastoris SMD1168)中,Zeocin抗生素筛选高拷贝转化子,对重组菌进行诱导表达。经过Tricine-SDS-PAGE分析和蛋白质免疫印迹(Western bloting)试验,证明Δ~6-脂肪酸脱氢酶融合蛋白具有免疫学活性。结果成功构建了重组酵母p GAPZαA-SMD1168,为利用基因工程菌生产γ-亚麻酸(GLA)奠定理论基础。     

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及pGAPZαA-D6D表达载体的构建

被孢霉属(Mortieralla isabellina)是目前用于微生物发酵生产γ-亚麻酸(GLA)的主要菌种。根据Δ6-脂肪酸脱氢酶基因保守区以及pGAPZαA载体的多克隆位点设计引物,上下游分别加入ECoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,从深黄被孢霉中克隆Δ6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D),并与pGAPZαA表达载体进行连接,经酶切与PCR鉴定重组质粒,证明成功构建了pGAPZαA-D6D表达载体。     

△6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物，以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板，通过PCR扩增，克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明，试验得到扩增片段长1148bp，含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接，构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR，为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。     

转基因烟草表达高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的研究

将高山被孢霉ATCCl6266△^6-脂肪酸脱氢酶(D6D)基因亚克隆到植物表达载体pBIl21中，构建了CaMV35S启动子驱动的植物表达载体pBMACL6。经根癌农杆菌LBA4404的介导，采用叶盘法转化烟草Xanthi，得到一批转基因烟草植株。转基因植株的PCR和Southern blot分析表明，D6D基因已经整合到烟草基因组中。脂肪酸GC分析表明，与未转基因的烟草苗对照相比，转基因植株有D6D基因目标产物γ-亚麻酸的产生，说明高山被孢霉的D6D基因在烟草中得到了表达。     

花生△12-脂肪酸去饱和酶基因RNAi表达载体的构建

利用RNAi原理构建花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的hpRNA表达载体,以抑制该基因的表达,获得高油酸/亚油酸比值的花生种质。根据花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因序列(GenBank:AF248739)设计引物,以豫花4号花生品种DNA为模板,克隆了该基因的启动子及长度约500 bp的外显子片段,在此基础上构建完成由自身启动子引导的花生Δ12-脂肪酸去饱和酶基因的反向重复片段RNAi载体pCAMBIA1301-Afad12Ri。     

超长链多不饱和脂肪酸在棉花中的异源合成

从球等鞭金藻、眼虫、高山被孢霉和拟南芥中分别克隆到Δ9链延长酶、Δ8去饱和酶、Δ5去饱和酶和Δ15去饱和酶基因,利用我们的多基因聚合方法,将这4个基因聚合到植物表达载体pCambia2300上,其中每个基因都含有独立的CaMV35S启动子和Tnos终止子。利用农杆菌介导法将该表达载体转入棉花,通过卡纳霉素和PCR筛选获得转基因阳性植株,提取转基因阳性植株叶片总脂肪酸,用气相色谱分析法检测到花生四烯酸(AA,20:4Δ5,8,11,14)和二十碳五烯酸(EPA,20:5Δ5,8,11,14,17)含量分别达1.0%和5.0%。表明通过基因代谢工程在棉花中异源合成EPA是可行的,为进一步在棉籽中生产VLCPUFAs奠定了基础。     

转基因烟草表达高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的研究

将高山被孢霉ATCC16266 Δ6-脂肪酸脱氢酶（D6D）基因亚克隆到植物表达载体pBI121中,构建了CaMV35S启动子驱动的植物表达载体pBMACL6。经根癌农杆菌LBA4404的介导,采用叶盘法转化烟草Xanthi,得到一批转基因烟草植株。转基因植株的PCR和Southern blot分析表明,D6D基因已经整合到烟草基因组中。脂肪酸GC分析表明,与未转基     

大豆脂肪酸脱饱和酶反义基因转化根癌农杆菌研究

根据NCBI中大豆fad2-1序列设计引物,用PCR方法从大豆的基因组DNA中扩增大豆脂肪酸脱饱和酶基因,克隆到pMD18-T vector中,转化大肠杆菌JM109菌株,进行测序与比对.然后,将其反向克隆到表达载体pBt,转化农杆菌菌株LBA4404,经双酶切鉴定和PCR扩增检测,获得具有该基因的农杆菌工程菌.结果表...     

