猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎弱毒二联疫苗研究

用猪流行性腹泻（PED）弱毒疫苗株PEDV－G1P83和猪传染性胃肠炎（GE）弱毒疫苗株TGEV－AG1制成PED和TGE弱毒二联疫苗,并进行了保存期试验、安全效力、免疫期试验和区域试验。结果表明,试验疫苗在－20℃保存4个月,经4月保存的疫苗免疫效力未见下降。4℃保存48h对疫苗病毒的毒价没有明显影响。用该毒二联疫苗按程序免疫妊娠母猪,对妊娠母猪安全,其仔猪获得了良好的被动免疫。其对PEDV强毒、TGEV强毒和该二种强毒混合功击的免疫效力分别达90．48％、93．75％和87．5％。用二联弱毒疫苗免疫8－10日龄的哺乳仔猪证明安全,28日龄时（25日龄断奶）分别用PEDV、TGEV和两种强毒混合攻毒免疫效力分别为100％、90．9％和100％。8－10日龄免疫仔猪生长到4月龄时用TGEV和PEDV强毒攻击,免疫效力分别为100％和73．3％。结果表明,该弱毒二联疫苗能够安全地对妊娠母猪和哺乳仔猪进行免疫,免疫后能有效地保护初生仔猪、断奶猪和肥育猪抵抗TGEV和PEDV强毒的攻击。该弱毒二联疫苗在区域试验中能显著降低猪病毒性腹泻的发病率和死亡率。取得良好的效果。     

猪流感(H3N2亚型)油乳剂灭活疫苗的免疫及攻毒试验

用不同剂量的猪流感H3N2亚型油乳剂灭活疫苗免疫15头断奶仔猪,每组5头,四周后二免。另外3头为非免疫攻毒对照组。首免后第10周用同源病毒攻毒,分别在免疫前及免疫后2、3、4、6、8、10、11周采血,分离血清,用HI试验检测其抗体滴度。攻毒后通过免疫猪和非免疫攻毒对照猪临床、病理变化及病毒分离等方面的比较,评价疫苗的保护效果。结果中、高剂量组的抗体滴度明显高于低剂量组;免疫组和对照组攻毒前后体温无显著差异(P>0.05),免疫组病理保护明显好于非免疫攻毒对照组;鼻液和肺中的病毒分离率比较,免疫组明显低于非免疫攻毒对照组。本研究表明,用该疫苗免疫后猪对同亚型的病毒攻击有一定的保护作用。     

猪带绦虫六钩蚴45W-4B重组蛋白的免疫原性研究

目的观察猪带绦虫六钩蚴45W-4B抗原对仔猪的免疫保护作用。方法用IPTG诱导表达融合蛋白GST-45W-4B。用GST柱进行纯化，以Montanide ISA 206为佐剂制成疫苗免疫仔猪。间接ELISA检测仔猪血清抗45W-4B IgG抗体水平，MTT法进行外周血淋巴细胞殖试验。免疫1个月后全部实验组经口攻击感染25000彬头猪带绦虫虫卵，攻虫3个月后剖检，计算减虫率及保护率。结果免疫组注射疫苗的第2周起，抗体为阳性，45W-4B组持续升高至第8周，淋巴细胞增殖明显高于未免疫感染组。用该抗原制备的疫苗获得了95％的减虫率和33％的保护率。结论该抗原对猪囊尾蚴病具有很好的免疫保护作用。     

猪细小病毒病的研究：Ⅰ.河南省部分猪场母猪繁殖障碍的流行病学…

对河南省８个地市１０个种猪场的３０００头种母猪进行了繁殖障碍的流行病学和临床调查。结果表明，在头产母猪中，用猪细小病毒疫苗过者其死胎（仔）数占产数仔总数的７．２％未用猪细小病毒疫苗免疫其死胎（仔）占产仔总数的８．４％，明显高于免疫猪（Ｐ＜０．０５）证明河南部分猪场中可能流行有猪细小病毒，调查结果还表明，造成母猪繁殖障碍的原因很复杂，除细小病毒外，可能还存在有猪瘟、乙型脑炎等，血清学诊断正在进行中，     

