Scriptaid处理牦牛成纤维细胞对组蛋白乙酰化及重编程的影响

供体细胞的不完全重编程是克隆动物成功率低的主要原因。本研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid对牦牛(Bos grunniens)成纤维细胞重编程的影响,以及Scriptaid处理供体细胞对牦牛-黄牛(Bos taurus)异种核移植(interspecies somatic cell nuclear transfer,iSCNT)胚胎体外发育的影响。分别利用0、500、1000、1500和3000nmol/LScriptaid处理牦牛胎儿成纤维细胞,观察细胞形态、统计细胞活率、测定细胞周期、检测组蛋白乙酰化水平,并以处理后的成纤维细胞进行体细胞核移植,检测重构胚体外发育水平。结果显示,经Scriptaid处理24h后,细胞形态发生了改变,细胞增殖受到明显抑制,大量细胞被阻滞在G0/G1期;随着Scriptaid处理浓度的增加,细胞组蛋白H3K9ac乙酰化水平逐渐提高;以1000nmol/L Scriptaid处理的成纤维细胞作为供体细胞后的囊胚率显著高于其他组(P<0.05)。研究结果表明,Scriptaid能显著提高牦牛成纤维细胞的乙酰化水平,以1000nmol/L Scriptaid处理供体细胞显著提高了牦牛-黄牛异种克隆胚胎的体外发育。本研究初步证实Scriptaid是通过提高成纤维细胞的乙酰化水平来促进核的重编程,为研究供体细胞的重编程以及异种克隆牦牛提供理论依据。     

黑麂耳成纤维细胞培养及异种重构胚构建

黑麂(Muntiacus crinifrons)是我国特有的珍稀濒危物种。采用组织块贴壁法获得了纯化的黑麂耳成纤维细胞。用3种不同的培养液(DMEM(低糖)、DMEM(高糖)和RPMI-1640)对第3代细胞进行培养,结果细胞群体倍增时间相近,DMEM(低糖)的培养效果稍好。以黑麂耳成纤维细胞为核供体,以山羊和兔卵母细胞为胞质受体,通过核移植构建异种克隆胚,囊胚率分别为0和11.5%,结果表明两种胞质受体均能支持黑麂耳成纤维细胞核的重编程,但重构胚的发育能力有所差别。     

供体细胞不同性别和处理方式对异种克隆牦牛胚胎发育的影响

以黄牛(Bos taurus)卵母细胞为受体,牦牛(Bos grummiens)耳成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植,研究供体细胞性别、细胞周期同期化处理方式及冷冻对异种克隆牦牛胚胎发育的影响.结果显示,雄性供体细胞的异种克隆牦牛囊胚发育率显著高于雌性供体细胞(56.6% vs 39.5%,P<0.05),但卵裂率和囊胚细胞数差异不显著;血清饥饿和接触抑制提供的供体细胞对异种克隆牦牛胚胎发育率和胚胎质量的影响没有明显差别;供体细胞冷冻-解冻组的克隆胚胎卵裂率明显低于新鲜消化组(54.5% vs 78.2%,P<0.05),但两组之间的囊胚率和囊胚细胞数没有显著差异.说明供体细胞的性别对异种克隆牦牛囊胚发育有影响,而同期化处理和细胞冷冻对异种克隆牦牛囊胚发育影响很小.     

自体或异体小鼠卵丘细胞核移植胚胎的发育

体细胞核移植胚胎发育到成体和许多因素有关,如供体细胞的种类(Wakayama et al.,2005;Saito et al.,2004),性别和基因型(Wakayama et al.,2005),线粒体(Bruggerhoff et al.,2002)等.供体细胞核在卵胞质因子作用下重编程,抑制自身基因表达,恢复为胚胎发育所必需的基因表达状态.本研究比较了来自同一雌鼠(SI)或者不同雌鼠(DI)的供体细胞对核移植胚胎的发育影响.     

供体细胞不同来源和处理方式对牦牛异种克隆胚胎发育的影响

本文以黄牛卵母细胞胞质为受体,牦牛耳成纤维细胞为核供体进行体细胞核移植,研究供体细胞性别、细胞周期同期化处理方式及冷冻对牦牛异种克隆胚胎发育的影响。结果显示：雄性供体细胞的牦牛异种克隆囊胚发育率显著高于雌性供体细胞（56.6% vs 39.5％,P﹤0.05）,但卵裂率和囊胚细胞数差异不显著;血清饥饿和接触抑制提供的供体细胞对牦牛异种克隆胚胎发育率和胚胎质量的影响没有明显差别;供体细胞冷冻后解冻组的克隆胚胎卵裂率明显低于新鲜消化组（54.5％ vs 78.2％,P﹤0.05）,但两组之间的囊胚率和囊胚细胞数没有显著差异。说明供体细胞的性别对牦牛异种克隆囊胚发育有影响,而同期化处理和细胞冷冻对牦牛异种克隆囊胚发育影响很少。     

