镰形扇头蜱重组肌钙蛋白I抗蜱免疫保护效果的初步分析

为了评估镰形扇头蜱肌钙蛋白I（TroponinI,TnI）作为候选疫苗分子的潜力,应用肌钙蛋白I重组蛋白进行了抗蜱免疫实验。将重组蛋白按常规方法免疫新西兰兔,三次免疫后分别用若蜱、成蜱进行攻虫实验,观察其免疫保护效果。结果发现蜱的吸血行为受到一定的影响,与对照相比,若蜱和成蜱吸附率、饱血率、饱血体重和死亡率有显著差异,而在饱血时间上差异不显著,说明TnI基因的重组表达产物具有一定的免疫保护作用。     

镰形扇头蜱免疫球蛋白结合蛋白的表达及免疫保护分析

为在大肠杆菌中高效表达镰形扇头蜱免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin binding protein,IGBP),并对表达产物进行免疫保护效果测定,将IGBP基因克隆到pGEX-4T-1载体,转化到感受态细胞BL21,在IPTG诱导下进行表达;表达产物3次免疫家兔,剂量为500μg/只。3次免疫后进行攻蜱试验,观察免疫保护效果。结果发现在IPTG的诱导下,重组质粒pGEX-4T-1-IGBP在大肠杆菌中获得高效表达,产生GST-IGBP融合蛋白,用融和蛋白免疫家兔后,试验组与对照组成蜱饱血重量和死亡率差异显著(P<0.05)。表明重组质粒pGEX-4T-1-IGBP能在大肠杆菌中高效表达,且表达蛋白能够对家兔产生一定程度的抗蜱保护性免疫力。     

镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ(TnI)的cDNA并进行表达及鉴定。方法用RT-PCR方法从镰形扇头蜱总RNA中克隆编码肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段,将该cDNA连接到pET-32a( )表达载体,并转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western blot分析。结果获得镰形扇头蜱的eDNA,并在大肠杆菌中以包含体的形式高效表达,Westem blot分析表明,抗TnI重组蛋白兔血清可以识别蜱体内的TnI,并在22 kDa和36 kDa之间有两条带。结论蜱体内可能同时存在两个大小不等的TnI,为进一步的研究打下基础。     

镰形扇头蜱肌钙蛋白I基因的克隆及其分布

本试验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的EST中筛选了1个含polyA尾的基因序列,经5LRACE方法得到该基因全长序列.经同源性比较,该基因预测的氨基酸序列与长角血蜱肌钙蛋白I(GI14041807)的同源性为84.47%,肌动蛋白结合位点位于147-167氨基酸处,且与长角血蜱肌钙蛋白I肌动蛋白结合位点完全相同,表明该基因是镰形扇头蜱肌钙蛋白I基因.以镰形扇头蜱基因组DNA为模板扩增到编码肌钙蛋白I的基因组序列.序列分析表明该序列不含内含子.RT-PCR分析表明该基因在镰形扇头蜱的卵及其幼蜱、若蜱、成蜱的壳、唾液腺和肠均有表达.     

镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅱ基因的克隆及其分布

本试验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的EST中筛选了1个含polyA尾的基因序列,经5′-RACE方法得到该基因全长序列。经同源性比较,该基因预测的氨基酸序列与长角血蜱肌钙蛋白（GI：14041807）的同源性为84.47%,肌动蛋白结合位点位于147～167氨基酸处,且与长角血蜱肌钙蛋白肌动蛋白结合位点完全相同,表明该基因是镰形扇头蜱肌钙蛋白基因。以镰形扇头蜱基因组DNA为模板扩增到编码肌钙蛋白的基因组序列,序列分析表明该序列不含内含子。RT-PCR分析表明该基因在镰形扇头蜱的卵及其幼蜱、若蜱、成蜱的壳、唾液腺和肠均有表达。     