猪细小病毒病的研究Ⅰ．河南省部分猪场母猪繁殖障碍的流行病学调查

对河南省８个地市１０个种猪场的３０００头种母猪进行了繁殖障碍的流行病学和临床调查。结果表明，在头产母猪中，用猪细小病毒疫苗免疫过者其死胎（仔）数占产仔总数的７．２％；未用猪细小病毒疫苗免疫者其死胎（仔）占产仔总数的８．４％，明显高于免疫猪（Ｐ＜０．０５），证明河南部分猪场中可能流行有猪细小病毒。调查结果还表明，造成母猪繁殖障碍的原因很复杂，除细小病毒外，可能还存在有猪瘟、乙型脑炎等，血清学诊断正在进行中。繁殖障碍有明显的季节性，而品种易感性不明显。     

Dot-PPA-ELISA对猪丹毒的免疫监测及抗体保护效价的测定

用猪瘟、猪肺疫、猪丹毒三联疫苗和猪丹毒1a、2型氢氧化铝吸附甲醛灭活疫苗分别免疫断奶仔猪，采用Dot-PPA-ELISA监测免疫猪血清抗体变化。结果，弱毒疫苗免疫后第7d猪丹毒血清抗体效价开始升高，第2～3周达最高值；灭活疫苗免疫后第3～4周抗体效价达最高值，且灭活疫苗免疫猪的抗体水平明显高于三联疫苗免疫猪。免疫6周后，用C43004(1a型)、C43179(1b型)和C43-12(2型)3株不同血清型的猪丹毒混合强毒同时对不同抗体效价的免疫猪和对照猪进行了皮肤内接种攻毒，并根据其皮肤和体温反应确定1：32为猪能抵抗混合强毒攻击的抗体保护效价。经对44头50～60日龄未免疫的断奶仔猪血清检测，其抗体效价在1：32以下的猪占88．36％，278头免疫猪血清的抗体效价在1：32或以上的猪占92．81％。表明Dot-PPA-ELISA适用于猪群猪丹毒的免疫监测和免疫力测定。     

国产与进口猪伪狂犬病gE基因缺失苗免疫对比试验

为比较国产与进口猪伪狂犬病娅基因缺失疫苗免疫效果,并制定合理的免疫程序,笔者选用国产和进口的猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,用3种不同的免疫程序,对240头母猪和1200头仔猪进行免疫试验。试验期间,定时随机采集免疫猪的血液,用ELISA试剂盒进行抗体检测。结果表明,母猪和仔猪无论免疫国产或进口猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,免疫效果均良好。母猪免疫抗体合格率达100％,仔猪49日龄前免疫抗体合格率达100％,免疫效果差异不显著。但免疫猪群在75日龄后抗体逐渐降低,120日龄后基本消失。为维持猪体免疫力,不给野毒入侵的机会,建议仔猪首免后,在适当时间进行二次加强免疫。     

猪TGEV与PEDV混合感染的诊断及免疫研究

对我省流行的疑似猪病毒性腹泻进行了病原诊断及免疫研究,通过细菌培养、RNA电泳、动物回归、电镜形态观察和免疫荧光抗体检查,确诊该病病原为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)混合感染。混合毒代号为TPV3。用该毒人工感染仔猪发病,能获得坚强免疫力,灭活苗进行主、被动免疫对仔猪有良好免疫效果,口服接种优于后海穴位注射,接苗后14天产生免疫力,免疫4个月以上仍具有坚强免疫力,田间接种仔猪2802头,平均保护率达93.23％,现场紧急预防猪483头,死亡率比未预防猪下降九点三个百分点。     

