草鱼胞浆谷胱甘肽过氧化物酶cDNA全长的克隆与分析

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases,GPXs,EC1.11.19)是生物体内抗氧化防御系统的重要组成部分。本文从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)克隆到胞浆谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPX1)cDNA全长序列。该序列全长890bp(GenBank accession No.EU828796),包括完全开放阅读框(ORF)576bp、5'非编码区(5'-UTR)17bp和3'-UTR297bp。其ORF编码191个氨基酸残基,包含一个由"UGA"(通常为终止密码子)编码的硒代半胱氨酸(selenocysteine,Sec40)残基,并与另2个残基(Glu75和Trp153)构成酶活性中心。同时,草鱼GPX1cDNA的3'-UTR中具有保守的硒代半胱氨酸插入序列(selenocysteine insertion sequence,SECIS)元件。氨基酸序列相似性比较显示,草鱼GPX1cDNA的推测氨基酸序列(GenBank accession No.ACF39780)与斑马鱼GPX1(GenBank accession No.NP_001007282)的相似性...     

山药PAL基因全长cDNA序列的克隆、表达与分析

为了阐明苯丙氨酸解氨酶(PAL,EC4.3.1.5)基因在山药地下块茎酚类物质积累过程中的分子机理,本研究运用普通PCR、RACE和TAIL-PCR技术从大薯(Dioscorea alataL.)’Zixiao’地下块茎中克隆到同一个PAL基因的3个片段,即长度分别为1 145bp、1 151bp和424bp的中间片段、3’端和5’端的cDNA序列;将3段cDNA序列拼接后获得大小为2 376bp的PAL基因全长cDNA序列,该序列含有一个1986bp的最大开放阅读框(ORF),一个28bp的5’端非翻译区,一个362bp含25 nt的Poly(A+)尾的3’端非翻译区,最大ORF可推测编码一个包括PAL酶活性中心的特征序列(GTITASGDLVPLSYIA)在内的661个氨基酸的多肽,分子量为71.974kDa,等电点6.310;大薯地下块茎的PAL基因分别在核苷酸与氨基酸水平上和GenBank中所选已知其他物种的同源性为73%~77%和76%~82%,说明PAL基因在系统进化上相对保守;RT-PCR分析表明该基因仅在地下块茎中表达,而且表达丰度在收获前逐渐降低。     

绵羊PGRMC1蛋白的cDNA克隆、序列分析及组织表达

孕激素受体膜组分1 (progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1)是膜相关孕激素受体蛋白家族成员之一,参与哺乳动物颗粒细胞和黄体细胞孕酮的抗凋亡过程,在促进卵母细胞成熟和维持卵巢机能方面具有重要作用.本研究通过RT-PCR对绵羊(Ovisaires)PGRMC1基因进行了克隆和组织表达谱分析,并利用实时荧光定量PCR对该基因在繁殖特性上存在明显差异的两个绵羊品种——多浪羊(常年发情)与中国美利奴羊(季节性繁殖)发情期和乏情期性腺轴组织的表达情况进行了检测.结果获得了绵羊PGRMC1基因部分cDNA序列(GenBank登录号:KM114208),其中编码区(Coding sequence,CDS)全长585 bp,编码194个氨基酸.其编码蛋白中包含一个Cyt-b5保守结构域.该基因在所检测绵羊各组织中广泛表达,其中以卵巢、子宫、肝脏、肾脏和下丘脑组织表达丰度较高.实时荧光定量PCR结果显示,同一绵羊品种发情期子宫、卵巢和松果体PGRMC1 mRNA水平均高于乏情期;不同绵羊品种间性腺轴组织基因表达水平存在一定差异,无论是发情期还是乏情期,多浪羊子宫、卵巢和松果体中PGRMC1 mRNA水平均高于同期的中国美利奴羊.本研究结果表明,PGRM C1在维持绵羊子宫与卵巢机能、调节激素分泌和发情行为等方面可能发挥重要作用.为进一步了解PGRMC1的生物学功能提供一定的理论依据.     

