甜橙柠檬酸合酶基因的克隆及其在果实发育过程中的表达分析

柠檬酸合酶与柠檬酸的积累密切相关,通过分析其与酸含量的关系,为研究该基因的调控机制奠定理论基础。设计特异性引物对柠檬酸合酶基因进行克隆,并采用半定量PCR法对哈姆林叶片、果肉和果皮中该基因的表达模式进行检测。克隆得到柠檬酸合酶基因的cDNA序列,全长1535bp,ORF区含471个氨基酸残基,序列比对显示,哈姆林甜橙柠檬酸合酶基因与其他植物的该基因高度同源。半定量PCR结果显示果肉和果皮中柠檬酸合酶基因在各个时期的表达基本没有变化,而叶片中其表达水平随果实发育成熟不断降低,与果实中柠檬酸含量变化趋势相同。说明叶片中柠檬酸合酶基因表达与果实酸含量正相关。     

油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达

柠檬酸合酶是植物多种代谢途径的限速酶, 及代谢变化的标志酶。为了解油菜柠檬酸合酶基因的生理功能, 以甘蓝型油菜叶片cDNA为模板, 设计特异性引物, 获得一编码柠檬酸合酶基因的cDNA序列, 全长1 659 bp, ORF区含476个氨基酸残基, 序列比对显示其蛋白序列与拟南芥有较高的同源性(96.0%), 氨基末端含一线粒体靶信号。聚类分析表明, 油菜柠檬酸合酶基因与其他植物内该基因高度同源。对油菜幼苗进行植物生长调节物质、高温和低温、强光照和弱光照、盐、菌核病、干旱和水渍等处理, 采用半定量PCR法对油菜叶片柠檬酸合酶基因的表达模式进行检测, 发现在盐胁迫、暗光和强光的处理下, 柠檬酸合酶基因的表达基本没有变化;在水渍、干旱、IAA和6-BA胁迫下, 其表达有所升高, 但出现峰值的时间不同, ABA对表达模式的影响与IAA相反;感染菌核病后其表达降低;对GA₃的应答呈鞍型。对部分处理采用荧光定量PCR验证, 其结果与半定量PCR结果基本一致。     

甘蔗ATP柠檬酸裂解酶基因的克隆与表达分析

ATP柠檬酸裂解酶(ACL)为细胞质中乙酰辅酶A合成途径的关键调控酶,在生物体正常生长发育中扮演着重要角色。本研究通过Race和电子克隆技术获得编码甘蔗ACL蛋白2个亚基的基因SoACLA-1和SoACLB-1,其编码框长度分别为1 272 bp和1 827 bp,编码423个和608个氨基酸,推测的氨基酸序列与其他物种具有高度相似性,都优先与禾本科植物聚于同一进化分支。2个基因在ATP-grasp功能域、柠檬酸结合位点、组氨酸磷酸化位点和ATP结合、CoA结合、磷酸化区域等,序列高度保守。实时荧光定量PCR结果表明,2个基因均受外源ABA、水分胁迫、水分胁迫加ABA处理诱导表达,且叶中表达量显著高于根系,其中又以水分胁迫处理下的表达量最高,2个基因表现出协同表达模式。SoACLA-1和SoACLB-1的表达与ABA、ROS含量具有相关性,说明它们可能参与了ABA调控的植物对逆境胁迫反应的代谢过程。     

甜橙PHT1基因的克隆与表达分析

磷是柑橘生长发育过程中必需的元素。在拟南芥中PHT1家族成员至少介导了植株根部95%以上的磷吸收过程,至今已在水稻、油茶和杨树等多种植物中发现了具有相似功能的PHT1基因,说明PHT1基因在植物的磷吸收过程具有重要作用及在植物进化过程中具有保守性。本研究从柑橘基因组序列信息中分析出7个柑橘PHT1基因,其中在根部表达较强的基因Cs3g27660编码产物与At PHT1;8(或At PHT1;9)的蛋白序列相似性最高;而Cs9g10540、Cs5g29860、Cs9g10530与At PHT1;1(或At PHT1;4)的蛋白序列相似性最高,并且三者均能在根部表达及表达受低磷胁迫诱导,亚细胞定位结果亦显示三者均能定位在细胞的质膜上,推测Cs9g10540、Cs9g10530、Cs5g29860可能为柑橘中类At PHT1;1(或At PHT1;4)基因。     

