甘露聚糖酶3’序列缺失与酶功能间的关系初探

初步研究了3’端对甘露聚糖酶的功能重要性,即以甘露聚糖酶的二级结构为基础．用PCR扩增的方法获得3’端特异性缺失的甘露聚糖酶DNA片段,连接到载体上,表达并鉴定酶的活性。结果表明,删除390bp依然具有酶活性,3’端的部分序列不是酶具有功能所必需的。     

甘露聚糖酶3′序列缺失与酶功能间的关系初探

初步研究了3′端对甘露聚糖酶的功能重要性,即以甘露聚糖酶的二级结构为基础,用PCR扩增的方法获得3′端特异性缺失的甘露聚糖酶DNA片段,连接到载体上,表达并鉴定酶的活性.结果表明,删除390bp依然具有酶活性,3′端的部分序列不是酶具有功能所必需的.     

草本纤维提取专用复合酶工程菌株的构建

[目的]研究如何构建草本纤维提取工程菌株。[方法]用PCR扩增的方法获得甘露聚糖酶、果胶酶和木聚糖酶DNA片段,连到载体上,获得单质酶表达载体,依次将单质酶载体转入大肠杆菌JM109中,使其共存于同一宿主细胞。[结果]获得了一个果胶酶新基因（EU597234） 得到了能同时产甘露聚糖酶、果胶酶、木聚糖酶3种酶的复合酶工程菌株。[结论]草本纤维生物提取是一个复杂的生物反应过程,构建草本纤维提取菌株既要考虑菌株所产的酶又要考虑菌株本身的生物学特性。     

β-甘露聚糖酶产生菌的分离·鉴定及酶学特性研究

[目的]筛选产β甘露聚糖酶的优良菌株,并对其进行分类鉴定和酶学特性的测定。[方法]运用单因子分析对β甘露聚糖酶的酶学特性进行研究。[结果]筛选到的产β甘露聚糖酶鉴定为枯草芽孢杆菌（Baccillus subtilis）。所产酶的最适反应温度和pH值分别为65℃和5．5。在45—70℃内酶活稳定,65℃保温15min,残留酶活仍有70％左右;在pH值4．5—6．5内酶活相对稳定,pH值5．0条件下保存3h,残留酶活仍有75％以上。低浓度的Co^2＋、Mg^2＋等金属离子对该酶有强烈的激活作用,提高浓度后则对酶活有抑制作用。[结论]该酶具有良好的酶学特性,有应用于大规模生产的潜质。     

β-甘露聚糖酶产生菌的分离·鉴定及酶学特性研究

[目的]筛选产β-甘露聚糖酶的优良菌株,并对其进行分类鉴定和酶学特性的测定。[方法]运用单因子分析对β-甘露聚糖酶的酶学特性进行研究。[结果]筛选到的产β-甘露聚糖酶鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。所产酶的最适反应温度和pH值分别为65℃和5.5。在45~70℃内酶活稳定,65℃保温15 min,残留酶活仍有70%左右;在pH值4.5~6.5内酶活相对稳定,pH值5.0条件下保存3h,残留酶活仍有75%以上。低浓度的Co2+、Mg2+等金属离子对该酶有强烈的激活作用,提高浓度后则对酶活有抑制作用。[结论]该酶具有良好的酶学特性,有应用于大规模生产的潜质。     

1株青霉固体发酵产酸性β-甘露聚糖酶条件优化

[目的]为产酸性β-甘露聚糖酶菌株的开发与应用提供技术依据。[方法]以1株青霉QM-1为出发菌株,通过单因素试验和正交试验对其固体发酵产β-甘露聚糖酶的条件进行优化。[结果]该株青霉产β-甘露聚糖酶的最适培养基配方为:0.5 g魔芋粉,20.0 g麸皮,1.5 g蛋白胨,0.3 gKH2PO4,0.03 gMgSO4.7H2O,初始pH值为5.5,反应pH值为5.8,含水量为60%。该株青霉产-β甘露聚糖酶的最适培养条件为:将在30 g基础培养基放在250 ml三角瓶中,接入菌种在35℃下培养3 d后,最高酶活力可达1 455.63 IU。[结论]当反应pH值为5.2～6.0时,-β甘露聚糖酶能维持较高的活性,这表明该菌所产β-甘露聚糖酶为酸性。     

木聚糖酶-甘露聚糖酶融合酶基因Linker优化及其在猪肾pK15细胞中共表达

【目的】构建木聚糖酶（XynB）与甘露聚糖酶（ManA）的融合酶基因,使其能在哺乳动物表达系统中表达并分泌兼有木聚糖酶和甘露聚糖酶活性的双功能融合酶。【方法】利用基因融合技术（SOE-PCR）,把 11条Linker融合到木聚糖酶（XynB）和甘露聚糖酶（ManA）基因间,构建真核表达载体,经转染猪肾细胞（pK15）收集细胞培养液,用DNS法测定其酶活并进行酶学分析。【结果】经表达分析12条不同Linker构建的融合酶与亲本酶酶活,发现用Linker a3、pS3和具有“自我剪切”能力T2A构建的融合酶在木聚糖酶和甘露聚糖酶活性都显著高于两亲本酶。融合酶XynB-a3-ManA的木聚糖酶和甘露聚糖酶酶活比亲本酶XynB和ManA分别提高了54.06%和104.40%;该融合酶在酸性环境3.0—7.0起作用,对pH3.0~8.0具有一定的耐受力。【结论】首次获得可在哺乳动物系统表达分泌的增强型双功能XynB-ManA融合酶。     