猪体细胞核移植重构胚发育异常及印迹基因表达特征研究的进展

由于猪的器官极可能成为人类未来器官的供应源,猪体细胞核移殖及转基因等方面的研究已成为全球的热点。近几年来,猪体细胞核移植研究取得了一定的进展,但总体来看核移植效率还很低(1%~2%),还需要不断完善核移植程序及对一些基础问题的深入研究。本文主要对猪体细胞核移植重构胚发育异常及“印迹”基因表达特征作一综述与分析,旨在为研究者提供一些有益的启示。     

供体细胞处理方法对水牛核移植效果的影响

本研究探讨了水牛供体细胞不同培养处理方法对细胞周期及其核移植效果的影响。流式细胞仪分析供体细胞周期的结果显示,水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞,在增长期、汇合长满期或经血清饥饿培养或0.1μg/mL蚜栖菌素(APD) 0.5%胎牛血清(FBS)培养处理后,G0 G1期细胞比率差异显著(P<0.05),其中以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理的G0 G1期细胞比率最高(87.89%和89.04%);而增长期的G 2 M期的细胞比率以及汇合长满期的S期细胞比率明显高于其他三组,但经血清饥饿处理后,DNA碎片明显高于其他三组(P<0.05)。当分别以0.1μg/mL APD 0.5?S培养处理后的水牛胎儿耳皮成纤维细胞或颗粒细胞作供核时,重组胚的卵裂率及囊胚发育率,均显著高于血清饥饿处理或汇合长满期的同种供体细胞(成纤维细胞:70.14%vs 58.29%和55.90%,21.33%vs 10.55%和8.72%;颗粒细胞:74.35%vs 60.51%和57.61%,22.17%vs10.26%和9.78%,P<0.05),但汇合长满期或血清饥饿处理的供体细胞构建的重组胚,其卵裂率和囊胚率均没有显著差异(P>0.05)。将经APD处理后的供体细胞构建核移植胚胎,移植给受体水牛后有1头受体水牛妊娠并成功的产下后代。以上结果表明:0.1μg/mL APD 0.5?S预培养处理供体细胞,能有效的抑制细胞停留在G0/G1期,并能提高其核移植胚胎的发育率,而且已成功的获得后代。但在本培养系统中,血清饥饿处理供核细胞是没有必要的。     

亮甲酚蓝染色筛选及曲古抑菌素A对东北野猪核移植胚发育的影响

体细胞克隆的效率一直较低,这可能与成熟前卵母细胞的质量有关。猪卵母细胞主要来源于屠宰场的废弃卵巢,这暗示,卵母细胞可能处于发情周期的各个阶段。因此,体细胞核转移之前有必要筛选优质卵母细胞。本研究旨在探讨亮甲酚蓝染色筛选及曲古抑菌素A(TSA)对东北野猪(Sus scrofa ussuricus)核移植胚发育的影响。卵丘卵母细胞复合体经亮甲酚蓝(BCB)染色后分三组:BCB+组(胞质着色,葡萄糖-6-磷酸脱氧酶(G6PDH)活性低)、BCB-组(胞质未着色,G6PDH活性高)和对照组(不使用亮甲酚蓝染色)。卵母细胞体外成熟培养后,对卵母细胞进行核移植操作,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚使用50nmol/LTSA处理,未使用TSA处理的来源于BCB+卵母细胞的核移植胚作为对照组。结果表明,BCB+卵母细胞的直径显著大于BCB-组(P<0.05)。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的初次卵裂时间要早于BCB-组及对照组。来源于BCB+卵母细胞的核移植胚的囊胚形成率显著高于BCB-组及对照组(P<0.05)。且50nmol/LTSA处理可将来源于BCB+卵母细胞的核移植囊胚率提高到(29.6±2.8)%(P<0.05)。总之,来源于BCB+卵母细胞的核移植胚发育能力较强,且50nmol/L的TSA可促进重构胚的体外发育。对卵母细胞进行BCB染色筛选并使用50nmol/L的TSA处理重构胚,可提高东北野猪核移植重构胚的发育能力,为通过体细胞克隆法保护东北野猪资源创造条件。     

牛胚胎的多代克隆

牛胚胎多代克隆的目的是通过重复细胞核移植产生大量的胚胎和牛犊。现已建立了一些重要的方法,例如：采用体外成熟的卵细胞为南受体;第二次减数分裂未期法核的先进技术;采和体外成熟,体外受精和体外培养形成的胚胎以及经冷冻保存的胚胎为核供体;核移植胚体外培养可发育至囊胚期;克隆胚可冷冻长期保存等。迄今已连续克隆６代获得囊胚期胚胎,移入受体母牛产生了第１～３代的克隆牛。从１枚牛胚胎通过３代克隆获４３枚胚胎,通过     