白木香倍半萜合酶基因AsVS的克隆与表达分析

法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)是植物萜类化合物合成途径的重要前体之一,经不同的酶催化可形成各类萜类化合物,Vetispiradiene合酶可催化FPP形成Solavetivone和Lubimin的前体Vetispiradiene。本研究利用白木香转录组数据,首次克隆了编码白木香Vetispiradiene合酶的基因(命名为As VS, Genbank登录号为MH378283),AsVS基因序列全长为1 632 bp,编码543个氨基酸,该氨基酸序列与马来沉香倍半萜合酶聚类于同一分支,具有较近的亲缘关系,该蛋白植物倍半萜的保守性结构域DDXXD,NST/DTE和R(R)X8W,相对分子量为62.73 kD,理论等电点为5.51,包含40个磷酸化位点;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;不含跨膜结构域。RT-qPCR分析结果表明AsVS基因在结香剂处理过程中于白木香茎干样品中持续上调表达,其第6天及第9天的表达量分别为对照处理的2.36和5.02倍。此结果为进一步研究As VS基因在白木香萜类化合物的合成及沉香致香成分富集中的功能提供了理论基础。     

牛大力蔗糖合酶基因CsSuSy克隆与表达特征分析

蔗糖合酶(sucrose synthase,SuSy)是催化蔗糖代谢的关键酶之一,参与蔗糖的分解、淀粉的生物合成等代谢过程,在植物的生长发育中发挥着至关重要的调控作用.本研究从牛大力转录组数据库筛选并克隆得到两个蔗糖合酶基因CsSuSy1与CsSuSy2,CSuSy1全长2 326bp,包括2 307 bp的完整开放阅...     

甜橙中类AtCIPK23基因的克隆与表达分析

钾是柑橘生长发育过程中必需的元素。At CIPK23在拟南芥的钾吸收利用过程中发挥了重要作用,在水稻、杨树和葡萄等多种植物中也发现了与At CIPK23功能相似的CIPK基因,说明类At CIPK23基因在植物进化过程中具有保守性。本研究从甜橙基因组序列信息中分析得到17个柑橘CIPK基因,将其中与At CIPK23基因进化关系较近的Cs2g08190、Cs2g28990和Orange1.1t00555作为柑橘类At CIPK23候选基因;候选基因编码产物与拟南芥CIPK家族成员的氨基酸序列相似性分析结果显示,Cs2g08190与At CIPK23同源性最高(76.8%);三个候选基因均能在细胞质定位,但仅发现Cs2g08190的表达受低钾胁迫诱导表达,推测Cs2g08190是柑橘类At CIPK23基因。     

蔗糖合酶基因启动子克隆及其转基因水稻植物中特异性表达

以水稻品种"明恢63"基因组DNA为模板, 用PCR方法克隆出水稻蔗糖合酶基因起始密码子以前(包括第一内含子)的上游序列RSP1及其不包括第一内含子的上游调控序列RSP2. 测序结果显示, 在重要的功能区段上, 克隆的序列与Wang(1992)等的报道基本一致. 构建了由RSP1和RSP2驱动报告基因Gus的植物表达载体, 并用于农杆菌介导法水稻遗传     

花生蔗糖合酶基因AhSuSy的克隆和干旱胁迫表达分析

蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶, 在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要的作用。本研究利用同源克隆、RACE和TAIL-PCR相结合的方法从花生叶片中分离了蔗糖合酶基因, 命名为AhSuSy (GenBank登录号JF346233)。该基因cDNA序列全长2 790 bp, 包含一个2 421 bp的开放阅读框(ORF), 5′端非编码区57bp, 3¢端非编码区为312 bp。根据编码区预测AhSuSy编码806个氨基酸, 与大豆、拟南芥、玉米等植物中相关蛋白的氨基酸序列同源性达75%以上; 成功构建了该基因的原核表达载体pET32a-AhSuSy, 在IPTG诱导下得到92 kD左右的蛋白, 与理论值一致。半定量RT-PCR分析表明AhSuSy在花生根、茎、叶中均有表达。利用10%PEG模拟干旱处理花生幼苗, 分析胁迫后AhSuSy的转录水平, 同时测定蔗糖合酶活性和蔗糖含量, 发现三者均表现为处理后4~12 h逐渐升高, 相关性分析显示花生中蔗糖含量与蔗糖合酶活性的相关系数达0.993(P=0.007<0.01), 处理后12~24 h逐渐降低。推测该基因响应干旱调控, 在花生抗旱胁迫中可能起着一定的作用。     

