克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br#

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染

 【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。     

内蒙古白绒山羊LDH-A基因cDNA的克隆与特性分析

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊乳酸脱氢酶A（LDH-A）基因并分析其基本表达模式。【方法】采用RT-PCR和3′ RACE技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法进行组织表达检测。【结果】获得了内蒙古白绒山羊LDH-A基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1 649 bp,包含一个996 bp的ORF和642 bp 的3′ UTR。SMART分析表明ORF编码的蛋白质具有Ldh_1_N domain和Ldh_1_C domain,Psite分析表明有L-乳酸脱氢酶活性位点,PSORT程序分析将其定位于细胞质中。LDH-A基因在脾、肾、睾丸和肌肉组织中均有表达。【结论】内蒙古白绒山羊LDH-A基因编码的蛋白具有典型的乳酸脱氢酶结构,cDNA核苷酸序列与牛的LDH-A基因（NM_174099.2）具有较高的同源性。在脾、肾、睾丸和肌肉组织中均有表达。     

陕北白绒山羊Lhx2毛囊表达载体构建及转染成纤维细胞的研究

以陕北白绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,扩增出Lhx2基因的CDS区,成功构建了以KAP6.1为启动子表达Lhx2基因的绿色荧光表达载体pIRES2-KAP-LHX-EGFP.并利用脂质体介导转染绒山羊胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得了稳定转染的细胞系,经PCR检测显示外源基因已整合到细胞基因中.研究结果为进一步开展Lhx2基因对绒山羊毛囊发育的影响和转Lhx2基因绒山羊的生产提供了前期研究基础.     

电穿孔法转染猪胎儿成纤维细胞条件优化

以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,采用L9(33)正交试验设计,对质粒浓度、电压、脉冲时间等3个因素进行优化,并比较了不同温度处理对转染效率的影响,以及电压对细胞存活率的影响.结果表明,3个因素中质粒浓度对转染效率的影响最大,质粒浓度和电压对转染效率均有显著影响,脉冲时间对转染效率的影响不显著.不同温度处理下的转染效率无显著差异,电压显著影响细胞存活率.质粒浓度40 g/mL、电压280 V、脉冲时间800 s条件下,转染效率最高,为89.8％.     

内蒙古白绒山羊蛋白激酶B/AKT基因的克隆及表达模式分析

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA并分析其基本表达模式。【方法】RT-PCR克隆AKT基因 cDNA。通过在线软件BLAST进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。半定量RT-PCR检测AKT基因在绒山羊组织中的表达特异性。Western blotting检测绒山羊胎儿成纤维细胞中AKT表达。【结果】克隆到的内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA片段长 1 443 bp,包含了编码480个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与绵羊（NM_001161857.1）同源性为97%。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了可与3-磷酸肌醇结合的PH结构域及具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S_TKc结构域。Psite分析表明,含有1个cAMP-/cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点、10个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个蛋白激酶ATP结合区信号和1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性区域。PSORT程序预测其定位于细胞质中。AKT基因mRNA丰度在睾丸、脑和肾中较高,在脾、肝、肺及乳腺组织中相对低。绒山羊胎儿成纤维细胞中抑制mTOR活性,AKT表达量降低。【结论】内蒙古白绒山羊AKT基因cDNA全长ORF的核苷酸序列与绵羊的AKT基因具有很高的同源性,AKT基因在脾、睾丸、脑、肝、肺、乳腺及肾组织中均有表达,其AKT的表达受mTOR信号通路的调控。     