镰形扇头蜱-新基因的分离、克隆、表达和抗蜱免疫保护作用

目的分离、克隆镰形扇头蜱一新基因。方法本实验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的100个EST（Expressed Sequence Tag）序列中选取一个带有polyA尾的序列，经5’RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）得到此序列的全长基因，命名为RhHp2，基因全长1002bp，开放阅读框（ORF）从31bp至879bp，共848bp，编码282个氨基酸。经序列比较，RhHp2基因与其它序列在核苷酸水平上基本无同源性，但在氨基酸水平上与其它物种同源性最高可达50．81％。RhHp2基因连接于PET32a（＋）载体后克隆于表达菌B121，1mM IPTG诱导表达，产生分子量约为55kD的融合重组蛋白，并以不溶性包涵体形式存在。经纯化和体外复性的重组蛋白三次免疫新西兰兔后，将镰形扇头蜱未吸血成蜱和若蜱接种于此免疫兔耳，并对接种48h后的蜱上体数、蜱的饱血数量、饱血时间、饱血重量等进行记录。结果发现蜱的吸血行为受到一定影响，若蜱在48h的减虫率（上体数减少）为58％，在整个吸血过程中的死亡数增加，成蜱的饱血体重显著降低。结论此结果表明RhHp2基因的重组表达产物具有一定的免疫保护作用。     

镰形扇头蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的克隆和序列分析

蜱,隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨目,寄生于动物体表,以吸食动物血液为生.蜱广泛分布于世界各地,侵袭哺乳动物、爬行动物、鸟类,乃至两栖类等多种动物.蜱和其所携带的病原微生物,如螺旋体、巴贝西虫、贝纳柯克斯体等[1],对动物和人类的健康造成严重危害.肌动蛋白(Actin)是一类进化保守,在多数物种中存在的蛋白质超家族,其基因序列高度同源[2].Actin是细胞组成的基本单位,参与多种生理过程,如细胞运动、胞内运输、细胞质流动、内吞作用等[3].Actin基因及蛋白同时也是多数实验中的首选内参,对完善实验数据、数据分析和实验过程的逻辑性起到重要作用.目前少见对镰形扇头蜱成蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的报道.据此,我们克隆了三种硬蜱的Actin基因,进行了序列分析.     

镰形扇头蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Aclin基因的克隆和序列分析

蜱,隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨目,寄生于动物体表,以吸食动物血液为生。蜱广泛分布于世界各地,侵袭哺乳动物、爬行动物、鸟类,乃至两栖类等多种动物。蜱和其所携带的病原微生物,如螺旋体、巴贝西虫、贝纳柯克斯体等,对动物和人类的健康造成严重危害。     

镰形扇头蜱P0基因的克隆表达及初步鉴定

P0分子是一种核糖体蛋白,具有抗蜱免疫作用。本文采用RACE技术从镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)中获得了P0全长基因。通过对P0全长基因序列进行分析发现,P0全长基因为1 118 bp,具有一个编码319个氨基酸的开放阅读框,没有信号肽序列。推测P0的蛋白大小约为35 ku。P0与其他蜱种具有很高的同源性,与微小扇头蜱(Rhipicephalus microplus)和长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)的P0基因同源性分别为94%和87%。编码区克隆到表达载体p GEX-4T-1中,转化表达宿主菌BL21,可表达出分子量约为60 ku的重组融合蛋白。表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。表达产物经GST树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。抗P0重组蛋白鼠血清可以识别蜱体内的P0蛋白,大小在35 ku。研究结果将为镰形扇头蜱新型防治技术研究提供基础。     

镰形扇头蜱组胺结合蛋白RhHBP基因的克隆和重组表达

为了进行抗蜱及蜱传病疫苗的研究,本试验根据GenBank中的镰形扇头蜱组胺结合蛋白(Rhipicephalus haemaphysaloideshistamine bindingprotein,RhHBP)基因cDNA序列,设计一对特异性引物(内含EcoRI/XhoI酶切位点),经RT-PCR扩增了镰形扇头蜱组胺结合蛋白RhHBP的cD-NA,大小为603 bp,将其克隆到pGEM-Teasy中并测序。在去除编码RhHBP信号肽的核苷酸序列后,将其亚克隆到pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1-RhHBP,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为1 mmol/L IPTG诱导其表达,表达的融合蛋白大小为49 ku,以包涵体的形式存在。Western Blot分析表明,该蛋白具有良好的免疫原性。     

