广东地区副猪嗜血杆菌KRG血清分型及基因分型多态性分析

本研究对保存的2007～2008年广东地区发病猪群中分离的48株副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)进行了分析.用琼脂扩散进行血清分型,结果表明48株临床分离菌株鉴定出7个血清型,其中以5型为主,占总菌株的23.68%.采用肠杆菌基因间重复序列-PCR(Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR)法进行基因分型分析,结果显示,48株不同来源副猪嗜血杆菌菌株基因型呈现多态性分布;分析得到31个基因型PHYLIP-3.68软件对31个基因型的电泳图谱进行基因分型及遗传关系的分析,结果得到8个群,其中B为优势群,占总菌株数的66.67%.表明广东地区的副猪嗜血杆菌的基因型和血清型十分丰富,ERIC-PCR技术可成为其分子流行病学研究的有效手段.     

来自海南等地的17个Bt分离株质粒多样性分析

本研究采用琼脂糖凝胶电泳对分离白海南岛的12个反菌株与分离自广西、黑龙江的5株＆菌株及2株胁模式菌株进行质粒数量、大小等特征分析。19个供试菌株可区分为16种独特的质粒电泳图谱,充分显示出不同来源肪菌株的质粒多样性。进一步选择了其中的10个菌株,利用包埋法制备琼脂块进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）,结果表明苏云金芽孢杆菌大质粒组成特征也具有丰富多样性。但是供试菌株的质粒电泳图谱并未体现与地理和生态特征相关联的特征差异。研究结果初步证实海南分离株S3078—1是一株无内生质粒的助菌株,而S3031-1和S3073—1两个分离株仅有一个大质粒存在,这三个分离株将为进一步研究质粒功能提供初始菌株。本研究进一步暗示将琼脂糖凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳结合起来研究质粒特征提高了结果的可靠性。     

阴沟肠杆菌B29菌株脂多糖合成基因（waaL,waaG）缺失突变株的构建及分析

脂多糖（LPS）在革兰氏阴性细菌中的功能作用在不同菌株中已有研究,但尚未有对肠杆菌属LPS结构与功能的报道。本研究试图构建能引起肥胖的阴沟肠杆菌B29菌株waaL和waaG基因的缺失突变株,以了解突变体菌株产生的LPS结构与活性与野生菌株产生的LPS的差异。根据同源重组技术原理,利用广宿主自杀性质粒构建成敲除载体pKNG101△waaL和pKNG101△waaG,转化E.coli SM10菌株,并与B29菌株进行双亲杂交,再以抗生素和蔗糖筛选条件筛选waaL和waaG基因缺失突变株;利用多重PCR、ERICPCR、PCR-DGGE、DNA测序结果均证实突变株B29△waaL和B29△waaG构建成功;最后,对野生菌株B29与两个突变株生物学特性的差异进行了比较。银染实验结果表明野生型B29菌株的脂多糖为光滑型结构,突变株的LPS结构明显缺失O抗原,B29△waaG突变株同时还缺失了外部核心部分;用鲎试剂法检测LPS的内毒素活性显示,突变株的内毒素活性与野生型相比有较大幅度下降;B29△waaL突变株的生长速率与野生型相当,而B29△waaG突变株的生长速率则相对降低。本研究成功构建两种内毒素活性下降的突变株,为下一步利用突变株研究B29菌株在肥胖发生中的机制奠定基础。     

菲降解菌的分离鉴定及其在污染土壤生物修复中的应用

采用室内培养方法,从吴江市郊长期被多环芳烃污染的土壤中富集到以菲为唯一碳源和能源的菲降解复合微生物菌群,复合菌群在7d内对无机盐液体中菲（含量100mg·L^-1）的降解率达到99%。从复合菌群中分离纯化获得两株菲高效降解菌B1和L2,经过菌体形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析,鉴定菌株B1为百日咳博行特氏菌（Bordetella petrii）,菌株L2为墨西哥假黄单胞菌（Pseudoxanthomonas mexicana）。这两株菌在菲含量为100mg·L^-1的无机盐培养液中,7d内对菲（含量100mg·L^-1）的降解率大约为80%,9d内的降解率可达到99%。将复合菌群和菲污染土壤混合,在光照培养箱中进行培养修复。结果表明,修复88d后,接种复合菌群的低污染浓度（8.22mg·kg^-1）处理和高污染浓度（39.65mg·kg^-1）处理的菲去除率分别达到95.74%和98.06%。     

