猪Resistin基因真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用PCR技术从含有猪resistin基因cDNA的质粒RSTN-T中扩增目的基因片段，将其克隆至pcDNA3.1(+)表达载体中，经酶切及测序鉴定后，采用LipofectaminTM 2000 转染Hela细胞，用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。以RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、Western blot分析其表达情况。测序结果表明成功构建了真核表达载体pcDNA3.1－RSTN，经G418筛选获得了Hela细胞克隆。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、western blot技术检测到了RSTN在Hela细胞中的转录与表达。重组质粒pcDNA3.1－RSTN的成功构建和表达为进一步研究猪resistin 的DNA疫苗奠定了基础。     

番茄果实中NEVER—RIPE基因的克隆及其反义表达载体的构建

从粉红期番茄果实中提取总RNA，根据Genebank中NEVER－RIPE（即NR基因）cDNA序列，设计合成特异性引物，用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）进行cDNA扩增，获得一个715bp左右的扩增产物，克隆于pGEM-T easy载体，测序确定其正确性。将该扩增产物反向克隆到植物表达载体pBI121中，通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。将重组表达质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。     

Overlap-PCR克隆秦川牛HCRTR1基因及其在大肠杆菌中的表达分析

通过Overlap-PCR方法克隆了秦川牛的HCRTR1基因编码区全长,获得1278 bp编码区全长序列,将其克隆至pMD-18T载体上,经测序表明获得的cDNA序列与GenBank公布的序列同源性均为98%。提取阳性克隆的质粒经BamHI和HindⅢ双酶切后,回收到1278 bp的目的片段,定向克隆到pET32a（+）表达载体上,连接产物转化Bl21(DE3)感受态大肠杆菌,对长出的菌落进行菌落PCR和质粒酶切鉴定正确后,用IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE表明秦川牛HCRTR1基因在大肠杆菌中不表达,生物信息学分析表明,HCRTR1基因的表达产物为具有7个跨膜螺旋的G蛋白偶联受体,可能是此类蛋白在原核系统的表达将会影响细菌本身存活,因此原核表达系统也成为研究此类蛋白的瓶颈。     

小反刍兽疫病毒N基因在大肠杆菌中的表达及鉴定

参照GenBank中小反刍兽疫病毒((Peste des petits ruminants virus,PPRV)N基因序列（Nigeria/75/1）(1 578 bp)设计了1对添加EcoRⅠ和Not Ⅰ酶切位点的引物,对从奥地利引进的pCI-neo-PPRN质粒进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,并转化大肠杆菌Escherichia. coli TOP10感受态细胞,获得重组质粒pGM-T-PPRN。将重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的产物插入原核表达载体pET-32a（+）,构建原核表达质粒pET-PPRN,将其转化进BL21(DE3)感受态细胞中后用IPTG诱导表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析,结果表明小反刍兽疫病毒N基因在BL21(DE3) 成功表达。所表达融合蛋白的相对分子质量约为80 kD,并能被组氨酸单抗、PPRV标准阳性羊血清及PPRV疫苗免疫羊血清所识别。     

TES基因C端的分段克隆与表达

为了在大肠杆菌中分段表达人类TES基因C端3个顺次排列的LIM结构域,利用PCR技术从含有TES基因全长编码序列的质粒pCMV-HA-TES中扩增出这3个LIM domain基因片段,分别重组入pGEM-T载体,再经酶切后,将获得的目的片段亚克隆入原核表达载体pQE-N1进行融合表达。酶切鉴定及测序结果表明,扩增产物与已知基因序列一致,成功构建了3个目的片段的pQE-N1表达质粒;SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导表达出与预期分子质量大小相同的3个融合蛋白。     

绿脓杆菌ATCC27853菌株外毒素A全长编码基因的克隆及其在 HEK 293T细胞中的表达

采用PCR方法从绿脓杆菌ATCC27853菌株基因组扩增其外毒素A（PEA）全长编码基因,并将PEA基因插入到pcDNA3.1A真核表达载体中,构建成pcDNA3.1/ PEA质粒表达载体。经磷酸钙介导将重组质粒转染 HEK293T 细胞进行表达。结果表明本文克隆的PEA基因与标准菌株PA103碱基序列基本相似,同源性达99%。表达产物经蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测,表明本文构建的含有原基因信号肽的PEA基因能够在真核细胞进行分泌性表达,这为基于PEA的免疫毒素、疫苗佐剂和疫苗载体的研究奠定了基础。     

