磷脂酶Dβ在拟南芥低温信号中的转导作用

磷脂酶D（PLD）不仅是植物中一类主要的磷脂水解酶,而且是一类重要的跨膜信号转导酶类。PLD的磷脂降解功能和信号转导功能均影响植物的抗冻性。本研究以PLDβ基因被敲除的拟南芥突变体及其野生型植株为材料,进行低温驯化和冻害胁迫处理,并分析其作用途径。结果表明,PLDβ基因介导低温信号转导作用,参与渗透调节途径中脯氨酸的调控和抗氧化系统中过氧化氢酶（CAT）活性的调控,并且与低温信号激素ABA不在同一条信号转导途径。本研究为探索通过调控PLD的活性提高植物抗冻性提供了新的途径,并为深入揭示植物的抗冻机理以及磷脂信号转导机制提供实验支持。     

磷脂酶Dα在拟南芥低温驯化过程中的作用途径分析

本研究对低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶仅基因敲除突变体与野生型拟南芥植株进行冻害胁迫处理后,通过观测植株表型和膜离子渗漏率的变化,鉴定两种基因型植株的抗冻性。结果发现,低温驯化后,PLDα敲除突变体的抗冻性明显低于野生型,表明PLDα参与植物的低温驯化过程。对其作用途径进行分析发现,PLDα不参与低温驯化过程中ABA信号转导作用,也没有参与SOD、CAT和POD等3种抗氧化酶活性的调节,但是参与低温驯化过程中膜稳定性调节和渗透调节过程。     

拟南芥中磷脂酶Dγ2的低温信号转导作用途径分析

磷脂酶D(PLD)的磷脂降解功能和信号转导功能均能影响植物的抗冻性。本研究以PLDγ2基因被敲除的拟南芥突变体及其野生型为材料,进行低温驯化和冻害胁迫处理,随后由这两种植株的表型及其离子渗透率等来分析PLDγ2基因对拟南芥抗冻性。结果发现,经直接冻害处理后,PLDγ2敲除型的抗冻性与野生型基本一致;但经过低温驯化后的冻害处理,PLDγ2敲除型的抗冻性弱于野生型,即表明PLDγ2基因参与了低温信号转导作用。进一步的实验结果表明PLDγ2基因介导脯氨酸调控的可溶性物质调控途径和过氧化物酶(POD)活性调控的抗氧化系统途径;但是与低温信号激素ABA不在同一条信号转导途径。     

水稻HTD1基因启动子在转基因拟南芥中的表达特征

通过分析β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase, GUS）基因产物,对水稻HIGH-TILLERING DWARF1(HTD1)基因启动子在转基因拟南芥中的表达特性进行初步研究。用已构建的含HTD1基因启动子和GUS报告基因的植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,观察该启动子的表达特性。结果表明,在HTD1基因启动子的驱动下,GUS报告基因主要在转基因拟南芥幼苗期的叶片、叶柄、下胚轴以及主根基部的维管组织中表达。     

拟南芥snc2-1D通过WRKY70激活受体类蛋白介导的免疫反应

植物在长期的自然进化过程中形成了两种抵御病原菌的策略方法:一种是由植物细胞膜受体感受病原菌相关分子模式激活的免疫反应(PTI),主要的识别受体包括FLS2、EFR和CERK1等;另一种是抗性蛋白特异性识别某些病原菌的效应蛋白激活免疫反应(ETI),这类的抗性蛋白统称为R蛋白。研究表明,植物体内主要存在三类R蛋白,最大的一类是包含核苷酸结合位点     