猪CD8α全长cDNA克隆与序列分析

应用RT-PCR和RACE技术从猪胸腺细胞总RNA中扩增克隆了猪CD8α的全长cDNA基因。序列分析结果表明，CD8α全长cDNA序列为2179nt（GenBank收录号AY517855）。711nt的开放阅读框编码236个氨基酸残基的猪CD8α前体蛋白（含1个N-糖基化位点）推导氨基酸序列分析显示，存猪CD8α分子的胞外区，7个保守性Cys残基（Cys^46、Cys^57、Cys^118、Cys^167、Cys^216、Cys^218和Cys^182）与猪CD8α分了胞外区免疫球蛋白样结构以及αβ异源二聚体或αα同源二聚体的形成有关。在猪CD8α分子胞浆区，存存与CTL活化信号转导相关的Src家族蛋白酪氨酸激酶p56^kk识别基序CKCP。氨基酸序列比较结果表明，猪与人、牛、鼠、狗和猫CD8α蛋h的氯基酸同源性分别为55．7％、57．6％、35．6％、56．8％和56．4％。     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达

根据GenBank发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅(Anser domeatica)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了部分DNA序列,全长1062bp,包含2个外显子和1个内含子(GenBank Accession No.EU370686)。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3D和5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏和肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾和肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢和间脑中低度表达。     

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达研究

根据Genbank上发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了由2个外显子和1个内含子组成的鹅脂联素基因。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3 Da、5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏、肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾、肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢、间脑中低度表达。本试验结果为进一步研究脂联素的功能及作用机制奠定了基础。     

烟草Ⅰ类几丁质酶,β—1,3—葡聚糖酶cDNA的克隆和序列分析

我们以烟草花叶病毒感染７天后的三生烟为材料，对经过修饰的烟草Ⅰ类几丁质酶和Ⅰ类β－１，３－葡聚糖酶ｃＤＮＡ进行了克隆和序列分析。结果表明，Ｃｈｉ－Ｉ，Ｇｌｕ－－Ⅰ的全长ｃＤＮＡ分别为９９０ｂｐ和１０２０ｂｐ。另外，核苷酸及由此推断的氨基酸序列与文献报道的序列相比较，分别具有Ｃｈｉ－Ⅰ：９９．９％ＧＮＧ ９９．７；Ｇｌｕ－Ⅰ：９９．６％与９９．４％的同源性。     

小白鼠乳铁蛋白基因cDNA克隆及序列分析

乳铁蛋白(LF)是哺乳动物母乳中含量丰富的一种天然铁结合蛋白，广泛分布于具有分泌功能的组织及其分泌物中。许多研究表明，LF可以抵御细菌病毒的侵染并调节机体免疫功能，成为母畜乳腺和仔畜胃肠道的一种防御屏障；能够促进肠道细胞对铁离子的吸收和利用；另外还有关于LF可以抗氧化和促进肠道有益菌群生长的报道。     

桃蔗糖酶基因的克隆和差异表达

以桃（Prunus persica)基因组DNA为模板,通过PCR方法得到含0.75kb的特异性条带,将其克隆到加T尾pBluescrips SK载体上,筛选到重组克隆,用限制性内切酶酶切鉴定至少可分为两组,一组是插入片段无HindⅢ位点,一组是据入片段有HindⅢ位点。对两组pPIN02和pPIN04克隆插入片段两端进行核苷酸序列分析表明,pPIN02和pPIN04插入片段全长744个碱基,编码248个氨基酸,核苷酸和氨基酸同源性分别为70．7％和75．9％。与其它植物蔗糖酶氨基酸序列同源性约为60％－72％。RNA点杂交表明pPIN02和pPIN04在果实都能表达,但表达模式有所不同。     

