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1.
王群 《农业生物技术学报》2007,15(5)
应用PCR技术从含有猪resistin基因cDNA的质粒RSTN-T中扩增目的基因片段,将其克隆至pcDNA3.1(+)表达载体中,经酶切及测序鉴定后,采用LipofectaminTM 2000 转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。以RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、Western blot分析其表达情况。测序结果表明成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-RSTN,经G418筛选获得了Hela细胞克隆。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE、western blot技术检测到了RSTN在Hela细胞中的转录与表达。重组质粒pcDNA3.1-RSTN的成功构建和表达为进一步研究猪resistin 的DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
2.
应用PCR技术从含有猪resistin基因(Retn)cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1( )表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA3.1-Retn。采用LipofectaminTM2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。用RT-PCR、Tricine-SDS-PAGE和Western blot技术检测,结果表明Retn基因在Hela细胞中得到转录与表达。 相似文献
3.
蜘蛛丝具有极高的强度和韧度,工业和医学应用价值很高,但由于蜘蛛的不可驯养性使其应用受到限制。因此,本文尝试利用基因工程的方法获得蛛丝蛋白的表达。我们利用巢式PCR技术从大腹圆蛛Araneus ventricosus基因组中克隆了长度为837bp的拖牵丝蛋白基因(ASP),并分别将其构建至原核表达载体pGEX-6p-1和真核表达载体pGFP-N2上,分别命名为pASG和pASN。pASG在大肠杆菌中16℃下24h诱导表达后,经蛋白质印迹证明成功地表达了GST-ASP融合蛋白;pASN转染昆虫sf9细胞48h后观察到了绿色荧光蛋白GFP的表达,表明ASP基因在大肠杆菌和真核细胞中分别得到了正确表达。本研究为利用基因工程的方法开发蛛丝蛋白的生产途径提供了有益的尝试。 相似文献
4.
指导的基因在动物乳腺特异性表达载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
为了实现外源蛋白质在动物乳腺中特异性表达,采用PCR法扩增了BLG 3’端含第6,7外显子及poly(A)加尾信号下游约200bp的0.87kb片断。以山羊BLG 5’的3.2kb(含第1,2外显子)启动子,山羊BLG 3’0.87kb序列,鸡α-珠蛋白基因簇π基因上游的-2.4 ̄-5.3kb HindⅢ序列,绿色荧光蛋白GFP及原核载体pGEM-7zf构建了pGEM-7zf-GFP-MAR-5’ 相似文献
5.
多发性内分泌腺瘤致病因子1 (multiple endocrine neoplasia Ⅰ,MEN1)参与乳腺发育与泌乳行为的调控.本研究克隆了牛(Bos taurus) MEN1基因(bMEN1)的全长cDNA,并在不同细胞中检测bMEN1mRNA及其编码蛋白menin的表达情况.根据GenBank中bMEN1基因序列,设计特异性引物,用qRT-PCR方法得到附带EcoR Ⅰ和HindⅢ酶切位点的bMEN1片段,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-his(A)中.体外转染物种同源性细胞牛乳腺上皮细胞(bovine mammary gland epithelial cell,MAC-T)和异源性细胞中国仓鼠(Cricetulus barabensis)卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)、小鼠(Mus musculus)成肌细胞(mouse myoblast cells,C2C12),利用qRT-PCR和Westem blot技术检测转染前后bMEN1 mRNA和蛋白menin的表达.双酶切和基因测序结果表明,成功构建了bMEN1基因的真核表达载体pcDNA3.1-myc-his-bMEN1.所建立的转染体系可以使目的基因bMEN1在3种不同细胞中成功表达mRNA和目的蛋白,转染后24 h都达到最高表达量,并达到极显著水平(P<0.01),之后逐渐降低.其中,CHO细胞中的转染24 h后bMEN1 mRNA和menin蛋白的表达量分别是对照的28 415倍和5.65倍.本研究建立了bMEN1基因的真核表达载体及其转染体系,能够在不同细胞中成功表达,为体外研究MEN1基因对于乳腺的调节功能及其对于机体代谢的调节机制提供了一种工具和技术体系. 相似文献
6.
MxA是由Ⅰ型干扰素诱导宿主细胞所产生的抗病毒蛋白家族的成员之一。采用RT-PCR方法从鸡胚成纤维细胞(CEF)中扩增MxA,将其克隆至载体pMD-T18中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-MxA,以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE、鸡胚新城疫病毒增殖干扰实验和VSV-CEF微量细胞抑制实验进行分析、鉴定。结果表明,经RT-PCR扩增获得的MxA序列与GenBank报道的序列一致,SDS-PAGE和干扰实验证实重组质粒可以表达出相应分子量为45kD的蛋白,与GST-MxA融合蛋白分子量一致,影像分析系统分析显示表达的融合蛋白约占菌体蛋白的30%。 相似文献
7.