猪附红细胞体对仔猪猪瘟免疫效果的影响

为探讨猪附红细胞体对仔猪猪瘟免疫效果的影响，本试验利用猪瘟抗体检测ELISA试剂盒，对已注射猪瘟疫苗的69头感染猪附红细胞体的仔猪和31头无猪附红细胞体感染的健康仔猪进行了猪瘟抗体检测．结果表明，感染猪附红细胞体仔猪的猪瘟抗体水平低下，其猪瘟疫苗整体免疫合格率（49．2％）明显低于健康仔猪（93．5％），且显性感染仔猪的免疫合格率（41．6％）明显低于隐性感染仔猪（53．5％）、说明，猪附红细胞体严重干扰了猪瘟疫苗的免疫效果，且干扰程度随着猪附红细胞体感染程度的加深而更为明显。     

防制猪痢疾的新疫苗

通过两批试验猪检测的猪痢疾（ＳＤ）原型疫苗可产生抗猪痢疾密螺旋体（Ｔｈ）的高效价循环抗体。试验１在口服攻毒前免疫２次。攻毒后２周内，５／６的未免疫猪发生痢疾，而免疫猪只１／６发病。但攻毒后１个月。存活的那头未免疫猪和２头免疫猪却死于痢疾。试验２，将８头免疫３次的猪同感染猪混养后只有２头（２５％）发生严重痢疾，而未免疫猪却有７／８发病。表明ＳＤ原型苗能提供保护，并已实用于澳大利亚的猪痢疾防制? ?     

猪流行性腹泻病毒全病毒灭活疫苗量效关系研究

本研究旨在探索猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)灭活疫苗不同抗原含量对仔猪感染的保护作用。测定不同浓缩倍数PEDV感染性病毒粒子数和病毒粒子总数,用不同浓缩倍数抗原分别制备灭活疫苗免疫小鼠,利用ELISA抗体检测方法、中和试验、ELISPOT方法测定体液免疫与细胞免疫产生情况,筛选合适抗原含量疫苗进行仔猪免疫并测定抗体,利用攻毒试验研究浓缩疫苗与保护之间的关系。结果显示,当抗原含量达8×10⁶ pfu·mL^-1以上时,灭活疫苗能有效刺激小鼠产生体液免疫及细胞免疫。以2 mL含8×10⁶ pfu·mL^-1抗原的灭活PEDV疫苗免疫仔猪可抵抗PEDV攻毒引起的腹泻及连续排毒,相较于总病毒粒子数,感染性病毒粒子数与抗体产生呈显著相关(r = 0.998 1),中和效价与仔猪保护呈显著相关性(r=0.974 7)。PEDV灭活疫苗可以提供良好的免疫保护,其中感染性病毒数量是提升抗体水平的关键因子,抗体滴度作为一项体液免疫的指标是判断免疫保护的重要参考。     

高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗与灭活疫苗的免疫效果评估试验

在相同饲养条件下,对35日龄仔猪分别使用高致病性猪蓝耳病弱毒疫苗与灭活疫苗进行免疫接种。在接种当天、接种后28d、58d分别检测高致病性猪蓝耳病免疫抗体水平。结果显示,使用弱毒疫苗免疫的试验猪,其高致病性猪蓝耳病抗体上升速度和抗体水平均优于使用灭活疫苗的试验猪。弱毒疫苗可在接种后21～28d产生免疫力,免疫期为4个月。猪繁殖与呼吸综合征流行地区应该首先考虑使用弱毒疫苗。     

猪伪狂犬病病毒gE基因缺失苗免疫试验

为了掌握猪伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫效果,并制定合理的免疫程序,选用国产和进口的猪伪狂犬病gE基因缺失弱毒疫苗,用4种不同的免疫程序,对250头母猪和1000头仔猪进行了免疫试验。试验期间,按比例定时采集免疫猪的血液,用ELISA试剂盒进行抗体检测,证明猪伪狂犬gE基因缺失疫苗,无论国产苗或进口苗都可以产生良好的免疫效果;无论跟胎免疫、1年2次普免,每隔4个月定时免疫,效果均良好。种猪免疫抗体合格率达100%,仔猪49日龄前抗体合格率达100%,75日龄后抗体逐渐降低,120日龄后基本消失。为了使猪体免疫力更强,不给野毒入侵的机会,建议仔猪在首免后,适当时间进行二次加强免疫。而只给公猪、母猪春秋两季免疫,不给仔猪免疫组,仔猪在35日龄后抗体降为阴性,不能抵抗野毒的侵袭,这种免疫方法不宜推广。     