水牛Oct4、Nanog基因的克隆及其在水牛胎儿成纤维细胞中的表达

【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用,以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系（iPSC）奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA,将RNA反转录成第1链cDNA,参照牛基因序列（Oct4：NM_174580,Nanog：NM_001025344）设计特异性引物,采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列（the coding sequences,CDS）和DNA全长序列,其中Oct4全长DNA分3段扩增,Nanog全长DNA分2段扩增;利用生物在线分析软件对水牛Oct4和Nanog进行蛋白质结构预测和同源性比对;采用EcoRⅠ、XholⅠ和XholⅠ、NotⅠ双酶切,T4连接酶,将Oct4和Nanog的CDS连接到逆转录病毒载体pMX上,构建逆转录表达载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;采用组织块法培养水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts,BFFs）,逆转录表达系统经过病毒包装后产生的病毒上清液感染BFFs,感染12-15h后,继续培养48 h;通过RT-PCR和免疫荧光技术检测转基因在BFFs中的表达情况。【结果】Oct4 CDS全长1 083 bp,编码361个氨基酸,DNA全长4 509 bp,包括5个外显子和4个内含子;Nanog CDS全长903 bp,编码301个氨基酸,DNA全长4 473 bp,包括4个外显子和3个内含子;将Oct4和Nanog基因序列提交到GenBank,分配的基因登录号分别为JN991003和JN991004;Oct4氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为98%、96%、91%和81%,Nanog氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为90%、81%、69%和47%;Oct4和Nanog蛋白结构与小鼠相应蛋白的结构相似,分别含有本家族特有的POU结构域和HOX同源结构域;成功构建表达Oct4和Nanog的逆转录病毒载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;逆转录病毒系统pMX介导的Oct4和Nanog基因能转入BFFs中,在mRNA水平和蛋白水平都表达,阴性对照中不表达。【结论】分别克隆了水牛Oct4和Nanog的DNA序列全长和CDS,其基因序列和氨基酸序列在物种间高度保守;逆转录病毒转基因方法将Oct4和Nanog基因成功地转入BFFs并表达。逆转录病毒系统介导目的基因表达的转基因方法可以应用于水牛转基因研究和水牛iPSC生产。     

转LacS基因牛胎儿成纤维细胞克隆胚的构建及分析

嗜热菌β-糖苷酶(lac S)由于具有催化糖苷键水解进而分解乳糖的作用,因而被应用于转基因牛的研究中。本研究利用构建的普通载体plox-EGF-lac S和含有转座元件的乳腺特异性表达嗜热菌β-糖苷酶载体ZGL-LACS-EN转染牛胎儿成纤维细胞,并将挑选出的阳性细胞用作供体细胞,构建转基因克隆胚,并比较两种转基因克隆胚的发育潜能,并进行胚胎移植。结果表明,普通载体转染的转基因胚胎卵裂率(83.2%)稍高于转座子介导的转基因胚胎(75.7%),而囊胚率(15.3%/14.9%)无明显差别,但两者均明显低于非转基因的胚胎(卵裂率88.2%,囊胚率36.7%)。这为进一步培育低乳糖奶牛新品种的研究奠定了基础。     

内蒙古绒山羊CRABP I基因的克隆及表达

【目的】克隆内蒙古绒山羊视黄酸结合蛋白Ⅰ（cellular retinoic acid binding proteinⅠ,CRABPⅠ）基因的cDNA,进行蛋白结构的预测和表达分析,为绒山羊毛和绒形成的分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆内蒙古绒山羊CRABPⅠ基因序列,利用生物信息学方法预测其蛋白结构,采用实时荧光定量PCR探讨该基因在绒山羊4个胎儿日龄皮肤中的表达。【结果】内蒙古绒山羊CRABP I基因cDNA长679 bp（JN936490）,其开放阅读框为414 bp,氨基酸序列与其它物种相比具有较高的序列相似性。CRABP Ⅰ蛋白无明显的信号肽和跨膜区域,不存在N糖基化位点和O糖基化位点;蛋白二级结构主要由α 螺旋、β折叠和少量的转角及无规则卷曲构成。胎儿皮肤中CRABPⅠ基因在 90 d 的表达量明显高于100、120和130 d（P<0.05）。【结论】绒山羊的CRABPⅠ基因cDNA中的开放阅读框（open reading frame,ORF）在不同物种间较为保守,但种属特异性集中表现在第33和123氨基酸残基处,该基因在胎儿期的90 d表达量最大。     

山羊胎儿成纤维细胞转染人t-PA指形区缺失基因及其核移植研究

采用阳离子脂质体法将人t-PA指形区缺失基因乳腺特异性表达载体(pEBT)导入山羊胎儿成纤维细胞,以山羊胎儿成纤维细胞和转染的山羊胎儿成纤维细胞作供体,构建核移植胚,对其体外发育情况进行了研究,比较了2种供体细胞(山羊胎儿成纤维细胞和转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞)及转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞饥饿处理与否对核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,早期核移植胚有荧光蛋白(GFP)的表达;以山羊胎儿成纤维细胞作供体细胞时,核移植胚的桑葚胚率(50.3%)及囊胚率(16.0%)均高于以转人t-PA指形区缺失基因胎儿成纤维细胞为供体时的桑葚胚率(48.4%)和囊胚率(10.9%),但差异不显著(P>0.05);转人t-PA指形区缺失基因的山羊胎儿成纤维细胞经饥饿处理后,其核移植胚胎的卵裂率(73.6%)与不饥饿时的卵裂率(73.9%)差异不显著;饥饿处理后核移植胚胎的桑葚胚率(48.5%)和囊胚率(11.2%)均高于不饥饿处理的桑葚胚率(39.2%)和囊胚率(9.2%),但差异不显著(P>0.05)。本研究成功地构建了转人t-PA指形区缺失基因的体细胞核移植胚胎,体外囊胚率为11.2%。     