STMP在拟南芥分枝发育过程中的功能鉴定

拟南芥(Arabidopsis thaliana)中含有脂/固醇结合的相关脂转移蛋白结构域(steroidogenic acute regulatory related lipid transfer,START)的膜相关蛋白(START domain containing-membrane related protein,STMP),STMP是START保守域(第84～295位)功能未知的蛋白质,由440个氨基酸组成、具有跨膜片段、属于磷脂酰胆碱转运蛋白.为明确STMP在拟南芥发育调控过程中的作用,深入了解拟南芥发育调控的分子机理,本研究用35S强启动子启动START结构域,构建START结构域的过表达载体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染花序法把STMP的过表达载体转入野生型拟南芥,获得过表达STMP的转基因拟南芥,并用qRT-PCR技术进行验证;分析转基因拟南芥分枝发育状况,明确STMP在拟南芥分枝调控过程中的作用;用qRT-PCR技术分析STMP的时空表达特性;构建STMP和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的融合蛋白载体,把此载体转入野生型拟南芥中,对转基因拟南芥中GFP进行荧光观察,从而对STMP进行亚细胞定位.本研究获得了过表达STMP的转基因株系;过表达STMP的转基因拟南芥分枝比野生型明显增多,突变体stmp的分枝减少;STMP的时空表达特性分析表明,茎中STMP的表达量最高,STMP定位在细胞质膜和细胞质中.结果表明STMP可以促进拟南芥的分枝发育,本研究对完善拟南芥分枝调控机制具有重要的意义,可以为植物株型的定向设计提供理论依据.     

水杨酸在赭曲霉毒素A诱导的拟南芥毒性中的作用

赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是一种分布广泛的真菌毒素,会对谷物、动物饲料、动物性食品等造成污染。OTA对多种动物具有较强的肾毒性和肝毒性,并有致畸、致突变和致癌作用。对植物的研究表明,OTA还具有植物毒性。本实验研究了植物中重要的内源信号分子水杨酸(Salicyli cacid,SA)在OTA对拟南芥(Arabidopsis thaliana)毒性中的作用。利用高效液相色谱测定了拟南芥叶片在OTA处理下SA含量的变化,结果显示,OTA胁迫促进了SA含量的上升;通过实时荧光定量PCR测定了OTA对SA途径中重要的病程相关蛋白1基因(pathogenesis-related gene1,PR1)相对表达量的影响,结果显示,OTA能诱导PR1的表达,并且这种诱导作用与OTA胁迫时间有关;SA与OTA同时处理拟南芥叶片后,观察到SA能造成OTA引起的叶片坏死斑的加重,相对电导率和活性氧含量的测定结果表明,SA能加重OTA对叶片的伤害,促进OTA诱导的活性氧的上升。本研究表明,SA参与了OTA诱导的拟南芥毒性过程,SA和OTA共同处理能增强OTA的植物毒性。     

LRR-RLKs亚家族基因RLK6在拟南芥开花过程中的作用

为研究LRR-RLKs亚家族基因RLK6(AT2G26730)在拟南芥生长发育过程中的作用,本研究构建了植物过表达载体p Super1300-RLK6,获得5个过表达突变体,其中2个独立株系(OE8,OE9)用于表型分析。通过对野生型(WT)、RLK6基因缺失突变体(rlk6-2、rlk6-3和rlk6-6)、过表达株系OE8和OE9生长发育过程的详细观察和分析发现,RLK6基因缺失突变体在整个生长发育过程中的表型与WT差异不明显,而过表达株系OE8和OE9比WT开花早。此外,利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测各基因型植株中开花相关基因的表达情况,结果表明,相对于WT,OE8和OE9中的开花促进基因CO、SOC1和LFY的表达量显著升高,而开花抑制基因FLC的表达量显著下降。研究结果说明RLK6过表达促进了拟南芥的开花,这为后续深入研究RLK6的作用机制奠定了基础。     