青霉QM-1产酸性β-甘露聚糖酶液体发酵条件研究

[目的]为酸性β-甘露聚糖酶生产菌株的开发与应用提供技术参考。[方法]以单因子试验和正交试验对青霉QM-1（Penicillium sp．）液体发酵产酸性β-甘露聚糖酶条件进行研究。[结果]产酶最适培养基配方：麸皮＋魔芋粉（2：1）10．0g／L,NaNO3 2．0s／L,KH2PO4 1．5g/L,MgSO4·7H2O 0．3g／L,H2O 1000ml。最适培养条件为：起始pH值6．0,装液量为50ml／250ml三角瓶,转速为175r／min,在35℃下培养4d,最高酶活力达86．3IU。该菌所产粗酶液最适反应温度为60℃。[结论]麸皮和硝态氯能有效促进青霉QM—1产酸性β-甘露聚糖酶,且所产的β-甘露聚糖酶有一定的温度耐受性。     

魔芋胶酶解工艺条件的优化

[目的]探讨在中试条件下利用中性β-甘露聚糖酶水解魔芋胶制备低聚甘露糖的工艺条件。[方法]在单因素试验条件下,研究了利用枯草芽孢杆菌所产生的中性β-甘露聚糖酶对魔芋胶进行水解来制备低聚甘露糖的工艺条件。[结果]酶法水解魔芋胶生产低聚甘露糖时,优化的酶解条件为：pH6.0,魔芋胶浓度125g/L,酶量200IU/g魔芋胶,酶解温度50℃,酶解时间3h。[结论]该研究可极大地提高魔芋胶的附加值。     

欧文氏杆菌CXJZ95-198甘露聚糖酶基因N端缺失表达

用PCR的方法从甘露聚糖酶高产菌欧文氏杆菌CXJZ95-198中克隆到甘露聚糖酶基因manA全长以及其N端缺失81、111、141 bp的片段,连接到pET28a载体再转入大肠杆菌BL21（DE3）中,用透明圈法鉴定其酶活性。结果表明,删除了manA N端111 bp的翻译产物依然具有酶活性,删除了N端141 bp的翻译产物无酶活性,manA N端111～141 bp可能具有重要意义。     

β-甘露聚糖酶分子生物学研究进展

β-甘露聚糖酶在食品、饲料、造纸、洗涤等工业领域应用广泛。近几年,基因测序技术飞跃发展,研究人员挖掘到许多新颖的β-甘露聚糖酶基因并对其进行了酶学性质的研究。介绍了各种类型的甘露聚糖及其降解酶,梳理了β-甘露聚糖酶的糖苷水解酶家族分类、来源、结构和催化机理,归纳总结了近几年微生物来源β-甘露聚糖酶的重组表达、酶学性质及分子改造,简述了甘露聚糖酶在食品和饲料等方面的应用,展望了β-甘露聚糖酶的研究热点及方向。     

欧文氏杆菌CXJZ95-198甘露聚糖酶基因N端缺失表达

用PCR的方法从甘露聚糖酶高产菌欧文氏杆菌CXJZ95-198中克隆到甘露聚糖酶基因manA全长以及其N端缺失81、111、141 bp的片段,连接到pET28a载体再转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用透明圈法鉴定其酶活性.结果表明,删除了manA N端111 bp的翻译产物依然具有酶活性,删除了N端141 bp的翻译产物无酶活性,manA N端111～141 be可能具有重要意义.     

β-甘露聚糖酶基因的克隆及原核表达载体的构建

目的:克隆β-甘露聚糖酶基因并构建其原核表达载体。方法:提取地衣芽孢杆菌ATCC 14580基因组,PCR法扩增该菌基因组中的β-甘露聚糖酶基因,与表达载体p ET-28a连接并转化到E.coli BL21中,构建原核表达载体,并对阳性重组菌进行PCR和酶切鉴定。结果:成功克隆β-甘露聚糖酶基因并构建其原核表达载体,β-甘露聚糖酶基因全长1008bp,编码336个氨基酸,蛋白质分子量约为38KDa。SDS-PAGE检测显示重组酶分子量约为38KDa。结论:成功构建β-甘露聚糖酶基因的原核表达载体为基因的重组表达奠定基础。     