猪TNNC2基因的克隆及其融合蛋白在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上猪TNNC2（Fast skeletal muscle troponin C2）基因序列（GenBank accession No. DQ629177）设计一对引物,采用RT-PCR方法克隆得到617 bp TNNC2 cDNA片段（GenBank accession No. EF673726）,包括完整的开放阅读框（ORF）,与GenBank上公布的猪TNNC2基因（GenBank accession No. AY575058）的ORF核苷酸序列同源性达99 %,并发现开放阅读框内的5个点突变,319位点T→C,320 位点G→A,321位点C→T,导致氨基酸107位Ala（丙氨酸）→Met（蛋氨酸）,322位点A→G为同义突变,433位点A→T,导致氨基酸144位Glu（谷氨酸）→Asp（天冬氨酸）。根据已获得的TNNC2基因开放阅读框序列,重新设计引物扩增得到包含BamH I和EcoR I酶切位点的完整阅读框,将其首先克隆到pMD18-T载体中,经菌液PCR筛选和酶切鉴定后,用BamH I和EcoR I将目的片段切下,再克隆到原核表达载体pRSET A中构建重组表达质粒pRSET A-TNNC2。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG不同诱导条件诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析证实重组表达质粒pRSET A-TNNC2表达出24 kD左右的融合蛋白,最佳诱导时间为4 h,最佳的IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L,表达产物以可溶性蛋白的形式存在。     

凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的构建及其稳定表达细胞株的建立

利用PCR方法扩增凋亡蛋白融合基因片段，克隆至pMD18-T载体，鉴定和测序正确的凋亡蛋白融合基因亚克隆人带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pECFP-C1的多克隆位点EcoRⅠ和SacⅡ之间，成功地构建带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核重组表达载体pECFP-C1-AFG。将带有报告基因的凋亡蛋白融合基因真核表达载体应用脂质体介导使其转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），于转染48h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的出现，对转染的CHO细胞，应用Trizol法提取RNA，经RT-PCR鉴定，转染细胞在750bp处出现目的条带。收集转染细胞上清，应用间接ELISA及Western blot检测到目的蛋白的表达，说明凋亡蛋白融合基因构建正确。转染凋亡蛋白融合基因重组质粒的细胞，长成单层后传代，经G418（Genetiein）加压筛选（800μg／mL），3周后在荧光显微镜下观察所有细胞均出现绿色荧光，说明已建立了能够稳定表达凋亡蛋白融合基因与报告基因pECFP-C1的细胞株，为进一步研究凋亡蛋白融合蛋白在肿瘤组织中的定位及其诱导肿瘤细胞凋亡打下了基础。     

猪resistin(Retn)基因真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

应用PCR技术从含有猪resistin基因(Retn)cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1( )表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Retn。采用LipofectaminTM2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western blot技术检测,结果表明Retn基因在Hela细胞中得到转录与表达。     

鸡γ-干扰素基因的瞬时表达及其抗病毒活性检测

采用PCR技术从质粒pET-ChIFN-γ中扩增得到IFN-γ基因,将其亚克隆到真核表达载体pCAGGS中。将鉴定正确的克隆命名为pCAGGS-ChIFN-γ,体外转染CEF细胞,24小时后经间接免疫荧光（IFA）和免疫印迹（Western-blot）检测,表达蛋白具有良好的免疫原性。然后利用表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组水疱口炎病毒（VSV*GFP）在CEF细胞上检测表达的ChIFN-γ抗病毒活性（AVA）,经检测其抗病毒活性为2×103AU/mL,并且其活性可被抗鸡IFN-γ的多克隆抗体阻断。结果表明：ChIFN-γ在鸡胚成纤维(CEF)细胞中成功表达,并且表达的ChIFN-γ具有良好的抗病毒活性。     