猪流行性腹泻病毒分离鉴定及其灭活疫苗免疫保护效果研究

为筛选能用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗研发的流行毒株,收集PEDV阳性病料,以Vero细胞进行病毒分离试验,并对分离毒株进行外源病毒检测、病毒培养特性研究、仔猪毒力试验及免疫效力试验等。9份PEDV阳性病料共分离到3株病毒,分别命名为PEDV-SC12、PEDV-JS12、PEDV-JX12。其中PEDV-SC12株存在支原体污染;PEDV-JS12株与PEDV-JX12株均能被PEDV特异性阳性血清中和;PEDV-JS12株能在Vero细胞上增殖并产生细胞病变,但适应细胞45代以后病毒培养效价仍然偏低;PEDV-JX12滴度能维持在106.0 TCID50/mL以上。PEDV-JX12株毒力试验显示,该分离株能够通过人工感染复制出腹泻病例,并能从发病动物体内检测到感染的病毒。免疫攻毒保护试验显示,以PEDV-JX12株制备的灭活疫苗免疫母猪,对所产仔猪攻毒后免疫组6.25%(1/16)发病,对照组100%(8/8)发病。说明PEDV-JX12株能够适应细胞培养,免疫接种母猪能给仔猪提供有效保护,可以用于PEDV流行毒株的疫苗研发。     

猪囊虫病基因工程疫苗的研制及应用

从猪带绦虫六钩蚴cDNA文库中筛选目的基因并进行克隆表达，重组抗原用血清学方法和猪体免疫试验进行鉴定，筛选保护性抗原基因。将具有免疫保护作用的重组抗原纯化，并与免疫刺激复合物佐剂结合，制成猪囊虫病基因工程疫苗。对工程菌的培养发酵、重组抗原的下游纯化及疫苗的配制、疫苗的中间试制进行了研究，确定了一套比较完善的生产工艺。应用昆明小鼠建立了猪囊虫病的实验动物模型，应用该模型进行上述疫苗的免疫预防试验，免疫1次和2次的免疫保护率分别为96．9％和98．4％。本动物的免疫预防试验显示，疫苗安全性好，免疫保护率达92．2％，且免疫组发现的囊虫多数已死亡。在流行区进行了田间和区域试验。免疫猪未有不良反应，囊虫感染率分别由20％降为1．1％和5．4％降为0．21％。用该疫苗对人工感染的囊虫病猪进行免疫治疗，发现在感染早期的治疗效果较好。免疫动物的体液免疫和细胞免疫的检测结果显示，该疫苗刺激机体产生抗体的时间早、持续时间长、效价高；可显著提高淋巴细胞转化率及E－RFC和Ea-RFC细胞、ANAE^ 细胞和粗粒型ANAE^ 细胞、抑制／杀伤性T细胞亚群的数量。以上结果表明，用大肠杆菌表达的重组抗原制备的猪囊虫病基因工程疫苗安全、高效，且成本低廉，可规模化生产，有成为预防猪囊虫病的一种新型生物制剂。     