甘薯多酚氧化酶cDNA的克隆及序列分析

植物多酚氧化酶（olyphenol oxidase,PPO)是一类核编码的铜金属酶，含有2个保守的铜结合区域（CuA和CuB)，N端和C端部分缺乏明显的同源性。根据植物PPO的结构特点，从2个保守的铜结合区域的氨基酸序列设计一对简并引物，扩增了甘薯（Ipomoea batatas L.) PPO保守区之间的cDNA片段，测序表明该片段含595bp，编码195个氨基酸，推导的氨基酸序列包含了植物PPO的2个保守的铜结合区域，与葡萄（Vitis vinifera)，番茄（Lycopersicon esculentum)马铃薯（Solanum tuberosum)和蚕豆（Vicia faba)PPO保守区的同源性分别为71．3％，80．8％，79．8％，70．6％。在此基础上设计引物通过3'RACE和5'RACE的方法获得了甘薯PPO cDNA的3'和5'端的片段。最后根据保守区的cDNA片段，3'RACD片段和5'RACE片段的序列信息进行拼接，推导出甘薯PPO cDNA的全部序列信息。结果表明：甘薯PPO cDNA全长含1984bp，有完整的阅读框，编码588个氨基酸。另外5'非翻译区16bp,3'非翻译区202bp，其中包括1个多聚腺苷酸化信号AATAAA，以及1个含17个腺苷酸的ploy(A)尾。由甘薯PPO cDNA推导的氨基酸邓列由葡萄，番茄，马铃薯和蚕豆PPO cDNA推导的氨基酸序列进行比较，它们之间存在较明显的同源性，同源性分别为49％，48％，47％和49％。     

甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因ace-3全长cDNA的克隆和序列分析

利用RT- PCR结合RACE技术克隆了甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor）乙酰胆碱酯酶基因cDNA,Dd-ace-3,提交GenBank登录号EF583057。该cDNA序列5’端存在反式剪接引导序列SL1,全长2517bp ,包含一个1836bp的开放阅读框;在推导出的611个氨基酸残基的前体蛋白中, N 端的前21个氨基酸残基为信号肽, C-28的位置存在糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点,除此之外的562个氨基酸残基是成熟的乙酰胆碱酯酶序列,其预测的分子量为64396.81D。在一级结构中,形成催化活性中心的3个氨基酸残基 (Ser232 ,Glu360 和His479) ,以及在亚基内形成二硫键的6个半胱氨酸完全保守;在电鳐乙酰胆碱酯酶分子的催化功能域中存在14个保守的芳香族氨基酸残基,其中11个在甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶中完全保守。该酶的氨基酸序列与秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）ACE-3和ACE-4的同源性达56.1%和50.0%。与其它线虫和物种乙酰胆碱酯酶的聚类分析显示,甘薯茎线虫的乙酰胆碱酯酶与Ш型乙酰胆碱酯酶ACE-3同属一个支系。     

鸽子GR基因cDNA克隆与表达分析

糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)是保守的核受体超家族中的一员,属于核转录因子,GR对维持机体稳态起着重要作用,同时在动物繁殖代谢过程中扮演着重要的角色.本研究旨在克隆鸽子(Columba livia domestica) GR基因的cDNA全长并分析其组织表达谱.参照鸡(Gallus gallus domesticus)的GR基因序列设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了鸽子的GR基因的cDNA序列.测序结果表明,鸽子GR基因包含有2313bp的全长CDS序列,102bp的5'UTR序列,以及18 bp的3'UTR序列,共编码770个氨基酸(GenBank登录号:NM001037826.1).通过序列同源性分析发现,鸽子GR氨基酸序列与鸡的同源性为94％,与短吻鳄(Alligator mississippienses)的同源性为85％,与人(Homo sapiens)的同源性为75％.通过与鸡、鳄鱼和人的氨基酸序列比对分析发现,鸽子的GR氨基酸序列中有一个非常保守的DNA结合区(DNA binding domain,DBD)和一个保守性较高的激素识别区(hormone recognition domain, LBD),此外还包括一个GR特异区域.利用qRT-PCR技术发现在鸽子不同组织中均有表达,表达量由高到低依次为睾丸、胰、肺、卵巢、腹部脂肪、肝、心、骨骼肌、肾、脾、输卵管、胃、下丘脑、大脑、肠和嗉囊.睾丸中表达量显著高于其他组织(P＜0.05),其次为胰腺和肺(P＜0.05),在嗉囊中的表达量显著低于其他各组(P＜0.05).本研究获得鸽子GR基因cDNA全长、组织表达规律,为进一步研究鸽子GR基因的功能提供了基础资料.     