越南油茶环阿屯醇合酶基因的克隆及表达分析

为研究越南油茶(Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu)中环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的分子作用机制,本研究采用同源克隆的方法克隆得到环阿屯醇合酶基因全长并命名为CvCAS,对其进行生物信息学分析及表达模式研究。结果表明,CvCAS全长2 411 bp,包括一个2 277 bp完整的开放阅读框,编码758个氨基酸,与茶(Camellia sinensis)、中华猕猴桃(Actinidia chinensis var. chinensis),刺楸(Kalopanax septemlobus)和人参(Panax ginseng)的CAS蛋白序列相似度均在85%以上,系统发育树分析显示CvCAS与茶(Camellia sinensis)和向日葵(Helianthus annuus)的CAS蛋白序列聚为一支。预测其蛋白分子质量为86.6 kD,理论等电点为6.20,无跨膜螺旋区,属于不稳定亲水性蛋白。序列比对分析表明,CvCAS具有氧化鲨烯环化酶(OSCs)超家族典型结构位点(DCTAE),三萜合成酶高度保守结构...     

日本蛇根草查尔酮合酶基因的克隆及其生物信息学分析

查尔酮合酶(CHS)是类黄酮生物合成过程中的第一个关键酶,其在类黄酮的合成过程中发挥着非常重要的作用。本研究以日本蛇根草为研究材料,根据其转录组测序结果设计全长引物,通过RT-PCR方法成功克隆得到日本蛇根草查尔酮合酶基因完整的cDNA序列,并利用相关生物信息学软件对其进行分析。结果表明,该基因序列全长为1 170 bp,编码389个氨基酸,预测其蛋白分子量为42.783 kD,等电点为6.05,是亲水性蛋白质,不含有信号肽,很可能定位在细胞质中。同时,二级结构分析显示,日本蛇根草CHS的二级结构分别由180个α螺旋、84个延伸链、125个无规则卷曲组成,这与三维结构预测结果相一致。日本蛇根草CHS基因的克隆对于研究植物类黄酮的生物合成及其分子机制具有重要意义,同时也丰富了双子叶植物PKS基因家族的相关研究。     

一个陆地棉类烯醇酶基因的克隆及其表达分析

 采用改良的CTAB法提取陆地棉总RNA,运用RT-PCR技术首次克隆了陆地棉类烯醇酶基因的CDS序列,该基因已经在GenBank上登录,登录号为 EU169604,其开放阅读框为1338 bp,编码445个氨基酸残基。对其序列和进化分析表明,陆地棉烯醇酶基因与其它植物中的烯醇酶基因有较高的相似性,该基因在进化过程中是相当保守的。半定量RT-PCR表达分析结果显示该基因在陆地棉的叶、根、茎中均有表达,但在根中的表达量高于叶和茎。     

长春花法呢基焦磷酸合酶基因的克隆与组织表达分析

萜类吲哚生物碱是重要的植物次级代谢产物,是多种天然药物的药效基础,具有显著的消炎、抗病毒、抑制肿瘤等作用。而长春花(Catharanthus roseus)作为重要的药用植物可以通过次级代谢合成150多种萜类吲哚生物碱,但是长春花萜类化合物的代谢途径尚未完全解析,究其原因则是受到代谢通路中关键酶的限制。法呢基焦磷酸合成酶(FPPS)是植物萜类物质合成途径中的关键酶之一,但仅发现在拟南芥等植物的萜类化合物合成过程中发挥重要的作用。因此,为了深入探究FPPS对长春花次级代谢途径是否也发挥重要作用,本研究通过生物信息学、分子生物学等研究手段,基于拟南芥法呢基焦磷酸合成酶序列,对长春花转录组数据库进行序列比对分析,首次发现并成功克隆两个FPPS同源基因,并将其命名为CrFPPS1与CrFPPS2。进一步通过系统进化树分析表明,CrFPPS1和CrFPPS2与拟南芥、缬草等植物FPPS的氨基酸序列相似性均在80%以上。RT-qPCR结果显示CrFPPS在长春花不同组织表达特征不同,因此推测CrFPPS1与CrFPPS2的功能并不完全相同。初步表明CrFPPS是长春花次级代谢通路上具有生物学功能的...     

北柴胡环阿屯醇合酶基因的全长克隆与表达分析

环阿屯醇合酶(CAS)是柴胡中植物甾醇类物质合成途径的关键酶,与柴胡皂苷合成途径的关键酶基因β-香树酯醇合酶(β-AS)竞争共同的前体物质,影响柴胡皂苷的积累.为探究柴胡中环阿屯醇合酶的作用,本研究以北柴胡cDNA为模板,克隆获得北柴胡环阿屯醇合酶基因BcCAS的全长序列,对BcCAS全长cDNA序列及其编码氨基酸序列...     