镰形扇头蜱唾液腺cDNA文库的构建

构建了镰形扇头蜱唾液腺 c DNA表达文库。用 Trizol试剂提取镰形扇头蜱唾液腺总 RNA,经反转录合成 c DNA第 1链 ,应用 L D- PCR扩增方法 ,合成双链 c DNA。用 Sfi 内切酶修饰此双链 c DNA,使形成两端分别带有 Sfi A和Sfi B的粘末端。经 CHROMA SPIN- 4 0 0柱纯化 ,收集 4 0 0 bp以上的双链 c DNA片段 ,将其连接于带有 Sfi A和 Sfi B末端的λ Tripl Ex2噬菌体载体 ,经体外包装后 ,以 XL1 - Blue为受体菌构建 c DNA表达文库。经测定 ,库容量为7.0 8× 1 0 5,重组率为 95 .2 %。扩增后的文库滴度为 1 .4 5× 1 0 9pfu/ m L。随机挑取 2 0个克隆转化到质粒 p Tripl Ex2 ,经抽质粒、测序得到 2个细胞色素氧化酶全长基因     

杀灭菊酯驱杀水牛镰形扇头蜱试验

流行病学调查与实验感染证明,镰形扇头蜱为水牛巴贝斯焦虫病的传播者(刘钟灵等,1986)。因此,杀灭牛体上该蜱是防制水牛巴贝斯焦虫病重要措施之一。关于灭蜱药物,国内以往曾采用有机氯(六六六或滴滴涕)及有机磷(敌百虫或敌敌畏、蝇毒磷等)     

镰形扇头蜱金属蛋白酶基因全长的克隆和序列分析

本研究从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的EST序列中筛选了一个含polyA尾的基因序列,经5′-RACE方法得到该基因全长序列。cDNA全长1 566 bp,编码区为23 bp～1 456 bp,编码478个氨基酸残基,该蛋白的预测分子量约为55 Ku,等电点为8.87。RT-PCR分析表明,该基因在镰形扇头蜱未吸血成蜱、半饱血成蜱以及唾液腺、肠中表达。     

镰形扇头蜱微管蛋白基因的分离和cDNA序列分析

分离和鉴定镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides,Rh）新基因,为防治镰形扇头蜱提供药物靶标或候选疫苗。从镰形扇头蜱唾液腺抑制消减杂交文库中筛选了一条编码微管蛋白的基因片段,通过3＇-RACE的方法得到全长序列;采用生物信息学技术等对该cDNA进行分析。获得1个镰形扇头蜱新基因-微管蛋白基因（RhM1）,全长680bp,开放阅读框（ORF）全长537bp,编码179个氨基酸。编码蛋白的理论分子量为20KDa,等电点为4.71;抗原表位可能位于cDNA序列N末端第18~25氨基酸处。     

镰形扇头蜱组胺结合蛋白全长基因的克隆与分析

从本实验室构建的镰形扇头蜱（Rhipicephalus haemaphysaloides）抑制消减杂交cDNA文库中选择了1条可能编码组胺结合蛋白（HBP）的EST序列（RhHBP）,以5′末端快速扩增的方法（5′RACE）扩增获得5′末端序列,拼接获得全长基因。DNAMAN（v4.0）、DNAstar（v4.0）和Genetyx（v4.0）软件分析阅读框、编码产物、序列同源性和系统进化,同时也分析了该基因在吸血前后雌雄蜱体内的表达情况。5′RACE法获得1条约400 bp的DNA片段,克隆测序,拼接获得1条长803 bp的全长基因,编码219个氨基酸残基。该基因在吸血雌蜱唾液腺内特异表达,初步分析该基因是组胺结合蛋白基因。     