黄冠梨几丁质酶基因家族cDNA全长序列克隆与分析

根据已知植物几丁质酶基因序列的保守区域,设计特异性引物,以梨黄冠品种叶片为材料,提取RNA,进行反转录,克隆获得5个几丁质酶基因cDNA片段,进一步通过RACE技术获得该基因的全长cDNA序列,依次命名为PyChi1、 PyChi2、 PyChi3、 PyChi4、 PyChi5,序列提交GenBanK,登录号为：FJ589783、 FJ589784、 FJ589785 、 FJ589786、FJ589787。序列分析结果表明,所获得5个几丁质酶基因,都具有完整的ORF和Poly(A)结构,与其他植物几丁质酶基因具有较高的相似性;5个基因的核酸序列的同源性约在35%~53%之间,PyChi1和PyChi4的氨基酸同源性最高,约85%,而与PyChi5约77%;在几丁质酶基因家族,分别属于Chitinase ClassesⅠ-Ⅴ,为5个不同类型的成员;不同类型的几丁质酶基因在核酸和氨基酸序列以及功能结构方面都存在着存在着显著的差异,主要表现在肽链特性和基因结构等方面。这为进一步研究梨几丁质酶的结构和功能奠定了基础。     

猫白介素-18基因的克隆、序列分析及其表达

用猫白介素18(interleukin,IL-18)基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后猫外周血单核细胞(PBMCf)总RNA进行了RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定。结果该基因全长579bp,编码192个氨基酸(GenBank登录号:DQ100372)。在推导的猫IL-18氨基酸序列中,无信号肽序列和潜在的N-联糖基化位点,但存在4个Cys残基。与不同物种IL-18相比,猫IL-18与犬、羊、牛和猪IL-18核苷酸序列有较高的同源性,分别为89.8%、88.6%、88.4%和88.1%,但与小鼠和鸡IL-18有明显的种属差异。将目的基因片段进一步亚克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子量为27.5kD的重组目的蛋白。经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的13.6%。     

黄瓜生长素受体同源基因的克隆、序列特征及表达模式分析

为了解生长素受体及其信号通路在黄瓜(Cucumis sativus L.)中的调控机制和生物学功能,寻找提高产量的新途径并指导农业生产,我们以拟南芥(Aabidopsis)生长素受体家族AtTIR1/AFBs基因序列为参照进行比对,从黄瓜全基因组数据库中筛选出2条具有很高同源性的基因序列,分别命名为Cs TIR和CsAFB.克隆和测定了这2个基因的cDNA序列,构建了过表达载体,拟在黄瓜中开展反向遗传学研究.基因序列提交至GenBank并得到收录,其中CsTIR的登录号KC414935.1,CsAFB登录号KC414934.1.采用生物信息学方法对CsTIR和CsAFB蛋白的基本理化性质、功能结构域进行初步预测,对其在物种间的保守性进行进化分析,推测它们可能是黄瓜的生长素受体.采用semi-q RT-PCR分析了这两个基因的时空表达模式,发现10d黄瓜幼苗中CsAFB基因的表达量在根和叶中比在茎中高,CsTIR基因在茎中几乎检测不到表达;70d成年黄瓜各组织都有CsTIR和CsAFB表达,无明显组织特异性.本研究为寻找黄瓜生长素受体提供了实验依据,为进一步研究生长素信号通路在黄瓜中的功能及调控机理提供了基础资料.     