蚯蚓粪中乳酸菌的分离及其在大肠杆菌O157：H7中的抗菌活性

本研究利用SL培养基从蚯蚓粪中分离到54株具有产酸性能的菌株,并以E.coli O157：H7（EDL933株）作为指示菌株,采用点种法检测分离菌株的抑菌活性。结果表明其中6个菌株对指示菌具有拮抗作用,通过形态特征,结合16S rDNA序列分析,初步鉴定该6个菌株分别为食物魏斯特菌（Listeria welshimeri）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）和格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）。分离到的乳酸菌对E.coli O157：H7（EDL933株）具有显著的抑制作用,发酵温度和初始pH值影响发酵液的抑菌作用,优化环境因子可以促进拮抗菌对E.coli O157：H7的抑制作用。本研究为进一步分离抗菌产物用于人畜共患病的预防和治疗提供了理论依据。     

秤锤树叶片内生真菌的分离鉴定及其对植株生长的影响

本研究从秤锤树叶片中分离内生菌进行分子鉴定,并接种到无菌组培苗中研究其对植株生长的影响。研究结果显示,从秤锤树叶片中共分离获得7株真菌。扩增出的6个菌株经ITS测序,在NCBI网站上进行基因序列比对,鉴定出其中5株菌株均属于球毛壳菌（Chaetomium globosum）,1株属于子囊菌（As-comycete）。进一步实验表明：分离的菌株多数对组培苗的株高生长影响不大,可初步鉴定其为内生菌,其中的属于球毛壳菌的F和H菌株对无菌苗的株高有明显的促进作用。     

复合菌群的构建及其对石油污染土壤修复的研究

从石油污染土壤中富集分离、筛选出3株高效降解石油的微生物菌株,通过生理生化特性研究及16SrRNA基因序列分析,确定3株菌均属于红球菌属（Rhodococcus sp）,研究和比较了它们与实验室保存的4株菌（分别属于Gordonia sp,Comamonas sp,Pesudomonas sp）降解石油的能力。这7株菌株对石油的不同组分具有不同的降解能力,对7株菌进行不同的组合用以研究复合菌群对石油的降解。结果表明,由两株Rhodococcus sp,一株Gordonia sp和一株Pesudomonas sp组成的复合菌群D,降解石油的能力超过任何单一菌株和其他组合菌群。混合菌群D在5d的培养中能降解70.3%的石油总量和71.4%的芳香化合物。混合菌群D能降解99.8%的C13-19烷烃,92.6%的C20-26烷烃,82.2%的C27-32烷烃以及90.2%的植烷。在实验室模拟条件下,对土壤中石油的降解率达到50%以上。降解土壤中石油的最适温度为10～30℃、pH值为6.5～9.5,接种量需要在106CFU·g-1以上。     

高效纤维素优势分解菌的筛选和鉴定

本试验基于获得高效纤维素优势分解菌的目的,通过分离纯化初步得到30株菌株,利用刚果红染色法初筛共得到14株纤维素分解菌,并通过滤纸条崩解实验进一步进行筛选得到5株效果较好的纤维素分解菌,通过发酵产酶利用DNS显色法测定CMC酶活力和FPA酶活力最终确定了4株优势纤维素分解菌,通过测定4株菌株的羧甲基纤维素酶(CMCase)、滤纸酶(FPA)以及β-葡萄糖苷酶(β-Gase)活,验证4株纤维素优势分解菌的产酶能力,并分别命名为X-1、X-6、X-7和X-11,并将该4株优势纤维素分解菌应用于秸秆的液态发酵,其对秸秆的降解率较自然降解相比,降解率分别提高了31.92%、40.15%、35.29%和39.98%。对4株优势菌株进行了分子鉴定,根据16S r DNA序列比对结果表明,菌株X-1、X-7和X-11均为粪产碱杆菌;菌株X-6属于解糖假苍白杆菌。     

养殖欧洲鳗鲡不同体位及其养殖水体中的菌群组成研究

为探明养殖欧洲鳗鲡不同体位及其养殖水体中可培养菌群的组成结构,本研究利用16S rDNA序列分析法对从精养池鳗鲡的鳃部、肠道和表皮及其养殖水体中分离得到的可培养细菌进行了分子鉴定并构建了系统发育树。研究结果显示,鳃部、肠道、表皮和水体的菌密度分别为1.6×10^6 cfu/g、2.2×10^7 cfu/g、1.4×10^4cfu/cm2和4.5×10^3 cfu/mL;分离菌株分别属于γ-变形菌纲的肠杆菌属、不动杆菌属、栖水菌属,β-变形菌纲的食酸菌属,芽孢杆菌纲的葡萄球菌属、气球菌属,黄杆菌纲的金黄杆菌属和放线菌纲的微球菌属等5大类8个菌属。其中,微球菌属、肠杆菌属和栖水菌属分布最广,各样品中均有检出;而气球菌属和食酸菌属仅在鳃部分布。各生态位中,鳃部菌群最为多样,含有葡萄球菌属之外的7个属;而水体菌群种类最少,只有4个属。此外,菌群组成含量的分析结果表明,鳗鲡鳃部以金黄杆菌属（28.3%）和肠杆菌属（26.1%）居多;而肠道、表皮和养殖水体都以微球菌属占绝对优势,分别为43.6%、53.5%和74.8%。     