PRRSV-VR2332减毒活疫苗不影响猪瘟疫苗和猪圆环病毒2型灭活疫苗诱导的抗体产生

本研究拟评估仔猪接种猪繁殖与呼吸综合征减毒活疫苗对猪圆环病毒病疫苗、猪瘟疫苗免疫的干扰情况,并分析不同免疫方式对仔猪生长性能的影响,以期为探究PRRSV减毒活疫苗与PCV2、CSF疫苗的联合免疫提供数据参考。本研究先以100头仔猪为研究对象,将其随机分为A、B、C、D 4组。其中A组仔猪免疫PRRSV减毒活疫苗7 d后免疫PCV2疫苗;B组仔猪同期分点注射PRRSV减毒活疫苗和PCV2疫苗;C组仔猪仅免疫PCV2疫苗;D组仔猪仅免疫PRRSV减毒活疫苗。另外再筛选100头仔猪,随机分为E、F、G、H 4组。E组仔猪于免疫PRRSV减毒活疫苗12 d后免疫CSF疫苗;F组仔猪同期分点注射PRRSV减毒活疫苗和CSF疫苗;G组仔猪仅免疫CSF疫苗;H组仔猪仅免疫PRRSV减毒活疫苗。免疫4周后,测定仔猪血清中相关抗体水平。同时,称量免疫前后各组仔猪的体重,计算不同免疫方案仔猪的平均日增重。结果表明：A~D组中, A组和B组仔猪在免疫4周后均产生了较高水平的PRRSV及PCV2抗体,且A组抗体水平略高于B组。C组仔猪仅产生了PCV2抗体,D组仔猪产生了较高水平的PRRSV抗体。E~H 4组中,E组和F组仔猪均产生了较高水平的PRRSV及CSFV抗体。G组仔猪仅产生了高水平的CSFV抗体,H组仔猪仅产生了高水平的PRRSV抗体。A、B、C、D 4组中B组仔猪的平均日增重最高;而E、F、G、H 4组中E组仔猪的平均日增重显著高于其他3组。PRRSV减毒活疫苗与PCV2疫苗或CSF疫苗同期分点免疫、免疫PRRSV减毒活疫苗一段时间后再免疫PCV2或CSF疫苗均能诱导仔猪产生高水平的抗体;在体液免疫方面,PRRSV减毒活疫苗免疫与否均未对另外二种疫苗表现出明显的干扰作用。在仔猪28日龄时同期分点免疫PRRSV减毒活疫苗与PCV2疫苗,12 d后再免疫CSF疫苗的免疫方案不仅能诱导仔猪产生高水平抗体,还可以使仔猪具备较高的平均日增重。     

一株变异型猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其灭活疫苗的免疫效力试验

本研究旨在分离猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）变异株,通过悬浮培养工艺制备成高效价的PEDV灭活疫苗。2017年从中国多个规模化猪场采集腹泻病死仔猪的小肠及其内容物200份,通过RT-PCR方法进行PEDV检测并测序,筛选一株PEDV变异株,将其在2 L反应器里悬浮培养的Vero细胞上进行病毒分离与传代培养,收获的病毒液鉴定后测定TCID₅₀,经甲醛灭活后加入氢氧化铝胶佐剂配制成PEDV灭活疫苗,对其物理性状、稳定性、黏度、无菌等进行检验,检验合格后免疫妊娠母猪及所产仔猪,对其安全性和免疫效力进行研究。结果显示,200份病料中有86份为PEDV阳性,将筛选的PEDV变异株病料在Vero细胞上传至第5代时出现细胞病变,传至第10代收获病毒液,经鉴定后确定为PEDV变异毒株,并命名为PEDV-GF10株。收获的病毒液浓缩后测得病毒滴度可达1×10^8.0 TCID₅₀/mL。疫苗检验合格后在母猪产前40和25 d时试验组后海穴肌内注射4 mL疫苗,空白组不免疫,结果显示试验组与空白组母猪的生产情况无明显差异,所产3日龄仔猪分别免疫不同剂量后体温无显著差异,表明该疫苗对母猪和仔猪均安全性良好。随机挑选试验组与空白组母猪所产3日龄仔猪各20头,分别口服4 mL PEDV-F10病毒培养物,空白组母猪所产仔猪在攻毒24 h后PEDV发病率为100%,抗体均为阴性;试验组母猪所产仔猪只有10%出现了轻微的腹泻症状,仔猪获得了高达90%保护率,且仔猪被动免疫后抗体能持续至35 d以上。以上结果表明,PEDV-GF10变异株通过悬浮细胞培养后病毒滴度显著提高,研制的PEDV-GF10株灭活疫苗安全有效,能够对中国的PEDV变异株达到有效防控,为国内PED防控提供了理论依据。     