镰形扇头蜱Subolesin基因的长链dsRNA电转化和干扰效果研究

为建立针对不同发育阶段蜱的长链dsRNA电转化导入方法,本研究以我国优势流行的硬蜱镰形扇头蜱为对象,以蜱的保守基因Subolesin作为目标基因,将荧光标记的Subolesin-dsRNA对卵、幼蜱以及若蜱3个发育阶段进行电转化监测dsRNA的转化效果,对电转化后不同时间以及不同dsRNA电转化浓度进行优化,并接种小鼠观察电转化Subolesin-dsRNA对幼蜱及若蜱吸血的影响。结果显示,电转化Cy3荧光染料标记dsRNA后,卵、幼蜱及若蜱体内均有点状分布的荧光。若蜱于电转化后放置8h,Subolesin mRNA沉默效果较佳。此外,卵、幼蜱及若蜱分别在dsRNA浓度为10μg/m L、5μg/m L~25μg/mL及10μg/m L~25μg/m L沉默效果较好。Subolesin-dsRNA干扰后蜱的存活率和吸血能力均显著降低。本研究建立的针对各个发育阶段蜱的高效长链dsRNA电转化方法为研究基因功能和沉默特定的基因提供了新的ds RNA导入方法。     

镰形扇头蜱唾液腺、中肠和卵的菌群结构

采用PCR-DGGE技术分析了镰形扇头蜱雌成蜱中肠内容物、唾液腺、虫卵的菌群结构。无菌条件下采集镰形扇头蜱雌成蜱中肠内容物、唾液腺、虫卵,提取细菌总DNA;以通用引物扩增细菌16SrDNA V3区;DGGE电泳,回收、克隆、测定DGGE优势条带。结果表明,饱血和半饱血雌蜱中肠菌群结构相同,中肠内容物、唾液腺和虫卵部分细菌相同;9条明显条带的序列分别与柯克斯体属(Coxiella sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、涅斯捷连科菌属(Nesterenkonia)、共生菌(Symbiotic bacteria)和未培养土壤细菌的16SrDNA V3区序列高度相似。分离到2株细菌,为模仿葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌。     

镰形扇头蜱巨噬细胞移动抑制因子的克隆、表达及酶活性分析

为了探究镰形扇头蜱巨噬细胞移动抑制因子(Rhipicephalus haemaphysaloides macrophage migration inhibitory factor, RhMIF)基因的功能，试验采用RT-PCR方法对RhMIF基因开放阅读框进行扩增，运用大肠杆菌表达体系对RhMIF蛋白进行体外重组表达，随后对纯化后的RhMIF重组蛋白进行互变异构酶活性分析。结果表明：RhMIF基因开放阅读框大小为351 bp,编码116个氨基酸；RhMIF重组蛋白在大肠杆菌上清液中成功表达，大小为17.4 ku; RhMIF重组蛋白具有互变异构酶活性。说明本试验通过大肠杆菌表达体系成功表达了具有酶活性的RhMIF重组蛋白。     

镰形扇头蜱丝氨酸蛋白酶SP30基因的克隆及原核表达

根据丝氨酸蛋白酶保守性氨基酸序列设计引物,以镰形扇头蜱半饱血雌蜱cDNA为模板,经PCR扩增得到SP30基因的保守区,通过5’RACE(rapid amplification of cDNA Ends)和3’RACE技术得到全长基因。将该基因连入原核表达载体pGEX-4T-1,经IPTG诱导纯化得到重组蛋白。以镰形扇头蜱卵、幼蜱、若蜱、成蜱各发育阶段的cDNA为模板进行Real-timePCR实验。结果显示,SP30基因全长1194 bp,开放阅读框长900 bp,编码299个氨基酸,预计蛋白分子质量30 kDa。Real-time PCR分析结果表明,该基因在四个不同的发育阶段均有不同程度的表达。     

镰形扇头蜱卵巢中丝氨酸蛋白酶抑制分子群的克隆和生物信息学分析

丝氨酸蛋白酶抑制分子(serine protease inhibitor,Serpin)参与多种生物学过程,对蜱的吸血发育、生殖产卵和先天免疫系统反应等具有重要作用,在蜱体内以多分子形式存在。为了研究蜱生殖相关的Serpin分子群,本研究通过构建镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)卵巢转录组测序数据库,发现并克隆了10条Serpin家族基因(RhS),其中3条为分泌型Serpin,6条为细胞内Serpin和1条亲缘关系较远的Serpin。本研究通过生物信息学方法分析其理化性质、遗传进化关系,预测其结构和功能,为镰形扇头蜱Serpin分子群的功能解析和应用研究提供了重要基础。