小金海棠Fe（II）转运蛋白基因在拟南芥突变体中的功能互补研究

MxIrt1基因是从小金海棠（Malus xiaojinensis Cheng et Jiang）中克隆得到的Fe（II）转运蛋白基因，具有“ZIP基因家族”的保守功能域，推测该基因与苹果中铁的转运吸收有关。本研究构建MxIrt1基因的植物表达载体pCWIrt，通过农杆菌介导转化拟南芥IRT1突变体irt1-1。GUS染色以及Southern杂交检测结果显示，MxIrt1基因已经整合到拟南芥基因组中。在缺铁胁迫条件下，转基因植株提高了突变体irt1-1的耐缺铁能力，表明MxIrt1基因参与了铁的吸收。     

利用拟南芥rd29A启动子驱动AtNHX1基因提高烟草耐盐性

拟南芥液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(AtNHXl)在植物耐盐机制中有重要作用.为了鉴定AtNHX1基因功能和创制耐盐烟草新种质,本研究用农杆菌介导法将rd29A启动子驱动的AtNHX1基因导入烟草(Nicotiana tabacum L.),获得72株卡那霉素抗性再生植株,17株在MS+85.5 mmol/L NaC1培养基上生长良好.对其进行PCR、Southern杂交和Northern杂交检测,证实AtNHX1基因已整合到烟草基因组中,并进行正常转录,且其转录受盐逆境的诱导.在含盐(85.5、171、256和342 mmol/L NaCl)培养基上进行对照植株和转基因植株生长及叶片丙二醛含量的分析,结果显示,转基因株系的生长势和根发生能力明显优于对照,且叶片丙二醛含量显著低于对照,表明rd29A启动子驱动AtNHX1基因的导入和表达可显著提高转基因烟草植株的耐盐性.结果提示rd29A启动子驱动的AtNHX1基因表达单元可在异源植物中正常转录和表达,可用于植物耐盐基因工程育种.     

]拟南芥AtCYP1基因亚细胞定位及生理功能分析

通过农杆菌浸染的转基因技术获得拟南芥转基因株系,亚细胞定位研究发现AtCYP1在细胞膜和细胞核中有明显表达。利用过表达技术,对转基因过表达、共抑制株系进行研究,结果表明,AtCYP1转基因共抑制株系在开花时间和抽苔时间均较野生型晚2~3 d且抽苔前叶片始终多于对照,而过表达株系则相反,说明AtCYP1基因参与了拟南芥开花时间的调控。另外,悬浮细胞培养表明,AtCYP1基因的过量表达提高了细胞的最高相对增长率,共抑制则反之,生长周期也发生了变化,说明AtCYP1基因对拟南芥悬浮细胞的增殖有调控作用。     

高羊茅FaGI基因在拟南芥中异源表达及蛋白互作分析

为探究高羊茅FaGI基因的生物学功能,本研究利用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀探究与FaGI互作的蛋白;通过农杆菌介导法将过表达载体p1300-FaGI遗传转化拟南芥,获得转FaGI基因拟南芥株系,以拟南芥野生型Col-0、过表达FaGI基因株系和gi突变体为材料进行转录组学测序并观察其开花表型。结果表明,利用酵母双杂交方法筛选出与FaGI互作的FaCO蛋白,并通过双分子荧光互补和免疫共沉淀证明了FaGI和FaCO在体内和体外存在互作关系;过表达FaGI基因拟南芥植株的开花时间比野生型Col-0提前约1.24 d;将FaGI-OE、gi与野生型比对,分别筛选出1 963和92个差异表达基因（DEGs）,与野生型植株相比,过表达FaGI基因株系的差异基因富集在与生长发育、光周期途径、激素合成和信号传导、碳代谢等相关生物过程和代谢通路。综上,FaGI影响光周期途径相关基因的表达,在长日照条件下过表达FaGI基因促进了拟南芥开花,同时该基因的功能具有多样性与复杂性,可作为高羊茅调控分子育种的目标基因。本研究结果为揭示FaGI基因的功能及其调控网络奠定了基础。     