以防御素为研究对象探讨其药用开发价值已是国内外生物医学研究领域的热点之一,鸡β-防御素-1(Gallinacin-1,Gal-1)对许多致病菌都具有杀菌作用,具有很好的研究开发价值。本研究以含有Gal-1成熟肽全长cDNA的重组质粒pMD19-T-Gal-1为模板,通过PCR在Gal-1成熟肽基因C末端引入6×His-tag,并将其克隆到pcDNA3.1(+)载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1-His;经脂质体介导转染Flp-In-293细胞,48h后间接免疫荧光分析,结果重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1-His转染的Flp-In-293细胞中有绿色荧光,而阴性对照中无荧光,表明Gal-1-His在Flp-In-293细胞中得到了表达。本研究结果将为进一步研究Gal-1的功能奠定基础。 相似文献
8.
采用PCR方法从绿脓杆菌ATCC27853菌株基因组扩增其外毒素A(PEA)全长编码基因,并将PEA基因插入到pcDNA3.1A真核表达载体中,构建成pcDNA3.1/ PEA质粒表达载体。经磷酸钙介导将重组质粒转染 HEK293T 细胞进行表达。结果表明本文克隆的PEA基因与标准菌株PA103碱基序列基本相似,同源性达99%。表达产物经蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测,表明本文构建的含有原基因信号肽的PEA基因能够在真核细胞进行分泌性表达,这为基于PEA的免疫毒素、疫苗佐剂和疫苗载体的研究奠定了基础。 相似文献
9.
生长抑素基因疫苗质粒pcS/2SS的构建、表达及免疫* 总被引:14,自引:3,他引:14
为构建高免疫原性的生长抑素(somatostatin,SS)DNA疫苗,将SS基因插入到pcS/SS中乙肝表面抗原(HBsAg)S基因第112-113氨基酸残基密码子之间,构建含2拷贝SS的融合表达质粒pcS/2SS。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pcS/2SS构建成功。脂质体包裹法将pcS/2SS转染HeLa细胞,ELISA检测表达产物的SS免疫反应原性。结果表明,融合目的基因在HeLa细胞获得表达,S/2SS融合蛋白具有比S/SS融合蛋白更强的SS抗原抗体反应性。将pcS/2SS免疫6只大鼠后,2/3的大鼠产生了抗SS抗体,结果证明,所构建的质粒pcS/2SS可以表达生长抑素,表达产物具有免疫原性。 相似文献
10.
通过RT-PCR从浙双758油菜(Brassica napus)种子的总RNA中扩增出黑芥子酶(EC3.2.1.147)MYR J基因,并克隆测序,测序结果在GenBank中的登陆号为EF583560,其翻译的氨基酸序列与黑芥子酶(GenBank中的登陆号为Q00326)仅有一个氨基酸不同,同源性达到99%.克隆载体经Sal I酶解后将MYRI基因片段插入载体pGEX-4T-1中构建成原核表达载体pGEX-4T-1-MYR1,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中.其重组菌株经IPTG诱导表达,在90 kD处有表达量很高的1条带.用0.02 mmol/L IPTG 20℃诱导2 h,得到可溶的GST-MYR1融合蛋白,用10 mg/mL芥子苷作底物,经过检测其比活力为0.003 1 U/mg. 相似文献
11.
pTet-on-Advanced双载体表达系统应用于转基因动物研制,需要建立两种动物品系,经过杂交和筛选,才有可能得到转基因个体,操作繁琐,转化效率低。本研究在改良的四环素(Tet-on)基因可调控系统基础上,通过PCR的方法,分别从pTet-on-Advanced质粒和pEGFP-N1质粒中扩增rtTA和EGFP基因,测序正确后,将rtTA和EGFP基因亚克隆入pTRE-Tight载体中,构建四环素pTRE-Tight-rtTA-EGFP单载体表达系统,然后采用脂质体法,将新构建的单载体表达体系pTRE-Tight-rtTA-EGFP转染猪胎儿成纤维细胞,以不同浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1和1g/L)强力霉素(Dox)诱导,通过荧光显微镜检测EGFP的表达量。结果显示,转染48h后,未加Dox无绿色荧光表达;1g/LDos诱导可以观察到绿色荧光;Dox浓度分别为0.0001、0.001、0.01和0.1g/L未观察到绿色荧光。表明1g/LDox才能激发调控作用。本研究成功构建pTRE-Tight-rtTA-EGFP新型可控性真核表达载体,该载体在细胞中的表达受Dox的调控,能正常发挥作用。研究结果为转基因的定量表达提供了新的技术平台,也为将构建的单载体用于表达可控的转基因动物研究提供了重要科学依据。 相似文献
12.