过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株的构建

本研究构建了带G418抗性的载体pFL61-G418,从酿酒酵母WT303菌株中克隆了真菌抗逆境基因tps1（海藻糖-6-磷酸合成酶基因）,再将tps1基因插入到pFL61-G418载体的NotI位点,构建pFL61-G418-tps1表达载体,并将该表达载体转化进入野生型拮抗酵母膜醭毕赤酵母菌株中。构建过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株,增强拮抗酵母菌的抵抗逆境的生存能力,从而提高其生活力及与病原菌的竞争力。结果表明成功地构建了过表达海藻糖-6-磷酸合成酶拮抗酵母菌工程菌株,说明pFL61穿梭质粒可以用来转化野生型拮抗酵母,G418抗性可以作为转化子筛选的阳性标记。该重组表达载体的成功构建,为野生型拮抗酵母的遗传改良提供了重要的理论依据。     

新西兰白兔γ-干扰素在昆虫细胞中的表达及其活性测定

用RT-PCR方法对ConA刺激后的新西兰白兔外周血淋巴细胞(PBMC)扩增家兔γ-干扰素(IFN-γ)基因并进行测序,测序结果显示,与GenBank公布的序列核苷酸同源性达到99.4%～99.6%,氨基酸同源性为98.8%～99.4%;然后通过克隆、转化将家兔γ-干扰素基因转入转移载体pFastBacTM1,得到重组转移载体pFastBacTM1-IFN-γ,用pFastBacTM1-IFN-γ转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经筛选得到重组穿梭载体Bacmid-IFN-γ,用此质粒转染Sf9昆虫细胞,得到重组病毒rAcV-Bac-IFN-γ,经RT-PCR鉴定,结果显示重组IFN-γ在Sf9昆虫细胞中得到表达。用兔IFN-γELISA试剂盒测得重组兔IFN-γ的浓度为1 950 pg/mL。细胞病变抑制法结果显示,重组兔IFN-γ在MDCK上显示了较高的抗病毒活性,并测得重组兔IFN-γ的活性约为5.12×105 U/mg。     

猪Fc受体γ亚单位基因克隆与原核表达

应用RT-PCR技术从90日龄健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪Fcγ亚单位的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-FcRγ,成功表达了分子量约为29 kDa的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白FcRγ-His免疫小鼠,制备获得鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶8 000。Western-blotting结果表明,制备的鼠抗FcRγ-His重组蛋白多克隆抗体可以与重组γ亚单位蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。成功克隆出猪Fc受体γ亚单位基因并表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。     

油棕脂肪酸脱饱和酶基因ω3启动子区的克隆及其表达组织特异性分析

本研究是以油棕叶片基因组DNA为模板,通过数据库预测的油棕脱饱和酶基因ω3的启动子序列设计特异性引物,利用PCR技术扩增及TA克隆的方法得到了长度为1 144 bp油棕脱饱和酶基因ω3启动子序列。通过Plant CARE软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子不仅含有转录必备的CAAT-box和TATA box,还有大量相关的光反应元件和激素响应元件。通过构建含gus的植物表达载体,农杆菌介导转化转基因拟南芥,对转基因拟南芥进行活性表达分析。结果表明:克隆获得的启动子序列和下游gus基因已经稳定的整合到获得的转基因拟南芥基因组当中;同时,gus基因在拟南芥不同组织中体现出明显的组织特异性,其中,茎干处表达量最高,在叶片的叶脉处表达次之。说明ω3启动子具有活性,可以启动目的基因的转录,本研究为进一步研究启动子的功能及基因表达调控奠定了基础。     

拟南芥AtCYS6基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6相互作用的蛋白,构建其酵母双杂交诱饵表达载体。本研究利用PCR方法扩增得到拟南芥AtCYS6的基因片段,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵表达载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过醋酸锂法将诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6与空载体pGBKT7分别转化到Y2HGold酵母菌株,检测其是否有自激活能力以及对宿主酵母菌株是否有毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了AtCYS6基因,成功构建了无自激活和没有毒性的诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6。本研究结果可进一步为筛选与AtCYS6相互作用的蛋白质及功能研究提供科学依据。     