转基因鱼的研究进展

自１９８４年第一例转基因鱼在我国涎生以来,转基因鱼研究取得长足进步。研究表明外源基因河以整合、表达,并能遗传给后代,然而外源基因整合位点难以控制,遗传不稳定等问题仍未解决所幸我国鱼类核移植技术较为成熟,结合细胞基因转移、基因打靶和核移植技术,有望在不久将来获得稳定整合的纯化转基因鱼。     

猪体细胞克隆技术的优化

摘要: 用体细胞核移植方法生产的克隆猪诞生至今已经8年,虽然同胚胎细胞核移植相比,体细胞核移植技术难度大,成功率低（1~2%）,但近年来用体细胞核移植技术克隆猪有了较深入的研究,在体细胞核移植基本机理和关键技术上取得了一定的进展。本文结合本实验室近年来的相关研究工作,综述了用核移植方法生产体细胞克隆猪的技术关键和难点及应用情况,并对提高猪体细胞核移植效率的策略进行了分析。     

动物转基因方法技术研究新进展

动物转基因的关键限制因素是制备效率和精确性。本文介绍了近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法如睾丸转基因法、卵巢转基因法、RNA干扰;提高转基因精确性的定点整合转基因的胚胎干细胞、体细胞和原始生殖细胞基因打靶法;调控外源基因表达的时空表达和可控表达转基因策略。对这些新颖转基因方法的优缺点进行了讨论,并探讨如何利用这些方法进行转基因动物的制备。     

徒手切割法体细胞克隆研究进展

体细胞核移植技术目前主要局限性是需要显微操作仪以及相关设备,并且对技术人员也有较高要求。徒手切割法体细胞克隆(HM C)技术不需要显微操作,且对技术人员要求也不高,是一项手工化的核移植技术,对今后核移植技术的研究以及产业化的发展具有一定的推动作用。     

动物转基因技术研究新进展

动物转基因的关键限制因素是制备效率和基因表达的精确调控.综述了近年发展的提高转基因效率的非定点整合转基因方法,如睾丸转基因法和卵巢转基因法;提高转基因精确性的定点整合转基因的基因打靶法;调控外源基因表达的时空表达和可控表达转基因策略;通过转基因对特定基因的进行表达时空和可逆的RNA干扰灵活精细调控.对这些新的转基因方法的优缺点进行了讨论,并探讨如何利用这些方法进行转基因动物的制备.     

快中子辐照对花生胚小叶体细胞胚胎发生的影响

以花生品种鲁花11号成熟干种子为试材,经快中子0、9.7、14.0和18.0Gy辐照后,取胚小叶外植体接种于添加10.0mg/L 2,4-D的MSB5诱导培养基上诱导体细胞胚胎发生。培养4周后,将其转移到添加4.0mg/L BAP的培养基上进行培养。结果表明,快中子辐照处理对胚小叶组织培养及体细胞胚胎发生有很大影响。未...     

体细胞核移植技术在猪基因修饰中的应用

基因修饰猪作为一种理想的动物模型已应用于生物医学研究。构建基因修饰猪的方法很多,包括原核注射、慢病毒转染、精子介导和体细胞核移植等,其中体细胞核移植具有显著优势,一直是构建基因修饰猪的重要方法。近几年,随着转座子、设计核酸酶等基因修饰新技术以及诱导性多能干细胞研究的不断进展,将进一步凸显体细胞核移植技术在基因修饰猪构建中的价值。本文比较了猪基因修饰的主要方法,并论述体细胞核移植技术在猪基因修饰中的优势、发展历程和最新应用等。     

平阳霉素对花生体细胞胚胎发生的影响

本文对花生离体培养高频率体细胞胚(体胚)诱导方法,及平阳霉素(PYM)对体胚发生的抑制作用进行了研究,旨在为以PYM作为化学诱变剂进行花生离体诱变提供有效方法.以花生品种花育20号和花育22号成熟种子的胚小叶为外植体,在添加不同浓度2,4-D(0,5,10,15,20mg/L)的MSB5(MS无机盐+B5有机成分)培养...     

哺乳动物卵子发生、激活与发育

近年来，应用于研究哺乳动物卵子和胚胎新的实验方法已有重大发展，为深入研究哺乳动物胚胎学提供了前所未有的重要手段。这些技术已用于原核和核的移植以至导入克隆基因，改变卵和胚台的遗传结构，用于实验重组着床前胚胎研究发育问题。近期的重大进展有如：用体细胞克隆的绵羊，父源和母源基因组在个体发育中的作用和第一与第二极体发育的全能性等，对这些过程的深入了解将为应用于家畜和人类提供发展遗传和生殖潜力的基础，本研究将论述哺乳动物卵子发生和胚胎发生的最新研究进展，包括：减数分列的启动。MⅡ期卵母细胞的激活，孤雌胚、雌核胚、雄核胚和重组胚的发育以及第一与第二极体染色体的遗传和生殖潜力。