几株固氮芽孢杆菌的分离与鉴定

摘要： 从小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、黑麦草（Lolium sp.）和柳树（Salix sp.）的根际土壤中分离得到能在无氮培养基上生长的29株芽孢杆菌（Bacilli），通过固氮酶活的测定以及固氮酶结构基因 nifH 的PCR扩增得到7株固氮芽孢杆菌。对这7株固氮菌株进行了生理生化性状测定、16S rDNA序列分析(GenBank accession No. AY373358, AY373360,~AY373364和AY376876)、G+C mol%含量的测定及DNA-DNA杂交实验，结果表明，其中5株菌属于芽孢杆菌，另外2株菌属于类芽孢杆菌。在这7株被鉴定的菌株中，菌株T1被鉴定为Bacillus cereus；菌株G1、C4和C5被鉴定为B. megaterium；菌株W5的生理生化性状、16S rDNA和G+C mol%与Bacillus marisflavi 相近；G2的生理生化性状和16S rDNA 与Paenibacillus polymyxa 接近，但在基于16S rDNA的系统发育树中却与P. durus 聚在最小的分支内；T7可能是Paenibacillus属中的一个新种。     

我国南方部分稻区稻瘟病菌的群体结构

用重复序列探针ＭＧＲ－５８６，与限制性内切酶ＥｃｏＲＩ组合，分析了我国南方部分稻区８６个稻瘟病菌株的限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰｓ）依其ＭＧＲ－ＤＮＡ指纹的相似性，结合病菌的致病型测定，将表现为２８个不同致病型的８６个稻瘟病菌株区分为１８个系谱，每个系谱的寄主范围有限，且显示出不同栽培稻区内稻瘟病菌的群体结构有明显差别。本研究通过分析一稻区内稻瘟病菌的群体遗传结构，用分子生态学的方法探索病流行的     

一株产生氨氮和亚硝酸盐氮菌的筛选鉴定及特性研究

从4个草鱼池塘中分离和定性筛选获得29株能够产生氨氮和亚硝酸盐氮的菌株。通过对编号为C95的菌株进行菌落形态学观察和16S rDNA序列分析,表明该菌株为革兰氏阴性杆状菌,与寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）的同源性达98%。采用单因素多水平试验对菌株的产氨氮和产亚硝酸盐氮特性进行研究发现：（1）氮源、碳源、温度和摇床转速都能显著影响菌株的生长及产生氨氮和亚硝酸盐氮的含量,但pH（5～9）对其无显著影响（P〉0.05）;（2）该菌株生长及产生氨氮和亚硝酸盐氮最适宜的培养基以及培养条件为：LB、pH 5～9、25℃、150 r.min-1。由C95作为指示菌株筛选得到SC01、SC07两株（2/33）去除氨氮和亚硝酸盐氮效果较好的菌株。因此,C95可作为筛选具有降氨氮和亚硝酸盐氮功能的有益菌的指示菌株。     

镰刀菌rDNA ITS区 RFLPs分析

本实验采用PCR-RFLP技术分析了镰刀菌菌种间的多态性。运用SDS碱裂解法抽提了采自于山西省不同地区的11株镰刀菌（Fusarium）基因组DNA，并用一对特异性引物对其rDNA ITS区段进行扩增，选用4种限制性内切酶（TaqⅠ AluⅠ HaeⅢ EcoRⅠ）酶切PCR扩增产物，共得到16条多态性片段，其中特异性条带8条，分子量大约在70-900bp之间。利用NTSYS-PC(2.1)软件包分析各菌株间的DNA限制性片段多态性，总共可以分为５大组，与传统分类一致，说明该方法可以用于镰刀菌菌株间的多态性分析。     