马铃薯StERF5转录因子酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与马铃薯StERF5转录因子相互作用的宿主蛋白,构建其诱饵载体,本研究利用PCR方法扩增得到马铃薯StERF5基因的编码序列,克隆至载体p MD18-T,验证正确后插入到酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-StERF5及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGlod感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性。结果表明:扩增得到StERF5基因,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-StERF5,此诱饵载体对酵母宿主细胞无毒性且不具自主激活报告基因的功能。研究结果可为进一步利用酵母双杂交技术筛选与ERF5基因互作的宿主蛋白及功能研究提供科学依据。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素A基因的 克隆与原核表达

从长白猪肝脏细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到猪甘露聚糖结合凝集素A（porcine mannan-binding lectin A,pMBL-A）基因。再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上,构建重组表达质粒。将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段,并原核表达了重组蛋白,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据。     

马铃薯StSOD1基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

为了筛选与马铃薯超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)基因StSOD1作用的上游蛋白,构建其酵母双杂交诱饵重组载体。本研究利用PCR方法扩增得到马铃薯StSOD1的基因片段,通过与pMD-T18连接构建克隆载体,经验证构建成功后,与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵重组载体,经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后,通过PEG/Li Ac法将诱饵载体pGBKT7-StSOD1与空载体pGBKT7分别转化到酵母AH109感受态细胞中,检测其是否有自激活作用和对酵母菌株的毒性作用。结果表明:经PCR扩增后得到了StSOD1基因,成功构建了诱饵重组载体pGBKT7-St SOD1,并且此诱饵载体无自激活活性和对酵母菌株的毒性作用。此研究结果可进一步为筛选与StSOD1互作的蛋白质及功能研究提供科学依据。     

木霉双价基因表达载体的构建

利用几丁质酶基因和β-1,4-葡聚糖酶基因构建双价基因表达载体,为木霉转化奠定基础。利用限制性内切酶酶切得到目的基因片段,通过T4 DNA ligase将基因插入表达框中,并采用PCR、酶切和核苷酸序列分析验证双价基因表达载体的正确性。利用启动子CaMV35S和终止子PolyA构建几丁质酶基因chi42的表达框,获得表达载体pC1302-C42;利用启动子CaMV35S和终止子Nos构建β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的表达框,获得表达载体pC1300-2-G14;在单基因表达载体的基础上,通过串联构建双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42,该表达载体含有潮霉素B抗性基因。经检测证实表达元件35S-chi42- PolyA和35S-glu14-Nos连接成功。得到的双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42可直接用于木霉等丝状真菌的遗传转化,为构建木霉广谱高效工程菌株奠定基础。     

利用Gateway克隆技术大规模克隆拟南芥转录因子

随着越来越多基因组全序列的测定完成,基因组的研究进入了功能研究阶段。功能基因组的研究需要把大量基因连入不同载体,传统的酶切连接构建载体的方法不能满足这种大规模克隆的需要。Gateway技术是一种高效的大规模克隆系统,而且对载体和宿主没有依赖性。本文利用Gateway大规模克隆技术将16个拟南芥转录因子的ORF克隆入植物表达载pPTV和酵母表达载体pYTV中,酵母融合表达实验和Westem-blot检测证明了该克隆途径的可行性,并且得到的His-Tag融合蛋白,为拟南芥转录因子的大规模蛋白质组学研究奠定了良好的基础,同时基因序列的聚类分析为将来进一步的功能研究提供了有利信息。     

中介蝮蛇毒纤溶酶基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

为了从中介蝮蛇毒腺中提取总RNA,研究其具有重要药用价值的纤溶酶,从基因工程的角度进行研究开发蛇毒资源。通过RT-PCR法扩增纤溶酶基因与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到FLE基因,再亚克隆到pPROEXHTb原核表达载体上,构建重组表达载体;将阳性重组表达载体转化到大肠杆菌中诱导表达,采用SDS-PAGE检测该重组蛋白的分子量。结果表明：成功的构建了重组原核表达载体ppPROEXHTb-FLE,并在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白分子量约为30 KDa。说明可以采用该方法进行中介蝮蛇毒纤溶酶的原核表达,该研究为进行蛇毒纤溶酶的开发奠定了分子基础。