马铃薯水通道蛋白基因cDNA克隆、序列分析及表达

以干旱胁迫处理的马铃薯(Solanum tuberosum L.)普通栽培种Gannongshu No.2叶片为材料,提取总RNA,采用RT-PCR方法,扩增出编码288aa序列的水通道蛋白基因StPIP1(Solanum tuberosum L.plasma membrane intrinsic protein gene)cDNA,GenBank登录号为DQ999080。用生物软件对StPIP1分析表明,StPIP1含有6个跨膜区,具有MIP家族的特征信号序列SGXHXNPAVT,还具有质膜水通道蛋白家族的特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN。聚类分析表明和其它14个物种PIP1类水通道蛋白同源性在92%以上,属于质膜水通道蛋白PIP1类。三级结构预测表明和菠菜(Spinacia oleracea)(2B5F)水通道蛋白结构相似,单体由5个短环相连的6个亲水的跨膜螺旋,N-末端、C-末端以及B、D环位于细胞内,A环、C环及E环在细胞外。构建以rd29A启动子和CaMV35S启动子驱动的StPIP1和GFP(绿色荧光蛋白)融合基因表达载体,用基因枪转化洋葱(Allium cepa)表皮进行瞬时表达,结果表明StPIP1表达受干旱胁迫的调节。     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段3全长cDNA的克隆及其序列分析

报道了水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarfvirus,RBSDV）基因组片段3（S3）的全序列。该基因组片段由3572个碱基对组成，其正链RNA的两末端具有与已报道的RBSCV S7－S10基因组片相同的保守序列5′－AAGUUUUU－－AGCNNNNGUC－3′，并在紧邻保守序列处有一片段特异性的8个碱基的反间重复序列。正链RNA只含一个长的开放阅读框，编码一个由1146个氨基酸组成的蛋白，推测其分子量为131.8kD。     

鹅肌球蛋白重链1基因MyHC1全长cDNA克隆、序列及胚胎期表达特征分析

肌球蛋白是组成肌原纤维粗丝的主要成分,在肌肉生长发育和运动收缩过程起重要作用。本研究采用反转录PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification cDNA ends,RACE)方法,从太湖鹅(Anser anser)肌肉中克隆到肌球蛋白重链1基因(myosin heavy chain 1,MyHC1)的全长cDNA,并运用生物信息学的方法对其进行分析,实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)检测MyHC1基因在鹅胚胎期的表达情况。研究结果表明,鹅MyHC1基因(Gen Bank登录号:KM675469)cDNA全长6028 bp,包含5 823 bp的开放性阅读框,57 bp的5’端非编码区和148 bp的3’端非编码区,共编码1 940个氨基酸。经预测,鹅MyHC1基因编码的蛋白质由31 478个原子组成,分子式为C9746H15817N2753O3096S66,相对分子质量为223 kD,等电点为5.62,平均亲水性为-0.786,属于不稳定亲水蛋白。在线预测鹅和鸡(Gallus gallus)的MyHC1蛋白质三维结构呈高度相似,由多螺旋和折叠片聚集成球状头部,并带有长纤维状α-螺旋尾部。鹅MyHC1的编码区(coding sequence,CDS)序列与鸡的同源性最高,为92.86%,与哺乳类同源性多数在84%左右,与两栖类同源性相对较低。鹅与鸡氨基酸同源性最高,为96.45%,与哺乳类的同源性多数在90%左右,与非洲爪蛙(Xenopus laevis)同源性较低,为78.13%。系统进化树分析表明,哺乳动物形成一个大分支,两栖类自成一支,鹅和红原鸡聚成一支,分子进化地位的关系最近,验证了鹅和鸡属于近缘物种。qRT-PCR检测到MyHC1基因在胚胎期第7天开始表达,以后表达量逐渐升高,在15d表达量达到高峰后下降,25d之后逐渐趋于平稳,表明,MyHC1基因在鹅胚胎期mRNA水平的表达量呈先上升再下降的趋势。本研究首次获得了鹅MyHC1的全长cDNA序列、分子的结构特点和表达特征,显示该基因在鹅肌肉生长发育过程起重要作用,为该基因的功能及鹅肉质性状研究提供了基础资料。