LipofectamineTM和Fugene-6介导GFP基因转染绵羊胎儿成纤维细胞的比较研究

分别用Lipofectamine^TM和Fegene-6介导质粒pEGFP-C1转染体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞（sheepfetal fibroblast cells,sFFCs）,比较了DNA浓度、转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间对转染效率的影响,通过含G418的DMEM/F12培养液筛选得到转基因单克隆细胞。结果表明脂质体转染试剂Lipofectamine^TM转染效率优于Fegene-6。另外,对转基因细胞进行了染色体核型分析。结果表明,转基因细胞中二倍体核型占74.5%,与对照组比较没有显著性差异。以上研究为其他基因转染sFFCs以及利用体细胞克隆法生产转基因绵羊提供了参考依据。     

内蒙古绒山羊Homeobox基因片段的克隆与序列分析

根据已公布的Hom eobox基因氨基酸序列保守区设计简并引物,利用PCR技术从内蒙古绒山羊血液基因组DNA中扩增Hom eobox基因家族成员。目的基因片段纯化后连接到pGEM-T载体上,经鉴定得到重组质粒。将110个重组质粒进行测序,测序结果通过与GenBank中序列比对分析,确定86条序列为Hom eobox基因,得到14个Hom eobox基因家族成员:Hoxa4,Hoxa5,Hoxa6,Hoxa7,Hoxb1,Hoxb2,Hoxb3,Hoxb6,Hoxb7,Hoxc6,Hoxd1,Hoxd3,Gbx1,Gbx2。每个基因片段由117个核苷酸组成,编码39个氨基酸。氨基酸序列非常保守,和其他物种的同源性非常高。     

内蒙古绒山羊MTNRla基因外显子2克隆及序列分析

依据已发表的绵羊MTNRla基因外显子2扩增引物序列,以内蒙古绒山羊基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到824bp的基因序列,将扩增产物进行克隆测序后与GenBank数据库进行序列同源性比较分析,结果表明,绒山羊MTNRla外显子2扩增序列与已发表的山羊同源性为99.2%,与绵羊、牛、人、鼠同源性分别为98.5%、96.8%、82.O%和78.4%,内蒙古绒山羊MNTRla基因第2外显子氨基酸序列与已发表的山羊氨基酸序列的同源性为97.7%,与已发表的绵羊、牛、人和鼠的氨基酸同源性分别为94.1%、91.8%、82.2%、83.1%.     

多能性转录因子mRNA转染山羊胎儿成纤维细胞条件优化

【目的】针对转染试剂脂质体2000和转染方法进行研究,用以优化外源多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA转入山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）的条件。【方法】采用胰酶消化法,从山羊胎儿腿部肌肉组织中分离并获得了纯化的GEF细胞。根据mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra Kit试剂盒说明书,体外转录步骤主要有：①前期的质粒准备：首先用质粒小提试剂盒对摇菌获得的各体外转录载体质粒进行提取,随后对各体外转录载体目的基因下游进行单酶切,获得线性化质粒,最后用DNA纯化试剂盒对线性化的质粒进行纯化;②mRNA的“加帽”：以线性化DNA为模板,合成带有5′端帽子结构的mRNA,添加TURBO DNase以除去模板DNA;③mRNA的“加尾”：以ATP为原料,利用试剂盒自带的Poly(A)聚合酶,对已经“加帽”的mRNA进行“加尾”,以合成结构完整的mRNA;④完整mRNA的纯化：按照MEGAclear^TM Kit试剂盒对mRNA进行纯化。随后,将体外转录获得各转录因子的mRNA进行浓度和OD值测定。分别比较总mRNA（EGFP和4种多能性转录因子的mRNA的质量分别为0.2μg）和脂质体2000 的比例为1:0.5、1:1.0、1:1.5、1:2.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2、4、6代GEF细胞的mRNA转染效率。对最佳转染体系下转染多能性转录因子mRNA的GEF细胞进行免疫荧光检测,并对转染多能性转录因子mRNA后GEF细胞的形态和数目进行观察。【结果】mRNA和脂质体2000 的比例为1:1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF细胞的mRNA转染效率均显著高于其他组（P＜0.05）,且本组细胞在形态和生长方面相对较好;免疫荧光检测表明,4种多能性转录因子的mRNA在GEF细胞中定位于细胞核,并获得稳定表达,在细胞质中不见多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的表达;GEF细胞在转染4种mRNA 24h后,细胞形态由梭状慢慢向圆形靠拢;细胞活力低于对照组（山羊成纤维细胞正常生长组）。【结论】GEF细胞在总mRNA和脂质体2000 的比例为1:1.0以及在最佳总mRNA与脂质体2000比例体系下第2代GEF的条件下更适合mRNA的转染。研究工作为mRNA转染体细胞或干细胞的研究及诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS）的获得提供参考资料,并对mRNA在成纤维细胞中的去向提供间接证据,有利于更加深入地了解多能性转录因子oct4、sox2、klf4、c-myc的mRNA相关功能。     

奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究

为获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞(gFFs),绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,并且研究了脂质体量、质粒量和转染时间对gFFs的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。结果表明:该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。24孔板中采用脂质体转染试剂4.0μL、质粒DNA 1.2μg,转染6 h可以获得最佳的转染效果,转染效率达4.21%。     

大载体转染猪胎儿成纤维细胞的电转条件优化

背景 随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维（porcine Fetal Fibroblasts,PFFs）细胞的转染效率有关。目的 研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM ^?830/NEPA 21/Nucleofector ^TM2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件。方法 使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1×10 ⁶个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率。结果 首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEPA 21转染PFFs的效率最高,为13.24%±1.63%,而Nucleofector ^TM 2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36%±3.95%。然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12 μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM ^?830和Nucleofector ^TM 2b转染PFFs的最佳质粒用量为12 μg,其转染效率分别为8.44%±0.90%（电转参数：脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3 次）和14.63%±3.21%(电转参数：U-023),而NEPA 21使用10 μg质粒转染PFFs时效率达到最高（6.09%±0.72%）。最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96%—48.39%。结论 因此Nucleofector ^TM 2b转染PFFs的最佳条件为：U-023程序、12 μg超螺旋质粒;NEPA 21为：脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10 μg超螺旋质粒;ECM ^?830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3 次条件下转染12 μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率。综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是Nucleofector ^TM 2b。     

猪源Lin28基因的克隆及其在猪胎儿成纤维细胞中的表达

Lin28广泛地表达于早期胚胎中,是重编程的一个重要诱导因子.根据GenBank中公布的猪源Lin28的序列设计合成引物,以猪桑葚胚cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增其编码区全序列.将此克隆片段连接到PMXs表达载体上,构建逆转录病毒载体PMXs-Lin28.在293T细胞中包装携带Lin28基因的逆转录病毒,感染猪如猪胎儿成纤维细胞(Porcine embryonic fibroblasts, PEF).免疫荧光及Real-time结果显示,PMXs-Lin28载体能够介导Lin28 mRNA和蛋白质在猪胎儿成纤维细胞中的高效表达,Lin28基因能够激活Oct4、Sox2、Nanog、Klf4和c-Myc基因的表达.     

猪耳成纤维细胞的体外培养及EGFP基因的转染

优化脂质体Liperfectamin 2000转染EGFP(加强型绿色荧光蛋白)至猪耳成纤维细胞的参数,如DNA和脂质体的用量、细胞汇合度、细胞暴露于DNA和脂质体复合物的时间。试验显示:24孔板内1.0μgDNA和2.4μL脂质体的用量转染效率最高,DNA和脂质体过量会对细胞产生毒性,影响转染效率;细胞汇合85%~90%才能得到较高的转染效率;细胞暴露4h转染效率最高,时间过长反而使转染效率下降。     

转VEGF和转Tβ4基因陕北白绒山羊粪便中菌群分析

以转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊与野生型陕北白绒山羊为研究对象,采集其新鲜粪便样品,用灭菌生理盐水进行梯度稀释后,分别接种LB固体培养基、TPY琼脂、胆硫乳琼脂、肠球菌琼脂、伊红美蓝琼脂和甘露醇盐琼脂培养基,37℃恒温过夜培养,再分别对平板上生长的所有需氧菌、双歧杆菌、沙门氏菌、肠球菌、大肠菌群和金黄色葡萄球菌进行菌落计数,并做显著性检验分析。结果表明,转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊与野生型陕北白绒山羊粪便中的需氧菌菌群结构之间不存在显著性差异。研究结果为转VEGF基因和转Tβ4基因陕北白绒山羊安全性评价研究提供了试验数据和研究基础。