Isolation and Identification of a Variant Porcine Epidemic Diarrhea Virus and the Immune Efficacy of Its Inactivated Vaccine

This study was aimed to isolate a mutant strain of porcine epidemic diarrhea virus and prepare a PEDV inactivated vaccine with high valence by suspension culture process for immunizing against PEDV effectively in China.200 small intestines and theirs contents of diarrhea piglets died of diarrhea,collected from many large-scale pig farms in China,were detected by RT-PCR and sequenced,a mutant strain of porcine epidemic diarrhea virus was selected and put on the suspension-cultured Vero cells in a 2 L reactor for virus isolation and continuous cell culture,the harvested virus suspension,which was identified and determined TCID₅₀,was inactivated by formaldehyde and mixed with aluminum hydroxide gel adjuvant to prepare PEDV inactivated vaccine.After its physical behavior,stability viscosity,sterility test were checked out,the safety and immune efficacy were studied by immunizing the pregnant pigs and theirs piglets.The results were as follows:86 samples were detected positive in 200 samples,cytopathy occurred after the mutant strain samples screened were passaged to 5th generation,the virus suspension was harvested in 10th generation and identified as a mutant strain of PEDV,named PEDV-GF10 strain.The virus titer of harvested virus suspension was measured up to 1×10^8.0 TCID₅₀/mL after concentrated.After the vaccine was checked out,the sows,40 and 25 days before delivery in experimental groups,were injected into Xuehai acupoint with 4 mL vaccine and the pigs in blank group were free of immunifications.The results showed that there were no obvious differences in the production status of the sows in experimental groups and blank group and the temperature of theirs 3-day-old healthy piglets injected different doses of vaccine,and the vaccine was safe to the sows and piglets.Forty 3-day-old piglets producted by pregnant sows in experimental groups and blank group were randomly selected and taken 4 mL 1×10^8.0TCID₅₀/mL F10 virus culture.The PEDV morbidity of piglets in blank group was 100% after injection and the antibodies were negative;10% piglets in blank group had mild diarrhea symptoms,the protection rate was up to 90%,antibody of passive immunity in piglets lasted for more than 35 days.Virus titer of mutant strain of PEDV-GF10 improved a lot by suspension cell culture,the PEDV-GF10 inactivated vaccine was safe,and could effectively prevent and control the variation strain of PEDV in China.     

猪囊虫病基因工程疫苗的研制

从猪带绦虫六钩蚴ｃＤＮＡ文库中筛选目的基因并进行克隆表达,重组抗原用血清学方法和猪体免疫进行鉴定。钭具有免疫保护作用的重组抗原纯化,与免疫刺激复合物疫苗佐剂混合,制备成猪囊虫病基因工程疫苗,免疫仔猪并攻虫。该疫苗安全,无毒副作用,免疫猪减虫率９２．２％,完全保护率５５．５％,且免疫组发现的囊虫多数已死亡。     

抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体制备及其临床应用研究

本研究旨在制备猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒高免卵黄抗体,研究其治疗效果。以猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻二联灭活苗免疫产蛋鸡,琼脂扩散方法检测抗体效价达到1∶64时,收集卵黄,采用氯仿抽提和硫酸铵盐析法纯化卵黄抗体,进行微生物学检测、安全性试验,通过人工感染治疗试验和临床应用,观察其治疗效果。结果人工感染治愈率为100%,临床应用治愈率为88.0%,表明制备的卵黄抗体对猪传染性胃肠炎和流行性腹泻具有显著的治疗效果。