异源表达细菌β-甘露聚糖酶研究进展

甘露聚糖酶是一类水解甘露聚糖的关键酶,广泛存在于动植物和微生物中,细菌来源尤为广泛。为了更好地满足工业生产的需求,异源表达细菌来源的甘露聚糖酶基因,以获得性质优良的甘露聚糖酶。本文对甘露聚糖酶的来源和酶学性质进行了概述,归纳了细菌甘露聚糖酶的异源表达在提高酶活、扩大pH作用范围、改善安全性等方面的作用,包括对埃希氏大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及毕赤酵母进行异源表达等。利用微生物资源拓宽甘露聚糖酶的应用领域,使用微生物技术提高产酶量满足工业需求,并为甘露聚糖酶定向进化和改造奠定基础。     

β-甘露聚糖酶基因克隆与在大肠杆菌中表达

为了通过基因工程方法在大肠杆菌中发酵生产β-甘露聚糖酶,采用多重比较几种来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列,获得了该酶的保守结构域,并按此设计简并引物．以能水解魔芋葡甘聚糖的枯草杆菌属野生筛选菌种A33为材料,通过简并引物PCR法从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因核心区段．经过克隆、测序及BLASTN比对分析,证实该DNA区段推导的编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的保守结构域,属于该酶家族中的一员．将该片段构建到大肠杆菌表达载体pRsET-A并转入大肠杆菌表达系统BL21 DE3（pLysS）,经过诱导获得了此酶的高效表达．     

响应面法优化重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件

[目的]对重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件进行优化。[方法]以重组毕赤酵母GS115为研究对象,通过单因素试验确定最佳产酶条件,并采用响应面试验确定3个因素的最佳水平。[结果]最佳产酶条件为:培养温度28℃,培养pH 6.5,摇床转速210 r/min,培养基装液量100 ml。响应面试验确定3个因素即装液量、甲醇添加量和pH最佳值分别为103.18 ml、1.77%和6.69;在此条件下,β-甘露聚糖酶的活力最大值为4 917.5 U/ml。[结论]验证试验证明模型预测值准确、可靠,为重组毕赤酵母菌的合理开发利用提供了依据。     

甘露聚糖酶产生菌F1-5的鉴定

[目的]鉴定1株高产甘露聚糖酶菌株。[方法]以高产甘露聚糖酶的菌株为对象,采用形态观察、生理生化试验及16S rDNA系统发育分析手段对其进行鉴定。[结果]该菌株在牛肉膏蛋白培养基上培养24h后,菌落表面粗糙,不透明白色,革兰氏阳性,杆状,能形成芽孢,表明其属于芽孢杆菌属。对F1-5进行生理生化特征鉴定,结果表明,其为枯草芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌。PCR扩增获取该菌的16S rDNA基因。经BLAST同源序列比对,结果显示,菌株F1-516SrDNA与枯草芽孢杆菌的16S rDNA具有99％的同源性,表明F1-5为枯草芽孢杆菌。[结论]该研究为甘露聚糖酶工业化开发应用奠定了基础。     

产甘露聚糖酶菌株的筛选·鉴定及酶活性的初步研究

[目的]从土壤中分离得到产甘露聚糖酶的菌株。[方法]以魔芋粉为底物,从崐嵛山采集的土壤中,经平板法筛选得到产甘露聚糖酶的优势菌株。将该菌株的一段16S rDNA片段进行序列分析以确定其所属菌种,并对该菌株的发酵条件和酶的性质做初步研究。[结果]该菌株在不同的培养基中产酶量不同,不同温度下的相同培养基中产酶量也不同,在LB培养基中,27℃下培养较30℃利于该菌株产酶,而SOC培养基在30℃下培养较27℃利于该菌株产酶;该菌株所产酶的最适反应pH为7.0,最适反应温度为55℃,之后温度升高酶活力会急剧下降。在最适反应条件下测得酶活力可达95.3 U。[结论]为甘露聚糖降解产物的工业化应用提供了参考。     

产β-甘露聚糖酶菌株的物理和化学诱变育种研究

[目的]比较产β-甘露聚糖菌株的物理和化学诱变育种效果。[方法]以产β-甘露聚糖酶的Bacillus subtilis WD23为出发菌株,利用紫外线诱变和甲基磺酸乙酯诱变的方法提高酶的活性。[结果]紫外线照射时间选为20～30s,诱变后酶活提高了8．72％;1％的甲基磺矗乙酯诱变10min,酶活提高了1．29％。[结论]紫外线诱变效果好于甲基磺酸乙酸,该研究中,物理诱变效果好于化学诱变。     

来源于链霉菌Streptomyces fradiae var.k11的抗蛋白酶甘露聚糖酶的基因克隆与鉴定

通过设计简并引物和TAIL-PCR的方法从Streptomyces fradiae var.k11中克隆得到一个β-1,4-甘露聚糖酶编码基因manS221,其全长1359 bp,编码452个氨基酸,前端28个氨基酸为预测信号肽.构建表达载体pET-28a-manS221并转化大肠杆菌BL21(DE3),特异性表达manS221基因,重组的甘露聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析纯化.酶学性质分析表明,重组甘露聚糖酶最适温度为52℃,最适pH值为6.0,在pH 5.0～9.0的范围内有良好的稳定性,并且对中性蛋白酶具有高抗性.这些优良的性质使得ManS221在食品、饲料和纺织工业生产中具有良好的应用前景.