C3d对减毒沙门氏菌介导的NDV DNA疫苗诱导的特异性体液免疫应答的增强作用

采用PCR技术从重组质粒pVAX1-F扩增出新城疫病毒F48E8株的融合蛋白(F)基因,将其克隆入含有3 拷贝C3d 编码基因的pTR-C3d3质粒中,获得重组质粒pTR-F-C3d3。将F-C3d3基因片段从pTR-F-C3d3中切出,克隆入真核表达质粒pVAX1中,获得重组真核表达质粒pVAX1-F-C3d3。将pVAX1-F-C3d3转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,构建成功携带DNA疫苗的重组沙门氏菌SL7207(pVAX1-F-C3d3)。重组菌分别以1×109 CFU的剂量两次口服免疫1日龄SPF鸡,结果显示,SL7207(pVAX1-F-C3d3)激发产生的血清抗体效价与SL7207 (pVAX1-F)免疫组之间存在显著性差异(P < 0.05)。SL7207(pVAX1-F-C3d3)免疫组的小肠黏膜抗体效价高于SL7207(pVAX1-F)免疫组,但两者间差异不显著(P > 0.05)。提示C3d可增强减毒沙门氏菌介导的NDV DNA疫苗诱导的特异性体液免疫应答水平,这为提高基于减毒沙门氏菌的NDV基因工程疫苗的免疫效果提供了新的途径。     

天祝白牦牛SRY基因克隆与原核表达

从天祝白牦牛的基因组DNA中扩增了SRY（Sex-determining Region on the Y Chromosome，SRY）基因编码区序列，将其克隆至pGEM-T easy载体并送至生物公司测序，天祝白牦牛SRY基因编码区长687 bp，编码229个氨基酸；对牦牛和奶牛的SRY基因编码区进行序列比对，发现存在2个碱基的变异，造成1个氨基酸的变异；将牦牛SRY基因编码区连接至pET-28a(+)载体，成功构建了表达载体pET-28a/SRY；把表达载体pET-28a/SRY转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中，在合适的条件下诱导该大肠杆菌，SRY蛋白得到了大量表达；对表达产物进行了Western-blot检测，进一步确定牦牛SRY蛋白得到表达。     

猪H1foo基因的克隆与真核表达载体的构建

卵特异性连接组蛋白(oocyte-specific linker histone H1,H1foo)是在哺乳动物卵母细胞与早期胚胎内特异表达的连接组蛋白,它在卵母细胞生长成熟、受精及胚胎发育中起关键性作用.本研究旨在克隆猪H1foo基因,并构建其真核表达载体.首先利用5'RACE和RT-PCR的方法获得猪H1foo基因的CDS区,并提交GenBank,登录号为HQ915640;然后将H1foo基因的CDS区连接到载体pMD19-T上,经酶切后定向克隆到表达载体pVenus上,从而构建pVenus-H1foo真核表达载体;用脂质体2000介导重组质粒pVenus-H1foo转染Hela细胞,荧光显微镜下观察、RT-PCR检测,确定重组质粒在Hela细胞内的表达和定位;最后通过体外转录试剂盒将H1foo-venus体外转录为mRNA,并显微注射至猪卵母细胞,荧光显微镜观察其表达和定位.序列分析表明猪Hlfoo基因CDS区全长1 041bp,编码346个氨基酸,蛋白分子量为36.45kD,在核苷酸水平上与牛、人和小鼠H1foo基因的相似度分别为75.7％、67.9％和54.3％;真核表达载体pVenus-H1foo转染后,能在He(l)a细胞中表达并可以准确的定位在细胞核;体外转录的H1foo-venusmRNA显微注射猪卵后其融合蛋白也能准确定位于细胞核.本研究克隆了猪H1foo基因并成功构建其真核表达载体;体外转录的H1foo-venusmRNA能在猪卵中正确表达和定位,为进一步研究H1foo在猪卵母细胞成熟以及核移植过程中的作用提供了基础资料.     

真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA的构建及其在猪成纤维细胞的表达

α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。