广西桑树细菌性枯萎病菌致病力和遗传多样性分析

从广西9个县市采集具有典型枯萎症状桑树样品和发病田块土壤样品,经分离纯化获得致病性菌株105株。依据在桑树品种桂桑优12的致病性强弱,将广西桑树细菌性枯萎病菌株分为强致病力（57株）、中等致病力（17株）和弱致病力（31株）三种致病型。对48个代表性致病菌株进行16S rDNA和rpoB基因序列测定,同源性分析和系统进化树分析结果显示,这48个菌株分别为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae（16株）、阿氏肠杆菌（E.asburise）（13株）、桑肠杆菌（E.mori）（7株）、产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）（3株）以及未确定种的肠杆菌属（Enterobacter sp.）3株、克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）6株。阿氏肠杆菌和阴沟肠杆菌出现的频率最高,是广西的优势菌株。研究结果表明,广西桑树细菌性枯萎病菌具有丰富的遗传多样性。     

西北部分矿区豆科植物根瘤菌重金属抗性及16S rDNA RFLP分析

从生长在西北部分矿区的豆科植物根瘤中分离筛选到对重金属有抗性的38株根瘤菌,采用PCR-RFLP分子技术进行16S rDNA指纹图谱分析,选取每种类型的代表菌株进行16S rDNA全序列测定,建立系统发育树状图,并对38株菌进行Zn、Hg、Cu、Cd和Pb5种重金属的抗性研究。结果表明,供试菌株分别归属于中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、根瘤菌属（Rhizobium）和土壤杆菌属（Agrobacterium）。代表菌株CCNWSX1277和CCNWSX1294可耐受2.0mmol·L-1的Zn2＋,CCNWSX1277可耐受0.25mmol·L-1的Hg2＋,多数代表菌株可耐受1.6mmol·L-1的Cu2＋,仅3株代表菌株可以耐受Cd2＋,其中CCNWSX1277能耐受1.4mmol·L-1的Cd2＋,所有代表菌株能耐受2.5mmol·L-1的Pb2＋。Agrobacterium属的2株代表菌株对5种重金属均有较强的耐受性;而Rhizobium属的4株菌和Sinorhizobium属的3株菌对5种重金属的耐受性不同,表现出较大的差异。总体来看,供试菌株对重金属的耐受性顺序为Agrobacterium〉Rhizobium〉Sinorhizobium。     

盐生植物解磷菌的筛选及促生效应研究

为丰富耐盐碱的解磷菌资源,探究其对盐碱环境中非盐生植物的促生效果,利用选择性培养基,从新疆南部克孜勒苏柯尔克孜自治州荒漠盐碱地3种典型盐生植物中分离解磷菌,并基于16S rRNA基因的限制性酶切末端片段长度多态性（PCR-RFLP）和系统发育分析进行菌种鉴定,挑取解磷能力突出的优良菌株接种至拟南芥和小麦验证其促生效果。结果表明,共分离到141株解磷菌,解有机磷菌株的解磷率介于1.5%～7.6%之间,解无机磷菌株的解磷率介于1.1%～4.7%之间,其中解无机磷量与发酵液pH值呈显著负相关。所有菌株隶属于8个菌属,以肠杆菌属（Enterobacter）占绝对优势。接种解磷菌株显著增加了非盐碱胁迫下的拟南芥幼苗生物量,尤以解有机磷菌株MHSC29和解无机磷菌株MHCB24的作用最强。接种解磷菌对盐碱土中小麦的地上部分（株高、茎粗、地上干重、叶绿素含量）和地下部分（根干重）均有积极影响,以解有机磷菌株MHSC29、MHCC3和解无机磷菌株APCB2效果最突出。本研究所得菌株进一步充实了耐盐碱解磷菌种的资源库,具备开发为盐碱地微生物肥料的潜能。     