同化AMSR2数据提高HYDRUS-1D模型土壤湿度模拟精度

同化遥感监测数据提高土壤剖面湿度模拟精度,对区域农业发展等实践与理论领域具有重要意义。该文结合了集合卡尔曼滤波(ensemble Kalman filter,EnKF)方法与HYDRUS-1D模型,同化降尺度后的AMSR2(advanced microwave scanningradiometer2)微波土壤湿度数据,开展榆社、荫城2个实验站点的土壤剖面湿度模拟。结果表明:在2个实验站点,与直接使用HYDRUS-1D模型相比,同化具有一定误差的AMSR2土壤湿度数据对不同深度土壤湿度的模拟精度提高都发挥了作用,尤其是对于同化前模拟方案S1(4月1日站点实测含水量)与S4(4月1日遥感含水量),由于HYDRUS-1D模拟时输入了较少数量的土壤湿度数据,数据同化效果与土壤湿度模拟精度提高更为显著;同化前后不同深度的土壤湿度精度对比结果表明,同化效果随深度增加而逐渐减弱。     

人工合成抗菌肽D2A21基因的克隆和表达

为了获得高效表达的抗菌肽D2A21,本研究根据抗菌肽D2A21的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱的密码子,设计并人工合成D2A21基因,并将该合成基因克隆至pProEXHTb载体中,构建成含有含6个组氨酸标签的重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌中,经摇瓶发酵,IPTG诱导后,发酵液用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果表明,成功合成D2A21基因,并构建了抗菌肽D2A21表达载体。通过镍柱亲和层析纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,抗菌肽D2A21能够在大肠杆菌中稳定表达。本研究将为大规模表达纯化D2A21及其进一步的研究和利用提供一定基础。     

燕麦AsKUP1的克隆与功能分析

植物钾离子转运蛋白中的Na~+不敏感性KUP/HAK/KT转运蛋白对植物耐盐胁迫起着重要作用。为了阐明钾离子转运蛋白基因AsKUP1在燕麦中响应盐胁迫的表达模式和鉴定其生物学功能,从燕麦中克隆了AsKUP1,利用RACE方法获得AsKUP1全长序列,并对其进行生物信息学分析;构建了pCAMBIA1301-AsKUP1植物过表达载体,转化拟南芥,并运用实时荧光定量PCR方法分析AsKUP1在拟南芥中的表达情况。结果表明,AsKUP1全长2 951bp,包含2 334bp的ORF序列,预测编码777个氨基酸,等电点为8.55,分子量为87.0k D。序列分析表明,AsKUP1与山羊草和小麦KUP/HAK/KT家族亲缘关系较近,预测该蛋白有14个疏水跨膜结构域,位于细胞质膜的概率较大。此外,盐胁迫下,T2转基因种子萌发率为57%,野生型为43%;经潮霉素筛选分离比为3∶1的2个转基因株系后代T3转基因株系根长分别是野生型的1.46倍和1.34倍,T3转基因植株鲜重、干重分别是野生型的1.56倍和1.44倍,Na~+含量无显著差异,而K~+含量为野生型的1.25倍,说明AsKUP1的表达提高了拟南芥植株的耐盐性。本研究结果为揭示钾离子转运蛋白家族基因AsKUP1在植物中的耐盐机制和通过转基因技术提高植物耐盐能力奠定了基础。     

黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管(LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)表达的影响