苎麻ACC合酶基因(BnACS1)的克隆和表达分析

根据苎麻转录组测序中的ACS基因片段, 利用RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆了该基因的全长cDNA序列, 命名为BnACS1, 在GenBank中的登录号为JQ970520。该基因的cDNA序列全长为1 674 bp, 其开放阅读框长1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。半定量RT-PCR分析表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR分析表明, BnACS1受ABA和干旱的诱导表达上调, 不受高盐诱导表达。     

‘西伯利亚’百合丙二烯氧化合酶LsAOS基因的克隆及其表达分析

丙二烯氧化合酶(allene oxide synthase,AOS)基因是茉莉酸(JA)合成途径中第一个特异性酶,具有调控植物体内JA合成积累的重要作用。本研究通过RACE技术克隆得到了‘西伯利亚’百合Lilium‘Siberia’中的AOS基因,并将其命名为LsAOS。该基因全长1 542 bp,编码513个氨基酸,其蛋白序列与小果野芭蕉的同源性最高,属于不稳定亲水蛋白。通过对‘西伯利亚’百合4个不同花期,9个不同组织器官进行实时荧光定量PCR(q-PCR)后发现,LsAOS在花蕾期中的表达量最高,随着花朵的逐渐开放表达量逐渐下降;LsAOS在叶片中表达水平最高,其次是内瓣、根、茎等。JA参与植物生长发育的全过程,与植物抗逆性和次生代谢反应有着密不可分的联系。AOS基因是JA途径中的关键基因之一,对JA的合成有着重要的调控作用。     

薰衣草芳樟醇合酶基因的克隆、表达及酶活性检测

从高油薰衣草品种“杂花”中克隆得到芳樟醇合酶基因LIS1和LIS2,并对其进行了生物信息学和表达模式分析、原核表达和酶活性检测,以低油品种“法国蓝”为对照。结果表明,LIS1基因编码602个氨基酸,LIS2基因编码564个氨基酸。LIS1蛋白与阔叶薰衣草、一串红的芳樟醇合酶亲缘关系相近,LIS2蛋白与狭叶薰衣草、杂薰衣草的芳樟醇合酶亲缘关系相近。LIS1基因在“杂花”花器官半开期、盛开期和衰败期的表达量均高于“法国蓝”;LIS1基因在“杂花”花萼中的表达量最高,且仅在“法国蓝”雄蕊中少量表达。LIS2基因在“杂花”花器官不同组织和不同发育时期表达量均低于其在“法国蓝”中表达量,该基因在“杂花”花器官衰败期和“法国蓝”花器官半开期表达量最高,在2个品种花萼中高表达。LIS2基因在2个品种不同发育时期及组织中的表达量均明显高于LIS1基因。LIS1和LIS2重组蛋白具有单萜合酶活性,且均参与合成芳樟醇。     

桑树花青素合酶基因的克隆与信息学分析

花青素合酶ANS是花青素合成过程中的一个关键限速酶。本文利用同源克隆、RT-PCR从桑椹中克隆出花青素合酶(MaANS)基因, 并进行生物信息学分析和组织特异性表达分析。通过染色体步移法获得的MaANS基因的5′端和3′端, 获得基因全长1 535 bp, 由2个外显子和1个内含子组成,包含完整CDS区域为1 077 bp, 编码358个氨基酸, 与来源于草莓、甘薯、苹果、沙梨的ANS基因同源性均达到80%以上。MaANS编码的蛋白质属于2-酮戊二酸双加氧酶家族。MaANS在进化树中的位置与草莓最近,与苹果、沙梨次之。组织表达分析表明, MaANS基因在幼叶和成熟果实中高水平表达,表明该基因的表达具有组织特异性,为研究桑树果色的形成原因和表达调控奠定了基础。     

几丁质酶基因chiB 的克隆及表达分析

几丁质酶能够通过破坏昆虫组织中的几丁质起到抗虫作用。为获得高表达的植物几丁质酶基因载体,通过同源克隆的手段,从粘质沙雷氏菌中分离到了chiB基因,长度为992 bp,构建了pET28表达载体,并用IPTG诱导了该基因的表达。经分析发现该基因表达产物属于糖基水解酶（glycosyl hydrolases）18家族,并利用pCAMBIA2300构建了植物表达质粒pCAM-35S-chiB。