根际溶铁细菌与AM真菌协同提高石灰性土壤铁有效性的机制研究

石灰性土壤普遍存在铁有效性低导致的植物缺铁黄化现象,严重影响农业可持续发展。筛选高效溶铁细菌并探讨其与菌根真菌（AMF）协同提高土壤有效铁含量、改善植物铁营养机制具有重要意义。以石灰性土壤和番茄（Lycopersicon esculentum）为试材进行盆栽试验,分别接种Advenella kashmirensis（B1）、Arthrobacter cupressi（B2）、Klebsiella variicola（B3）、Variovorax guangxiensis（B4）和Enterobacter ludwigii（B5）5株细菌,以不接菌处理为对照（CK）,筛选出高效溶铁菌株B1、B2和B3。将其与纯培养得到的AM真菌孢子（Rhizoshagu irregularis, Ri）组合,设置单独接种AM真菌（Ri）、单菌与Ri（B1+Ri、B2+Ri和B3+Ri）、菌群与Ri（B1+B2+B3+Ri）共接种处理,进一步探究单菌及菌群与AMF协同促进石灰性土壤难溶性铁的活化和促进植物铁吸收的机制。结果表明：（1）与对照相比,接种B1、B2和B3能够显著促进番茄生长,根系和地上部全铁积累量分别提高6.48倍和2.61倍（B1）、4.11倍和2.03倍（B2）、4.37倍和2.25倍（B3）;新叶活性铁含量分别提高74.21%、1.33倍和1.75倍。（2）与单接AMF相比,不同共接种组合显著增加番茄生物量,各部位平均全铁积累量显著提高58.32%~119.43%,其中B3+Ri处理、B1+B2+B3+Ri处理下番茄根系活性铁含量分别提高41.47%和44.30%、新叶活性铁含量分别提高12.61%和12.77%。不同共接种组合处理显著提高AM真菌的菌根侵染率,较单接AM真菌处理提高13.35%~30.99%;根系铁还原酶活性增加9.86%~22.07%,根系LeFIT1、LeFRO2和LeMYB72基因表达显著上调。与单接AM真菌相比,B3+Ri和B1+B2+B3+Ri处理下根际土壤pH分别降低0.21和0.09,土壤有效铁含量分别提高15.78%和55.23%。综上,AM真菌与3株高效溶铁细菌的协同作用可显著提高石灰性土壤铁有效性并改善植物铁营养,不同类型溶铁细菌与AMF的协同作用机制不同,为解决石灰性土壤铁有效性低的问题提供了微生物途径。     

不同农田生境对通俗腔蚓肠道菌群结构的影响

【目的】蚯蚓肠道微生物种类繁多，其中细菌群落对蚯蚓适应不同的生境具有重要作用，而关于蚯蚓肠道菌群的研究多集中于养殖型蚯蚓，野生蚯蚓的研究相对缺乏。【方法】为解析不同生境野生蚯蚓肠道的菌群差异，本研究采集河北省沧州市农林科学院试验田中的黄瓜地和辣椒地的通俗腔蚓（Metaphire vulgaris），并通过高通量测序对其肠道细菌群落进行了分析。提取蚯蚓肠道微生物总DNA，特异性扩增16S rRNA基因的V3-V4区，利用Illumina Hiseq 2500测序平台进行双端测序，然后对OTU(operational taxonomic unit)归类，并进行物种组成分析、Alpha和Beta多样性分析、样品组间统计分析。【结果】蚯蚓肠道分离土样中CZM（采自辣椒地的蚯蚓）和CZH（采自黄瓜地的蚯蚓）相对丰度大于1%的优势菌属分别为12和13个，肠道细菌中门水平相对丰度最高的是变形菌（Proteobacteria）。同时，还发现一些未分类的细菌，CZH肠道菌群中未分类的细菌较多，且CZH肠道细菌多样性指数也高于CZM。此外，CZH和CZM肠道细菌中丰富度位于前30且有属类分析的OTU代表性...     

步双重PCR法检测梨火疫病原细菌(Erwinia amylovora)

由梨火疫病原细菌（Erwinia amylovora）导致的火疫病（fire blight）是梨、苹果及其它蔷薇科植物上的毁灭性病害,我国将其定为对外一类检疫性有害生物。该病随种苗、果实及包装材料传播。目前国际上所建立的E.amylovora分子检测技术主要基于该病菌所含有的pEA29质粒序列,研究发现失去质粒的人工突变菌株的致病力下降，认为质粒对于梨火疫病菌的致病力是至关重要的。虽然带有pEA29质粒的梨火疫病菌菌株在自然界中占有绝对的数量，但Llop et al．（2006）报道了自然侵染的植物中存在具有致病力但不含pEA29质粒的梨火疫病菌（IVIA1614-2a菌株）。     

淡水鱼产气荚膜梭菌的分离及毒素型的鉴定

为研究产气荚膜梭菌在淡水鱼中的分布及毒素型,随机采取同一水库的鲤鱼、鲢鱼、鲫鱼、鲶鱼、黄鳝等淡水鱼样品420尾,细菌学方法分离肠内容物中的产气荚膜梭菌,PCR方法检测分离菌株的毒素基因确定毒素型,PCR扩增片段克隆后进行核苷酸序列分析并且与Genebank相应基因进行同源性比较。结果：自75份肠内容物样品中分离出产气荚膜梭菌;58株为C型（α、β毒素基因）,13株为A型（α毒素基因）,4株为B型（α、β、ε毒素基因）;三型菌株均能扩增出特异性2条带;检出基因与Genebank相应基因的同源性为98.15－99.29%。在淡水鱼检出产气荚膜梭菌的α、β、ε、β2毒素基因,在B型产气荚膜梭菌中扩增出2毒素基因均属首次,本研究对水体环境的污染及人类的食品安全有一定的指导意义。