为探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管细胞(pig kidney proximal tubular cells,LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达的影响,将培养的LLC-PK1细胞随机分为7个组,Ⅰ组为37℃空白对照组,Ⅱ组为42℃单纯热应激1 h组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组分别为用不同浓度黄芩苷(0.01、0.1、1、10和100μg/m L)处理组后42℃热应激1 h组,运用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达,流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI双染法)检测细胞凋亡率。结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组能显著诱导LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达(P0.05),极显著诱导细胞Bax m RNA和蛋白的表达(P0.01),能极显著降低细胞Bcl-2和Bax m RNA和蛋白的比值(P0.01),极显著增加细胞凋亡率(P0.01),但对细胞Bcl-2蛋白的表达无显著影响(P0.05)。黄芩苷处理组与Ⅱ组相比,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达量均升高,其中Ⅴ组差异极显著(P0.01),Ⅳ及Ⅵ组差异显著(P0.05),Ⅲ及Ⅶ组差异不显著(P0.05),而细胞Bcl-2蛋白的表达量与Ⅱ组相比均差异不显著(P0.05);同样与Ⅱ组相比,黄芩苷处理的各组细胞Bax m RNA及蛋白的表达量均降低,其中Ⅴ及Ⅵ组差异极显著(P0.01),其余各组差异显著(P0.05);除Ⅲ组外,其他各组细胞Bcl-2和Bax m RNA及蛋白的比值与Ⅱ组相比均显著升高(P0.05),其中Ⅴ组细胞Bcl-2和Bax蛋白的比值差异极显著(P0.01);细胞凋亡率仅有Ⅲ组与Ⅱ组相比差异不显著(P0.05),而Ⅴ及Ⅵ组细胞凋亡率极显著低于Ⅱ组(P0.01),其余的Ⅳ和Ⅶ组显著低于Ⅱ组(P0.05)。一定浓度范围内的黄芩苷(0.1~100μg/m L)可能通过下调热应激条件下LLC-PK1细胞Bax的表达,从而提高Bcl-2和Bax的比值,降低细胞的凋亡率,对细胞起到保护作用。本研究从分子水平研究黄芩苷缓解热应激对猪LLC-PK1细胞的损害作用,可为明确其解热机制提供理论基础,并为其在临床上的应用提供有价值的参考资料。     

口服急性毒性试验中Cry1C蛋白对鼠肠道菌群的影响

利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析不同ICR(institute of cancer researcch)小鼠在口服急性毒性试验中摄入Cry1C蛋白前后其肠道菌群的变化,进而对该抗虫蛋白的食用安全性进行较为深入的研究.DGGE图谱经UPGAMA聚类分析显示:小鼠间菌群结构存在较明显的个体差异;实验期间,对照组小鼠灌胃前后其菌群基本保持稳定;实验组小鼠试验前后肠道菌群变化差异较对照组明显.随着灌胃的停止其变化差异在经历过高峰后会随着停喂时间的延长而减小,且菌相有逐渐恢复灌胃前结构的趋势.从肠道菌相的角度分析可知:该抗虫Cry1C蛋白对小鼠是基本安全的.     

不结球白菜BrABF1基因的克隆与功能分析

为研究BrABF1基因在不结球白菜中的表达模式并探索其在开花调控中的作用,本研究以不结球白菜苏州青品种为试验材料,通过同源克隆获得BrABF1基因序列,对其氨基酸序列进行比对和进化分析,利用亚细胞定位技术研究BrABF1的空间表达,采用β-D-葡糖醛酸酶(GUS)染色方法研究BrABF1在植物中的表达模式,利用PlantCARE在线软件预测BrABF1基因的启动子的顺式作用元件。构建植物表达载体pEarlyGate101-BrABF1-YFP转化拟南芥,统计野生型和转基因拟南芥植株的开花时间。结果表明,BrABF1基因含有1 104 bp开放阅读框(ORF),编码367个氨基酸。BrABF1与甘蓝型油菜和野甘蓝(原变种)同源性最高,进化关系最近。BrABF1定位在细胞核上。BrABF1启动子驱动的GUS蛋白主要在拟南芥的叶脉中特异性表达。BrABF1启动子序列包含大量的顺式作用元件,如光响应元件、植物激素响应元件、低温响应元件和逆境胁迫响应元件等。转基因拟南芥植株开花时间晚于野生型,表明BrABF1基因能抑制植物的开花。本研究结果为提高不结球白菜商品价值提供了理论基础。