Krtippel样因子4依脾)在调控细胞增殖、分化和胚胎发育中有重要作用,也是生产诱导多能干细胞(iPSC)重要的转录因子之一。本研究对水牛K牌进行克隆和表达研究,为生产水牛iPSC和研究其在体细胞重编程中的机理奠定基础。采用RT—PCR克隆并分析水牛K牌编码区序YIJ(CDS);mRNA水平和蛋白水平检测K牌在水牛胎儿成纤维细胞(BFF)和胃上皮细胞(BSEC)中的表达情况;构建表达水牛K孵的逆转录病毒载体(pMX—Klf4)、病毒感染BFF、免疫荧光技术分析外源K脾在BFF中的表达情况。结果表明:水牛CDS全长1434bp,氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸序列的相似性分别为99%、97%、92%$N92%,蛋白结构保守;内源Klf4在BFF和BSEC中都有表达,pMX介导的外源K脾能在BFF中表达。 相似文献
13.
microRNA对细胞的增殖和分化有着重要的调节作用,从大白猪(Susscrofa)基因组DNA上扩增microRNA-378-1前体序列,经XhoⅠ酶切后回收相应片段,连接到pEGP-miR载体中,构建重组载体pEGP-miR-378-1,转染猪胎儿成纤维细胞系(PEF),通过荧光观察转染效率及报告基因的表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)测定细胞内microRNA-378-1的表达活性。结果表明,成功地构建了重组载体pEGP-miR-378-1;荧光观察转染后的细胞,显示有较高的转染效率,报告基因有较高的表达效率;QRT-PCR结果显示,实验组和对照组microRNA-378-1表达显著提高,实验组和对照组细胞间差异极显著(P<0.01);为制备转基因动物研究microRNA-378-1功能提供技术平台。 相似文献
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α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。 相似文献
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卵透明带3(zona pellucida 3,ZP3)蛋白是精卵结合最重要的受体。为了构建中华鼢鼠(Myospalax fontanierii)卵透明带3(mZP3)基因真核表达载体,本研究利用PCR方法得到加入酶切位点的mZP3片段,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,体外转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO cell)和尾静脉注射昆明小鼠(Mus musculus)体内,利用RT-PCR和Western bolt技术检测其表达情况。双酶切和基因测序鉴定结果表明,所构建的表达载体是pEGFP-mZP3;倒置显微镜观察到发绿色荧光的成功转染的细胞;RT-PCR和Western bolt检测结果表明,目的基因mZP3在CHO细胞中成功表达,并且小鼠肝脏内也检测到目的基因。研究结果表明,卵透明带3基因能够在CHO真核细胞内表达,为后期基因疫苗防治中华鼢鼠提供依据。 相似文献
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苹果山梨醇脱氢酶(NAD-SDH)基因的克隆及其反义表达载体对农杆菌的转化 总被引:1,自引:0,他引:1
山梨醇是一种糖醇,是蔷薇科植物所特有的,是蔷薇科植物主要的光合产物、运输糖和贮藏物质(B ieleskiand Redg-w ell,1995),在其糖代谢中占有重要地位。另一方面,山梨醇能够提高植物抗环境胁迫的能力(徐迎春等,2001;Brow n etal.,1999)。N A D-山梨醇脱氢酶(N A D-SD H)是山梨醇 相似文献
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睡美人(sleeping beauty,SB)是Tc1/mariner转座子超家族的一员,为探索睡美人转座子与不同的转座酶搭配使用及与同种转座酶不同比例搭配使用时的转座效率,本实验构建了SB真核表达重组载体PT2-SV40-EGFP,通过荧光显微镜和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测进行了猪胎儿成纤维细胞系(PEFs)转染条件优化研究.研究结果表明,不同转座酶与转座子按10∶1混合后细胞转染效率相似,但报告基因表达水平有较大差异,其中SB 100X转座酶与转座子混合后细胞的表达水平最高;转座子PT2-SV40-EGFP质粒和SB 100X转座酶质粒按不同比例混合转染细胞研究表明,细胞转染效率相似,但表达水平存在显著差异,其中1∶1组最高,约是5∶1组和10∶1组的50倍.本实验优化了睡美人转座子的转座条件为制备转基因动物深入研究提供参考. 相似文献